Name: 동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 배우세요 난소암 전이 연구를 위한 동적 마이크로플루이딕 공배양 플랫폼 구축 방법을. 3D 다세포 회전 타원체와 복막세포 간 상호작용을 정밀 유동 조건에서 분석하여 생체 내 환경을 모사합니다.

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이 작품은 홍콩 연구 보조금위원회에 의해 지원되었다 (보조금 17,122,014, C1013-15G, 719813E 및 17,304,514). AST 웡은 Croucher 수석 연구 활동의받는 사람입니다.

1. 미세 유체 장치 설계 및 제작 <ol><li> 미세 유체 마스터 디자인 <ol><li> 디자인은 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 채널 패턴을 그린다. 주 : 일반적으로, CAD 도면은 포토 마스크를 제조하는 마스크 회사에 전송 될 수있다. 미세 유체 설계는 3 개의 동일한 병렬 채널, 다음과 같은 크기와 각 구성 : 4 mm μm의 250 × mm 25 × (폭 × 높이 × 길이)와 떨어져 2mm를 설정합니다. 두 채널이 종료 된 액체 입구와 출구 (그림 1B)를 용이하게하기 위해 127 ° 각도로 설계되었다. 이 프로토콜에서 사용되는 채널이 이전에 발행 (13)에보고되었다. </li><li> 15 분마다 아세톤, 이소프로판올 초음파 처리 (500 W / 42 KHZ), 탈 이온수로 상기 실리콘 웨이퍼를 세척 하였다. 압축 된 질소 가스는 웨이퍼를 건조. 15 분 완전히 건조에 250 ° C에서 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 가열그것. </li><li> 스핀 코트 1800 rpm의 회전 속도로 실리콘 웨이퍼 상 (125 μm의 두께) SU-8 2075 포토 레지스트 층을 포함한다. 합니다 (SU-8 제품 설명서에 따라), 각각 5 및 25 분 동안, 과량의 용매를 제거하고, 65 ℃로 한 후 95 ℃의 핫 플레이트 상에 직접 레지스트 코팅 된 웨이퍼를 굽는다. </li><li> 3 단계를 반복 스핀 코팅 SU-8 2,075 포토 레지스트의 또 다른 층은 250 ㎛의 최종 두께을 얻었다. 7 분 동안 65 ℃에서 핫 플레이트 상에 직접 레지스트 - 코팅 된 웨이퍼 베이크 한 다음 30 분 동안 95 ° C에서. 천천히 실온까지 웨이퍼를 냉각. 압축 공기로 냉각하지 마십시오. </li><li> 정렬 및 웨이퍼 위에 직접 포토 마스크를 넣어. 패턴 가교 20 초 동안 UV 광에 노출. </li><li> 65 ° C에서 포토 레지스트와 웨이퍼, 5, 12 분 동안 핫 플레이트에 95 ° C 구워 각각합니다 (SU-8 제품 설명서에 따라) 중합 용매를 제거합니다. 그 후, 웨이퍼를 냉각실온. </li><li> 25 분 동안 SU-8 개발자의 웨이퍼를 침지하여 비가 교 포토 레지스트를 제거합니다. 이소프로판올로 웨이퍼를 씻어 압력을 공기로 건조. 참고 : 이소프로판올로 세척 불완전 개발을 표시 할 때 우유 용액이 관찰 된 경우, 긴 개발 시간 SU-8 개발에 다시 웨이퍼를 담가. </li><li> 10 분 잠재적 인 균열 패턴을 치유하는 180 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다. 핫 플레이트를 끄고 천천히 핫 플레이트에 두어 실내 온도로 웨이퍼를 냉각. </li><li> 유리 병 모자 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H-퍼플 루오로 옥틸) 실란을 몇 방울을 추가합니다. 진공 데시 케이 터에서 병 뚜껑을 넣습니다. 10 분 동안 웨이퍼를 silanization합니다하기 위해 병 뚜껑 옆에 웨이퍼를 놓습니다. </li></ol></li><li> PDMS 칩 제조 <ol><li> 홀더를 만들기 위해 알루미늄 호일로 웨이퍼 감싸. </li><li> 1 질량 비율 : 10의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)베이스와 경화제를 혼합혼합 및 탈기 기능에서 원심 믹서. 약 5 mm의 높이로 웨이퍼 상에 천천히 PDMS 액을 붓는다. 40 분 동안 진공 하에서 탈기를 PDMS. 2 시간 동안 65 ° C의 오븐에서 PDMS 큐어. </li><li> 조심 마스터 오프 PDMS 슬래브를 박리하고 유리 슬라이드의 크기까지의 채널을 따라 PDMS 트림. 장치의 입구와 출구를 만들 수있는 1-mm 생검 펀치와 PDMS를 펀치. </li><li> 먼지와 PDMS 파편을 제거하기 위해 압축 공기 및 접착 테이프와 PDMS 표면을 청소합니다. </li><li> 채널 측이 플라즈마 클리너로, 위쪽으로 향하도록 PDMS의 슬래브를 놓습니다. PDMS의 슬래브와 함께 플라즈마 클리너로 청소 유리 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 1 분 동안 높은 RF 레벨에서 공기 플라즈마에서 PDMS와 유리 슬라이드를 취급합니다. 비가 역적 공유 결합을 생성하기 위해 유리 슬라이드에 PDMS를 바인딩합니다. </li><li> 접합 강도를 향상시키기 위해 1 시간 동안 150 ℃에서 핫 플레이트상의 PDMS 칩을 놓고 hydrop를 반환사용하기 전에 PDMS의 hobicity. </li></ol></li></ol> 2. 시드 차 복막 중피 세포와 미세 유체 칩 (HPMCs) <ol><li> 미세 유체 채널의 피브로넥틴 코팅 <ol><li> 75 %의 에탄올을 30 μL와 미세 유체 채널을 소독. 에탄올을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 멸균 인산 완충 생리 식염수 30 μL (PBS)로 두 번 씻어. 철저히 채널에서 PBS를 대기음. 주 : 오염을 최소화하기 위해, 미세 세포 배양 신중 층류 후드의 사용을 통해 완전히 무균 조건 하에서 수행되어야한다. </li><li> MCDB105 (1 : 1) 매체 무 혈청 M199에서 10 μg의 / ML의 피브로넥틴 솔루션을 준비합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 특별한주의를 상하 용액을 피펫. 소용돌이하지 마십시오. </li><li> 천천히 피브로넥틴 용액 30 μL 각 채널을 입력합니다. 테이프로 채널을 밀봉하고 4 ℃에서 하룻밤 칩을 품어. </li></ol></li><li&gt; 미세 유체 채널로 시드의 HPMCs <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 배지에서 배양 HPMCs : 80 % 합류 할 때까지 37 ℃에서 5 % CO 2에서 (M199 MCDB105 10 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된). </li><li> PBS의 3 mL를 HPMCs을 씻어 0.05 % 트립신 2 ㎖ / 30 초 동안 0.01 % EDTA (TE) 솔루션를 Trypsinize. 10 % FBS 배지 4 mL로 중화 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 10 % FBS 배지 2ml를 상기 HPMCs를 재현 탁. 혈구와 세포 수를 계산하고 3.5 × 106 / mL의 세포 농도를 조정합니다. </li><li> 사용하기 전에 5 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 피브로넥틴 코팅 된 미세 유체 칩을 따뜻하게. 완전히 피브로넥틴 용액 대기음. </li><li> 천천히 각 채널에 HPMC 현탁액의 30 μL를 피펫. 테이프로 채널을 밀봉하고 하룻밤 CO 2 배양기에서 장치를 배치합니다. </li></ol></li></ol><ol><li> 난소 암 타원체 형성 <ol><li> 실험 전에 37 ℃에서 5 % CO 2 미만, (5 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 MCDB105 M199) 5 % FBS 배지에 인간 난소 암 세포주 SKOV-3을 유지한다. </li><li> 끓는 소독 물에 0.5 % 아가 로스를 녹여. 96 웰 플레이트의 각 웰에 아가 용액을 50 μL 분주. 아가로 오스가 고형화 할 수 있도록 20 분 동안 후드에있는 접시를 남겨; 우물은 세포 부착을 방지 할 수 있습니다 코팅 응고 아가로 오스는 플레이트를 사용할 준비가되어 있음을 나타냅니다. </li><li> PBS 3 mL로 SKOV-3 세포를 씻어. 3 분 TE 용액 2 mL로를 Trypsinize. 5 % FBS 배지 4 mL로 중화 5 분 동안 1,000 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 혈구와 SKOV-3 세포 수를 계산하고 5000 세포 / ㎖의 밀도로 5 % FBS 배지에서 세포를 재현 탁. TR각각에 세포 현탁액 ansfer 200 μL을 48 시간 동안 37 ℃에서 5 % CO 2하에 웰 배양 아가는 코팅. </li></ol></li><li> 암 회전 타원체로드 <ol><li> 50 mL의 원심 분리 튜브 혈청 배지 1 ㎖의 사전 - 습윤에 암 타원체를 전송하고 5 분 동안 750 XG에서 스핀 다운. 참고 : 피펫 팁을 전 습윤 및 원심 분리기 튜브는 원심 분리기 튜브 상 바람직하지 않은 회전 타원체의 부착을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 무 혈청 M199에 5 chloromethylfluorescein 디 아세테이트 (CMFDA) 솔루션의 2.5 μg의 / mL로 준비 : MCDB105 매체를. CMFDA 용액 1 ㎖에 재현 탁 암 타원체와 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 5 분 동안 750 XG에 원심 분리기. </li><li> 5 분 동안 750 XG에서 무 혈청 배지 원심 2 mL를 암 타원체 린스. 매체에 남아있는 형광 염료를 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다. 주 : 형광 신호보다 96 시간 동안 회전 타원체로 유지 될 수있다. </li><li> 암 재현 탁무 혈청 M199의 회전 타원체 : MCDB105 매체와는 혈구와 회전 타원체 수를 계산합니다. 무 혈청 배지로 000 타원체 / ㎖의 농도를 조정한다. </li><li> 채널 내부에 비 부착 중피 세포를 씻어 MCDB105 배지 : 서서히 로딩 타원체 무 혈청 M199 100 μL를 주입하기 이전. 참고 : 빠른 주사, 흡입, 또는 거품 형성은 중피 단일 층의 분리로 이어질 것입니다. </li><li> 각 채널에 형광 표지 된 회전 타원체 현탁액의 부하 30 μL. 이산화탄소 배양기에 미세 유체 칩을 놓습니다. </li></ol></li><li> 관류 플랫폼 조립 및 공동 문화 <ol><li> 1 M-긴 튜브 MCDB105 매체 : 신선한, 무 혈청 M199로드 주사기를 연결합니다. </li><li> 주사기 펌프의 주사기를 배치하고, 플런저와 주사기 본체를 고정. 배양기 내부의 마이크로 유체 칩과 동일한 높이에서 수평 위치에서 주사기 펌프를 설치한다. 엔OTE는 : 개수 및 주사기의 크기는 사용 채널 수 및 실험 기간에 의존한다. </li><li> 빠르게 눌러 매체가 튜브를 오버 플로우 때까지 빨리 감기 버튼을 길게 매체와 전체 튜브를 주입. </li><li> 원하는 유량의 주입을 실행. 다음 식을 사용하여 벽 전단 응력을 측정 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55337/eq1.jpg" /> τ는 벽 전단 챔버, Ǫ = 유량 내부 응력 μ = 점도 (0.01 g CMS -1)을 나타내고; 시간 = 유량 용기의 높이 및 w = 흐름 챔버의 폭입니다. </li><li> 채널의 입구에 튜브를 연결합니다. 매체가 전 채널에 주입 가온 수 있도록 인큐베이터의 과잉 입구 튜브를 배치합니다. 튜브 및 상기 채널 사이의 연결을 용이하게하기 위해, 적절한 커넥터가 선택 될 수있다. 참고 : syrin 모든 거품을 소개하지 조심GE, 배관 및 연결. </li><li> 짧은 출력 튜브 유출 매체를 수집하기 위해 50 ML 원뿔 튜브에 채널의 출구를 연결합니다. 참고 : 전체 동적 공동 배양 시스템은 그림 1D에 표시됩니다. </li></ol></li></ol> 관류 후 HPMCs 및 암 회전 타원체 4. 관측 <ol><li> 밝은 필드 또는 형광 현미경으로 HPMCs 암 회전 타원체를 관찰하고 관류 1 시간 후 사진을 촬영. </li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21296855">Global cancer statistics.</a> CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).</li>
<li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Kit+mediates+chemoresistance+and+tumor-initiating+capacity+of+ovarian+cancer+cells+through+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin-ATP-binding+cassette+G2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling.</a> Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).</li>
<li>Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+contributes+to+the+acquired+apoptotic+resistance+of+nonadherent+ovarian+cancer+cells+through+a+cross+talk+mediated+by+phosphatidylinositol+3-kinase+and+extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2.</a> Neoplasia. 12, 128-144 (2010).</li>
<li>Ksiazek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion%3A+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li>
<li>Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+Fibrin+Derivatives+and+Fibronectin+in+Ascitic+Fluid+from+Patients+with+Ovarian-Cancer+Compared+to+Ascitic+Fluid+in+Liver-Cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis.</a> Thromb Res. 35, 53-64 (1984).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307, 58-62 (2005).</li>
<li>Chang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+cycle+arrest+induced+by+shear+stress%3A+Roles+of+integrins+and+Smad%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+driving+force+for+change%3A+interstitial+flow+as+a+morphoregulator%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).</li>
<li>Rizvi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+cellular+heterogeneity+and+biomarker+modulation+in+3D+ovarian+cancer+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).</li>
<li>Ip, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+chemoresistance+in+epithelial+ovarian+carcinoma+cells+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress.</a> Sci. Rep. 6, 26788(2016).</li>
<li>Avraham-Chakim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-flow+induced+wall+shear+stress+and+epithelial+ovarian+cancer+peritoneal+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading.</a> PloS one. 8, e60965(2013).</li>
<li>Burkhalter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/26/1_Supplement/656.11">Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer.</a> Faseb Journal. 26, (2012).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+assessment+of+three-dimensional+cell+aggregation+in+rotating+wall+vessel+bioreactors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).</li>
<li>Ismadi, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+characterization+of+a+spinner+flask+for+induced+pluripotent+stem+cell+culture+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application.</a> PloS one. 9, e106493(2014).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one.+9%22%5BJournal%5D)">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PloS one. 9. 9, e89966(2014).</li>
</ol>

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이 분석은 접착 분석, 중피 통관 분석, 약물 검사, 제한 등의 다양한 생화학 및 세포 기반 분석과 통합,하지만 할 수있는 유연하고 생리 학적으로 관련 모델을 제공합니다. 이것은 암 진행에 복강 내 미세 환경의 영향의 평가에 적용 할 수있다. 그러나, 여러 실험 조건은 프로젝트의 목적에 따라 최적화 할 수있다 (예를 들어, 채널, 공동 배양 시간 등 당 시드 HPMCs 암 타원체의 수). 이러한 섬유 아세포, 내피 세포 또는 면역 세포로 복강 내 미세 환경에서 다른 세포 유형은 또한 난소 암 타원체와 주변 셀 간의 중요한 상호 작용을 연구하기 위해 시스템에 포함될 수있다. 이러한 라미닌, 비트로 넥틴, 콜라겐과 같은 다른 ECM 성분이 사용될 수도있다. 고려 될 필요가있다이 프로토콜의 하나의 약점은, 그 동안영양 보충 및 전단 응력의 결합은 생체 내에서 본 그 연상, 우리의 현재 시스템에서 영양 보충과 전단 응력의 별도의 제어가 없습니다. 또한, 이러한 형광 - 활성화 세포 분류...

<html> 난소 암은 부인과에서 가장 치명적인 암이며 널리 보급 복막 악성 복수 형성 한 것을 특징으로한다. 이 광범위한 복막 전이 주요 임상 도전을 나타내고 빈약 한 임상 결과와 연결되어 있습니다. 혈액을 통해 전이 가장 단단한 암과는 달리, 난소 암은 주로 복강 내에서 발신. 종양 세포는 전이 (2)의 과정에서와 같은 다세포 응집체 / 타원체 존재한다. 현탁 배양은 줄기 난소 암 / 종양 세포를 풍부하게 개시 할 수 있다는 사실이 상기 스페 로이드는 모두 종양의 공격성과 연관 chemoresistance 3,4- 향상 될 수 있음을 시사한다. 아마도 다른 분자 메커니즘 5가 2D 및 3D 문화 사이의 약물 반응에 차이가 있습니다. _content는 &quot;&gt;는 mesothelium에 필수적인 상호 작용은 난소 종양 진행에 대한 기본 미세 환경을 구성한다.이 중피 세포를 피브로넥틴은 유비쿼터스 성분 인 세포 외 기질 (ECM)에 거짓말. 증가 중피 세포 유래 피브로넥틴의 표현 사이의 링크를 종양의 진행을 도시하고있다. 피브로넥틴 악성 복수 (6, 7)에 풍부하게 존재한다. 난소 암 세포는 또한 초기 난소 암 전이 (8)을 촉진하기 위해 중피 세포에서 파이브로 넥틴의 분비를 유도 할 수있다. 증거 신흥 전단 응력을 포함한 기계적 자극, 세포 형태, 유전자 발현을 조절하고, 따라서, 종양 세포를도 9,도 10,도 11의 표현형 수 있음을 보여준다. 악성 복수로 개발 및 t 동안 축적umor 진행성 난소 종양 세포는 유체 유동하고, 생성 된 전단 응력에 노출된다. 그룹의 수는 우리가 포함 골격 변형, 상피 간 간엽 전환 및 암 stemness 12, 13, 14, 15을 포함하여, 난소 암의 진행에 대한 전단 응력의 영향을 보여준다. 따라서, 생리 학적으로 관련 미세 종양 복막 전이의 조사를 위해 중요하다. 그러나, 현재의 체외 배양 유체 시스템은 일정한 낮은 생리 학적 관련성 전단 응력 16, 17, 18, 19를 모방하고 제어하는 방법에 제한이있다. 체외에서 기존 여전히 제한되어 세포 또는 기계적 환경 중 하나에 초점을 맞추고 접근적절한 생리 학적 관련성과 복강 내 미세 환경의 복잡성을 흉내 낸. 여기서, 종래의 전략의 한계를 극복하고, 암전의 복강 구획 연구를 진행하는 복막의 새로운 모델을 설계하기 위해서는, 제어 된 유체 유동을 가진 3 차원 미세 기반 플랫폼을 설계 하였다. 이 모델에서, 난소 암 타원체 연속 유체 흐름 (도 1a) 아래에 미세 유체 칩 차 인간 복막 중피 세포와 공동 배양 하였다. 중피 세포를 피브로넥틴에 도금했다. 비 - 부착 성 난소 암 타원체는 시린지 펌프에 의해 관류 연속 유동 매질과 미세 유체 채널로 접종 하였다. 3 차원 환경과 동적 기계적 힘 모두 전이성 캐스케이드 매우 중요한 요인이다. 이 플랫폼은 복잡한 CEL의 관점에서 복강 미세 조사를 위해 사용될 수있다뿐만 아니라 동적 기계적 큐에 관해서적인 다공질 공동 배양 상호 작용.

<table><tbody><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>대학 웨이퍼</td><td>#1196</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>SU-8 2075 포토레지스트&nbsp;</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 개발자&nbsp;</td><td>Microchem</td><td>108-65-6</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>1673921 Polydimethylsiloxane (PDMS) + 경화제 키트</td></tr><tr><td>생검 펀치&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>33-31AA</td><td>1 mm 직경</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>SCI</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.86 mm (내경)</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>더 긴 정밀 펌프&nbsp;</td><td>&nbsp; LSP01-2A</td><td></td></tr><tr><td>중간 199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td>2.2 g/L 중탄산 나트륨</td></tr><tr><td>MCDB 105 중간 크기</td><td>Sigma</td><td>M6395</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30068.02</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>트립신 EDTA 솔루션&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0.05% 트립신 - 0.01% EDTA, 페놀 레드</td></tr><tr><td>피브로넥틴 인간</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>5-chloromethylfluorescein diacetate</td><td>Life technologies</td><td>C7025</td><td>Green CMFDA</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>모델: 80i 또는 ECLIPSE Ti; 소프트웨어: SPOT</td></tr><tr><td>SKOV-3& 주의;</td><td></td><td></td><td>N Auersperg 박사(브리티시 컬럼비아 대학교)의 선물</td></tr></tbody></table>

동적 3d 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

난소 암은 일반적으로 악성 복수에서 발견 된 종양 분야와 광범위한 복막 전이 특징으로한다. 이것은 가난한 임상 결과와 관련, 현재 효과적인 치료가 부족합니다. 모두 3 차원 환경과 동적 기계적 힘이 전이성 캐스케이드에서 매우 중요한 요소이다. 그러나, 기존의 세포 배양이 자연 종양 미세 환경 요점을 되풀이하지 못한다. 따라서, 복강 환경을 에뮬레이션 할 수 있습니다 생체 -like 모델은 분명 중요하다. 이 연구에서, 복막의 새로운 미세 전이 플랫폼 동안 복강 난소 암 타원체의 상황을 모방하기 위해 설립되었다. 비 - 부착 성 조건하에 생성 된 난소 암 타원체는 생리 학적으로 관련이 전단 응력을 실시 복막 중피 세포로 코팅 된 미세 채널에서 배양 하였다. 요약하면,이 역동적 인 3D 난소 암 mesothelium 마이크rofluidic 플랫폼은 기본 암 생물학에 새로운 지식을 제공하고 잠재적 인 약물 검사 및 개발을위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.

이 프로토콜을 이용하여 미세 유체 플랫폼은 유체 역학적 조건 중피 세포 난소 암 타원체를 모델링하기 위해 설정되었다. 차 인간 복막 중피 세포는 16 시간을위한 마이크로 디바이스에서 배양하고, 명 시야 현미경으로 관찰 하였다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 채널 하부 성공적 HPMCs의 단층으로 덮었다. 이는 채널 코팅 실패로 이어질 피브로넥틴 또는 HPMC 패터닝 동안 그 기포 형성을 주목하는 것이 중요하다. 비 접착 현탁 배양을 통해 환자의 복수에있는 것과 비슷한 크기입니다 약 100 μm의 직경을 가진 다세포 회전 타원체는 생성 된 녹색 형광 염료, CMFDA으로 표시. 타원체는 HPMC 코팅 된 미세 유체 채널에 옮기고 현탁액에 남아 있었다. 셀 모폴로지는도 2 (현미경 관찰 및 이미지 캡처 된B). 형광 표지 된 암 타원체 용이 형광 현미경 (도 2c) 아래 중피 세포...

생리 관련 모델에서 난소 종양의 진행을 연구하기 위해, 다세포 회전 타원체는 시뮬레이션 된 유체의 흐름에 따라 마이크로 디바이스에서 배양 하였다. 이 동적 3D 모델은 난소 암 전이가 발생 셀룰러 및 기계 부품과 복강 환경을 에뮬레이트합니다.

동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 난소암 전이가 발생하는 세포 및 기계적 구성 요소를 갖춘 복강 내 환경을 모방하기 위해 동적인 미세유체 기반 공동 배양 플랫폼을 구축하는 것입니다. 이 플랫폼을 통해 복막 전이의 미세환경과 같이 암 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 정밀하게 제어된 자유 흐름(free-flow) 하에서의 3D 공동 배양이 복강 내에서 발생하는 난소암 세포와 중피 세포 간의 생체 내 상호작용을 더 잘 모사한다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 미세유체 채널 패턴을 설계 및 도면화하고 제작한 후, 실리콘 웨이퍼 위에 SU82075 포토레지스트 층을 1800 RPM의 회전 속도로 스핀 코팅합니다. 포토레지스트가 코팅된 웨이퍼를 핫플레이트 위에 올려 65 °C에서 5분 동안 베이킹합니다. 그 후, 과잉 용매를 제거하기 위해 95 °C에서 25분 동안 베이킹합니다.웨이퍼 위에 SU82075 포토레지스트의 두 번째 층을 스핀 코팅하여 최종 두께가 250 micrometers가 되도록 합니다. 포토레지스트가 코팅된 웨이퍼를 65 degrees Celsius의 핫플레이트 위에 7분간, 이어서 95 degrees Celsius에서 30분간 직접 가열한 후, 웨이퍼를 실온으로 천천히 냉각시킵니다. 다음으로, 포토마스크를 웨이퍼 상단에 정렬하여 직접 배치합니다.그 다음, 패턴을 가교시키기 위해 20초 동안 UV 광선에 노출시킵니다. 핫플레이트 위에서 코팅된 웨이퍼를 65 °C에서 5분 동안, 그리고 95 °C에서 12분 동안 베이킹하여 전중합을 위한 용매를 제거합니다. 웨이퍼를 SU8 현상액에 25분 동안 담가 가교되지 않은 포토레지스트를 제거합니다.그 후 이소프로판올로 웨이퍼를 헹구고 가압 공기를 사용하여 건조시킵니다. Polydimethylsiloxane 또는 PDMS 베이스와 경화제를 10:1 질량비로 혼합하고, 원심 믹서의 혼합 및 탈포 기능을 사용하여 용액을 섞습니다. PDMS 혼합물을 웨이퍼 위에 약 5 mm 높이가 되도록 천천히 붓습니다.진공 데시케이터에서 PDMS를 40분 동안 탈기합니다. 그런 다음 오븐에서 65 °C로 2시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 마스터에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 떼어내고, 유리 슬라이드 크기가 될 때까지 채널을 따라 PDMS를 다듬습니다.그런 다음 1mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 PDMS에 구멍을 뚫어 장치의 입구와 출구를 만듭니다. 가압 공기를 사용하여 PDMS 표면을 세척한 후, 접착 테이프로 먼지와 PDMS 잔해를 제거합니다. 이제 채널 면이 위를 향하도록 PDMS 슬랩을 플라즈마 세척기에 넣습니다.그런 다음 깨끗한 유리 슬라이드를 PDMS 슬래브와 함께 플라즈마 세척기에 배치합니다. 고주파(RF) 수준의 공기 플라즈마 조건에서 PDMS와 유리 슬라이드를 1분 동안 처리합니다. 플라즈마 세척기에서 샘플을 꺼낸 후, PDMS를 유리 슬라이드에 접합하여 가역적이지 않은 공유 결합을 형성합니다.접합 강도를 높이고 사용 전 PDMS의 소수성을 회복시키기 위해, PDMS 칩을 150°C의 핫플레이트 위에 1시간 동안 둡니다. 미세유체 채널을 피브로넥틴으로 코팅하려면, 먼저 30 µL의 75% 에탄올을 사용하여 채널을 멸균합니다. 에탄올을 제거하고 PBS를 사용하여 채널을 두 번 헹굽니다.그런 다음 채널 내의 PBS를 완전히 흡입하여 제거합니다. 혈청이 없는 M199MCDB105 배지에서 10 µg/mL 농도의 피브로넥틴 용액을 준비하고, 이 용액 30 µL를 사용하여 채널을 천천히 채운 뒤 테이프로 밀봉합니다. 이후 칩을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.일차 복막 중피 세포 또는 HPMC를 미세유체 채널에 파종하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 배양된 세포를 세척한 후 10% FBS 배양액 2 mL를 사용하여 HPMC를 재부유합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하고 세포 농도를 3.5 × 10⁶ cells/mL로 조정합니다. 사용 전 피브로넥틴이 코팅된 미세유체 칩을 37 °C 인큐베이터에서 5분 동안 예열합니다.그 다음 피브로넥틴 용액을 완전히 흡입하여 제거하고, 각 채널에 30 µL의 HPMC 현탁액을 천천히 피펫팅합니다. 테이프로 채널을 밀봉하고 장치를 CO2 배양기에 넣어 하룻밤 동안 둡니다. 난소암 스페로이드 형성을 유도하기 위해, 0.5% agarose를 멸균수에 녹입니다.96-웰 플레이트의 웰에 50 µL의 아가로스 용액을 분주합니다. 이전에 배양한 인간 상피암 세포의 수를 센 후, 5% FBS 배양액에서 세포 밀도가 5,000 cells/mL가 되도록 재현탁합니다. 각 아가로스 코팅된 웰에 200 µL의 세포 현탁액을 옮깁니다.그 후 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양합니다. 암 구상체를 1 mL의 무혈청 배지가 미리 들어있는 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고 750 ×g에서 5분간 원심분리하여 가라앉힙니다. 이어서 무혈청 M199MCDB105 배지를 사용하여 2.5 µg/mL 농도의 CMFDA 용액을 준비합니다.암 스페로이드를 1 mL의 용액에 재부유시킨 후 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음 스페로이드 수를 측정하고 무혈청 배지를 사용하여 농도를 mL당 2,000개의 스페로이드로 조정합니다. 스페로이드를 로딩하기 전, 무혈청 M199MCDB105 배지 100 µL를 천천히 주입하여 채널 내부의 부착되지 않은 중피세포를 세척합니다.형광 표지된 스페로이드 현탁액 30 µL를 각 채널에 로드합니다. 그 다음, 미세유체 칩을 CO2 배양기에 넣습니다. 신선한 무혈청 M199MCDB105 배지가 채워진 주사기를 1m 길이의 튜브에 연결하여 퍼퓨전 플랫폼을 조립합니다.시린지를 시린지 펌프에 장착하고 플런저와 시린지 본체를 고정하십시오. 그런 다음 인큐베이터 내부의 미세유체 칩과 동일한 높이에 시린지 펌프를 수평으로 설치하십시오. 배지가 튜브 밖으로 넘쳐흐를 때까지 고속 전진 버튼을 계속 눌러 튜브 전체에 배지를 빠르게 주입하십시오.그런 다음 원하는 유속으로 주입을 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 튜브를 채널의 입구에 연결하십시오. 그다음 짧은 출력 튜브를 사용하여 채널의 출구를 50-milliliter 원심 분리 튜브(conical tube)에 연결하여 유출 배지를 수집합니다.마지막으로, 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 HPMC와 암 구상체를 관찰합니다. 본 동영상에서 설명한 미세유체 플랫폼을 사용하여, 유체역학적 조건 하에서 중피세포와 함께 난소암 구상체 모델을 구축하였습니다. 이 그림에서 보는 바와 같이, 미세 장치에서 16시간 동안 배양된 중피세포가 성공적으로 HPMC 단층을 형성하였습니다.본 실험에서는 환자 체내에서 발견되는 것과 크기가 유사한 직경 약 100 µm의 다세포 스페로이드를 녹색 형광 염료인 CMFDA로 라벨링하였습니다. 그 후 스페로이드를 HPMC가 코팅된 미세유체 채널로 옮겨 현탁 상태로 유지하며 세포 형태를 캡처하였습니다. 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 3일 동안 하루에 수 시간 내에 완료할 수 있습니다.이 절차의 10단계에서는 미세유체 채널 내에 공기 방울이 유입되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 약물 처리, 부착 분석, 중피 세포 제거 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여 복강 내 미세환경이 암 진행에 미치는 영향과 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 암 생물학 분야의 연구자들이 인간의 복막 전이를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 복강 내 난소암 거동 연구를 시작하기 위해 유체 흐름이 가능한 복막 마이크로디바이스를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 현상액으로 사용되는 아세톤이나 사이린과 같은 유기 용매를 다루는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 이 절차를 처음 수행할 때는 항상 장갑과 실험복 착용과 같은 안전 주의 사항을 준수해야 합니다.이 사무실과 관련된 모든 절차는 극비 상태에서 수행되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기에 설명된 mesothelial 통관 분석은 fluorescently 표시된 셀 및 촬영된 비디오 현미경 시각화하고 양적 난소암 다세포 spheroids 및 mesothelial 세포 monolayers의 상호 작용을 측정하기 위해 활용합니다. 이 분석은 난소 암 전이의 초기 단계를 모델.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

이 비디오에서는 복막강 내막의 체외 3차원 모델 개발을 보여줍니다. 이 유기형 배양은 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

복강내막의 난소암 전이 모델링: 복막강 내막의 체외 3D 모델을 확립하는 방법

이 비디오에서는 난소 이식 내 난소암 집락화를 연구하기 위해 GFP 발현 난소암 세포와 겹쳐진 생체 외 난소 장기 배양을 확립합니다. 이 프로토콜은 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spot)으로 알려진 망막 내의 면역 세포 구조를 분석합니다.

Modeling Ovarian Cancer Cell Colonization of Omentum: An ex vivo method to establish Milky spot colonization of fluorescently labeled ovarian cancer cells in murine omentum explants(오멘텀의 난소암 세포 집락화 모델링: 쥐 오멘텀 외식에서 형광 표지된 난소암 세포의 밀키 스폿 집락화를 확립하기 위한 생체 외 방법)

복막의 중피 안감에 난소 암 세포의 침공은 시간이 지남에 따라 역동적 인 과정이다. 실시간 분석기를 활용 타원체-중피 세포 공동 배양 모델의 난소 암 세포의 침윤 능력은 전이 과정을 조절하는 인자에 대한 통찰력을 제공하고, 장기간의 시간주기에 걸쳐 정량화 될 수있다.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

여기에서는 난소암 세포의 부착, 침습 및 증식을 조사하기 위한 도구로서 일차 인간 중피 세포와 세포외 기질로 층을 이룬 섬유아세포로 구성된 복막강 내막의 3차원 체외 모델을 구성하는 프로토콜을 제시합니다.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

관련 인간 질병을 충실하게 재구성하는 포괄적인 체외 모델은 부족합니다. 현재 연구는 인간 간세포 암에서 종양 기질 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수있는 체외 도구인 3차원 (3D) 종양 스페로이드 생성 및 문화를 제시합니다.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

이 프로토콜은 암세포-omentum 상호 작용의 3차원(3D) 생체 외 모델의 확립을 설명합니다. 이 모델은 지방 틈새 시장 내에서 종양 유발 기전을 규명하고 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

암 전이를 연구하기 위해 이세포성 누화를 캡처하는 3D 암 모델이 매우 필요합니다. 우리의 연구는 침입 및 세포 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있는 골격 및 골격이 없는 환경에서 이종 다세포 기질-상피의 생성을 제시합니다.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

배우세요 난소암 전이 연구를 위한 동적 마이크로플루이딕 공배양 플랫폼 구축 방법을. 3D 다세포 회전 타원체와 복막세포 간 상호작용을 정밀 유동 조건에서 분석하여 생체 내 환경을 모사합니다.

동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

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