동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

이 절차의 전반적인 목표는 난소암 전이가 발생하는 세포 및 기계적 구성 요소와 함께 복강 내 환경을 모방하기 위해 동적 미세유체 기반 공동 배양 플랫폼을 만드는 것입니다. 이 플랫폼에 이 마이크로를 사용하면 복막 전파의 미시환경과 같은 암 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 정밀하게 제어되는 자유 흐름 하에서 3D 공동 배양이 복막강에서 발생하는 난소암 세포와 메토테디아 세포 간의 생체 내 통신을 더 잘 모방한다는 것입니다.

미세유체 채널 패턴을 설계 및 드로잉하고 텍스트 프로토콜에 따라 생산한 후 1800RPM의 회전 속도로 실리콘 웨이퍼에 SU82075 포토레지스트 층을 스핀 코팅합니다. 포토레지스트 코팅된 웨이퍼를 섭씨 65도의 핫 플레이트에 5분 동안 직접 굽습니다. 그런 다음 섭씨 95도에서 25분 동안 과도한 용매를 제거합니다.

웨이퍼에 SU82075 포토레지스트의 두 번째 층을 스핀 코팅하여 최종 두께를 250마이크로미터로 만듭니다. 포토레지스트 코팅된 웨이퍼를 섭씨 65도의 핫 플레이트에 7분 동안 직접 놓고 섭씨 95도에서 30분 동안 가열한 후 웨이퍼를 실온으로 천천히 냉각합니다. 그런 다음 포토 마스크를 웨이퍼 위에 직접 정렬하고 놓습니다.

그런 다음 20초 동안 자외선에 노출시켜 패턴을 교차시킵니다. 핫 플레이트에서 코팅된 웨이퍼를 섭씨 65도에서 5분, 섭씨 95도에서 12분 동안 굽어 사전 석회화를 위한 용매를 제거합니다. 웨이퍼를 SU8 현상액에 25분 동안 담궈 교차 길이가 없는 포토레지스트를 제거합니다.

그런 다음 isopropanal로 웨이퍼를 헹구고 압축 공기를 사용하여 건조시킵니다. 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 염기와 경화제를 10:1 질량비로 결합하고 혼합 및 탈기 기능 하의 원심 믹서를 사용하여 용액을 혼합합니다. PDMS 혼합물을 약 5mm 높이로 웨이퍼에 천천히 붓습니다.

진공 데시케이터에서 PDMS의 가스를 40분 동안 제거합니다. 그런 다음 섭씨 65도의 오븐에서 2시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 마스터에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 떼어내고 유리 슬라이드 크기가 될 때까지 채널을 따라 PDMS를 자릅니다.

그런 다음 1mm 생검 펀치로 PDMS를 펀칭하여 장치의 입구와 출구를 만듭니다. 압축 공기를 사용하여 PDMS 표면을 청소한 다음 접착 테이프로 먼지와 PDMS 파편을 제거합니다. 이제 채널 쪽이 위쪽을 향하도록 PDMS 슬래브를 플라즈마 클리너에 놓습니다.

그런 다음 깨끗한 유리 슬라이드를 PDMS 슬래브와 함께 플라즈마 클리너에 배치합니다. PDMS 및 유리 슬라이드를 고무선 주파수 또는 RF 레벨에서 공기 플라즈마에서 1분 동안 처리합니다. 그런 다음 플라즈마 클리너에서 샘플을 제거한 후 PDMS를 유리 슬라이드에 결합하여 비가역적 공유 결합을 생성합니다.

PDMS 칩을 섭씨 150도의 핫 플레이트에 1시간 동안 올려 놓으면 접착 강도가 향상되고 사용 전에 PDMS의 소수성을 되돌릴 수 있습니다. 미세유체 채널을 피브로넥틴으로 코팅하려면 먼저 30마이크로리터의 75% 에탄올을 사용하여 채널을 살균합니다. 에탄올을 제거하고 PBS를 사용하여 채널을 두 번 헹굽니다.

그런 다음 채널에서 PBS를 완전히 흡인합니다. 30마이크로리터의 용액이 있는 무혈청 M199MCDB105 배지에 피브로넥틴 용액 10마이크로그램을 준비하고 채널을 천천히 채우고 테이프를 사용하여 밀봉합니다. 그런 다음 칩을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

1차 복막 중피 세포 또는 HPMC를 미세유체 채널에 시딩하려면 텍스트 프로토콜에 따라 배양된 세포를 헹군 후 2밀리리터의 10%FBS 배양 배지를 사용하여 HPMC를 다시 현탁시킵니다.혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 세포 농도를 3.5배 10으로 조정하여 밀리리터당 6번째 세포로 조정합니다. 사용하기 전에 피브로넥틴이 코팅된 미세유체 칩을 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5분 동안 데우십시오.

그런 다음 피브로넥틴 용액을 완전히 흡인하고 30마이크로리터의 HPMC 현탁액을 각 채널에 천천히 피펫으로 주입합니다. 테이프를 사용하여 채널을 밀봉하고 장치를 CO2 인큐베이터에 밤새 넣습니다. 난소암 스페로이드 형성을 유도하려면 0.5%아가로스를 멸균수에 녹입니다.

50마이크로리터의 아가로스 용액을 96개의 웰 플레이트의 웰에 분배합니다. 이전에 배양한 인간적인 상피 암 세포를 세는 후에, 5의 조밀도에 5%FBS 배양 매체에 있는 세포, 밀리리터 당 000의 세포를 다시 현탁시키십시오. 200마이크로리터의 세포 현탁액을 아가로스로 코팅된 각 웰로 옮깁니다.

그리고 섭씨 37도에서 48시간 동안 5% CO2로 세포를 배양합니다. 암 스페로이드를 1ml의 무혈청 배지로 사전 적신 50ml 원심분리기 튜브로 옮기고 750배 G에서 5분 동안 스페로이드를 스핀다운합니다. 무혈청 M199MCDB105 배지에서 밀리리터당 2.5마이크로그램의 CMFDA 용액을 준비한 후.

암 스페로이드를 1ml의 용액에 다시 현탁시키고 섭씨 37도에서 30분 동안 스페로이드를 배양합니다. 그런 다음 스페로이드 수를 계산하고 무혈청 배지를 사용하여 농도를 밀리리터당 2, 000 스페로이드로 조정합니다. 스페로이드를 로딩하기 전에 100마이크로리터의 무혈청 M199MCDB105배지를 천천히 주입하여 채널 내부의 부착되지 않은 중피 세포를 씻어냅니다.

30마이크로리터의 형광 표지 스페로이드 현탁액을 각 채널에 로드합니다. 그런 다음 미세유체 칩을 CO2 인큐베이터에 넣습니다. 1m 길이의 튜브에 새로운 무혈청 M199MCDB105 배지가 적재된 주사기를 부착하여 풍부한 플랫폼을 조립합니다.

사기를 주사기 펌프에 놓고 플런저와 주사기 본체를 고정합니다. 그런 다음 인큐베이터 내부의 미세유체 칩과 동일한 높이의 수평 위치에 주사기 펌프를 설치합니다. 매체가 튜브에서 넘칠 때까지 빨리 감기 버튼을 누르고 있으면 전체 튜브에 매체를 빠르게 주입합니다.

그런 다음 원하는 유속으로 주입을 실행합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 튜브를 채널 입구에 연결합니다. 그런 다음 단락 출력 튜브를 사용하여 채널의 출구를 50ml 원추형 튜브에 연결하여 유출 매체를 수집합니다.

마지막으로 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 HPMC와 암 스페로이드를 관찰합니다. 이 비디오에 설명된 미세유체 플랫폼을 사용하여 난소암 스페로이드를 유체역학적 조건에서 중피 세포로 모델링했습니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이 마이크로 장치에서 16시간 동안 배양된 중피 세포는 성공적으로 HPMC의 단층을 형성했습니다.

이 실험에서는 환자 사회에서 발견되는 것과 크기가 유사한 약 100마이크로미터의 직경을 가진 다세포 스페로이드에 녹색 형광 염료 CMFDA를 표시했습니다. 그런 다음 스페로이드를 HPMC 코팅된 미세유체 채널로 옮기고 현탁액을 유지하고 세포 형태를 포착했습니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행되면 3일에 걸쳐 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에서 10명 중 1명은 미세유체 채널로 기포를 도입하지 않도록 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 약물 치료, 접착 분석, 중피 제거 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 복강 내 미세 환경이 암 진행에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 암 생물학 분야의 연구자들이 인간의 복막 메스타스타시스를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 복강에서 난소암 행동을 시작하기 위해 유체 흐름이 있는 복막 마이크로 장치를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 현상액 및 실린으로서 아세톤과 같은 유기 황으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 처음 수행할 때 장갑과 실험복 착용과 같은 MP 주의 사항을 항상 취해야 합니다.

이 사무실을 다루는 모든 절차는 극도의 비밀리에 수행되어야 합니다.