운동 조건의 혈청을 이용한 인대 구조의 치료 : Translational Tissue Engineering Model

이 모델의 전반적인 목표는 운동과 영양이 결합 조직 합성 및 기능에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이 기술은 3D 조직을 치료하기 위해 운동 전후에 복용하는 인간 혈청을 사용하여 운동이 인대와 힘줄의 기능에 어떤 영향을 미치는지 이해할 수 있습니다. 3D 조직 보장은 잘 특성화된 체외 분석의 이점과 생체 내 조직의 기능, 형태 및 생화학적 특성을 결합합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 실리콘 코팅된 35mm 플레이트를 미리 준비한 후 금형의 각 원통형 웰 중앙에 하나의 minutien 핀을 배치하여 앵커 금형을 준비합니다. 베타 인산 삼칼슘과 오르토인산 용액을 밀리리터당 1-3g으로 얼음 위의 플라스틱 계량 보트에 섞습니다. 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 시멘트를 세게 혼합합니다.

시멘트를 분쇄하여 혼합을 계속하고 혼합물을 금형에 피펫팅한 다음 채워진 금형을 2, 250회 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심 분리 후 brushite 시멘트 앵커를 밤새 실온에서 설정하십시오. 다음 날 아침 금형에서 앵커를 제거하고 각 실리콘 코팅 플레이트에 12mm 떨어진 두 개의 앵커를 고정합니다.

고정된 플레이트에 70% 에탄올을 분사하여 플레이트와 뚜껑을 모두 채워 살균한 다음 플레이트를 생물 안전 캐비닛(BSC)에 넣습니다. 최소 30분 후 플레이트를 흡인하고 BSC에서 시도할 수 있도록 합니다. 뚜껑을 교체하고 필요할 때까지 BSC에 보관하십시오.

생물학적 위험 물질의 적절한 사용 및 폐기를 위해 현지 생물학적 위험 규정을 준수하십시오. 멸균 상태를 유지하고 생물 안전 캐비닛에서 구조물 형성 단계를 수행합니다. 1차 섬유아세포, 시약 및 핀이 있는 brushite 앵커가 있는 실리콘 코팅 플레이트를 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 15cm 플레이트에서 세포를 70% 합류점까지 배양합니다.

다음으로, 세포 현탁액 구성제당 681마이크로리터, 트롬빈 구성제당 29마이크로리터, 아프로티닌 구성제당 2마이크로리터, 아미노헥사노산 구성제당 2마이크로리터로 구성된 마스터 믹스를 준비합니다. 용액을 잘 혼합한 후 브러시라이트 시멘트 앵커 주위에 8자 패턴으로 고정된 각 플레이트에 714마이크로리터를 추가하여 마스터 믹스가 앵커의 측면에 직접 접촉하도록 합니다. 각 플레이트를 부드럽게 두드려 믹스를 고르게 분배합니다.

가장 중요한 단계는 세포 기반 피브린 겔을 형성하는 것입니다. 셀 시트 마스터 믹스가 앵커에 직접 접촉하는지 확인하고 플레이트를 두드려 혼합물을 고르게 분배합니다. 한 번에 한 플레이트씩 286마이크로리터의 피브리노겐을 플레이트 위에 균일하게 적방울 형태로 추가합니다.

즉시 플레이트를 앞뒤로 좌우로 밀어 피브리노겐을 분배하여 세포 내장 피브린 겔을 형성한 후 다음 플레이트로 진행합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지되는 멸균 인큐베이터에 구조체를 넣고 피브리노겐이 중합될 수 있도록 최소 15분 동안 배양합니다. 성장 배지에 아스코르브산 200마이크로몰, 프롤렌 50마이크로몰, TGF 베타 1 밀리리터당 5나노그램을 보충하여 공급 배지 구성물당 2밀리리터를 준비합니다.

2ml의 공급 매체를 사용하여 각 구조체를 덮고, 총 14일 동안 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소로 유지되는 멸균 인큐베이터에서 구조체를 배양하거나 원하는 종말점까지 배양하고 2일에 한 번씩 2ml의 공급 배지로 배지를 새로 고칩니다. 인간 혈청을 수집하려면 텍스트 프로토콜에 따라 휴식 혈액 샘플을 채취한 다음 참가자가 연구 목표에 맞는 운동 모드를 수행하도록 합니다. 다음은 30분 동안 진행되는 고강도 저항 운동입니다.

운동 세션 15 분 후에 혈액 샘플을 수집 한 다음 혈액이 응고되도록한 후 10 분 동안 1, 500 회 g으로 샘플을 회전시킵니다. 멸균 상태에서는 배지 준비를 위해 혈청을 멸균 튜브로 옮깁니다. 인대 구조를 준비한 후, 힘 트랜스듀서에 결합된 리버스 몰딩 그립이 있는 PBS 수조에서 인장 테스터를 사용하여 인장 테스트를 수행합니다.

이는 테스트 중에 brushite 시멘트 앵커를 제자리에 고정합니다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 인대 구성의 길이와 구조를 결정하고 조직의 단면적을 계산합니다. 플레이트에서 인대 구성체를 분리하고 리버스 몰드 그립에 앵커를 배치하여 구성물이 PBS에 잠겼는지 확인한 다음 그립 사이의 거리를 조정하여 구성물의 길이를 초기 길이로 설정합니다.

테스트를 시작하고 초당 0.4mm 또는 초당 3%의 변형률로 구조물을 변형시켜 파손시킵니다. 테스트 후 조직을 처리하고 텍스트 프로토콜에 따라 엔지니어링된 인대의 콜라겐 정량화를 수행합니다. 배양에서 하루에서 이틀 후, 전방십자인대 섬유아세포는 피브린 겔에 부착되어 세포 과정을 확장하고 견인력을 발휘하기 시작했습니다.

두 앵커 포인트 사이에 장력이 발생하고 세포가 이 축과 평행하게 정렬되어 콜라겐을 침착하기 시작합니다. 여기에 표시된 것은 파괴 테스트된 인대에 대한 대표적인 응력 변형률 플롯입니다. 이 실험에서는 운동 전후 혈액 샘플에서 인간 혈청을 분리하여 FBS 대신 사용하여 운동 유도 생화학적 환경으로 강화된 배지를 생성했습니다.

이 그래프에서 볼 수 있듯이, 14일의 배양 기간 후 인대 구조는 운동 후 혈청에 대한 반응으로 최대 인장 부하와 콜라겐 함량이 모두 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 마스터하면 이틀에 걸쳐 인대 구조를 만들 수 있으며 2주 안에 인장 테스트, 콜라겐 함량 정량화 및 기타 생화학 분석을 준비할 수 있습니다. 이 Translation in vitro in vivo 모델은 운동이 인대, 힘줄, 그리고 실제로 신체의 거의 모든 조직의 기능을 어떻게 개선하는지 이해하기 위한 광범위한 임무의 일부입니다.

따라서 이것은 운동, 영양, 부하, 모든 유형의 성장 인자, 인간이나 동물에서 할 수 있는 모든 유형의 다양한 중재를 통한 치료를 통해 콜라겐 함량과 결합 조직 기능을 결정할 수 있는 매우 강력하고 강력한 기술입니다.