Name: 음경 골의 해부, MicroCT 스캔 및 형태 학적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 배우세요 생쥐 음경 골의 해부 및 MicroCT 스캔을 통한 형태 측정 분석법입니다. 랜드마크가 없는 복잡한 구조의 3차원 크기와 형태 변화를 정량화하여 생물학적 형태측정 연구의 정확성과 재현성을 향상시킵니다.

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팀 데일리와 앤드류 스미스는 초기 일 동안 많은 유용한 계산 토론을 제공; 팀 데일리는 전산 자원이 남부 캘리포니아 대학의 고성능 컴퓨팅 클러스터가 제공 한 프로토콜 5. 필요한 프로그램 rotate_translate_cylindrical을 썼다. 이 작품은 NIH 부여 # 1 GM098536 (MDD)에 의해 지원되었다.

모든 절차와 인원은 동물 관리 및 사용위원회 남부 캘리포니아 대학의 대학 (IACUC), 프로토콜 # 11394에 의해 승인되었다. 1. 음경 골 해부 및 준비 <ol><li> 관련 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 정한 프로토콜에 따라, 과다 노출 이산화탄소를 통해 성적으로 성숙한 수컷 마우스를 안락사. </li><li> 앙와위에서 동물을 배치하고, 엄지 손가락은 포피 개방 측 방향으로 압력을 적용하여 음경을 뻗치다. </li><li> 음경이 길어지면, 가능한 한 포피 통해 조직을 확장한다. </li><li> 가위로, 음경 골이있는 귀두의 음경 몸 인접를 잘라. </li><li> 1.7 ML의 튜브에 해부 성기를 전송하고 200 μL의 수돗물을 추가합니다. 음경이 완전히 액체에 잠긴 않았는지 확인합니다. </li><li> 3~5일 위해 ~ 50 ° C의 물에서의 조직을 인큐베이션. </li><li&gt; 적절한 배양 후, 해부 현미경으로 집게를 사용하여 음경 골에서 주변 조직을 제거합니다. 부드럽게 조직을 밀어 나머지 뼈를 청소하는 70 % 에탄올을 분출. </li><li> 열린 모자와 새로운 microcentrifuge 관에 해부 음경 골을 넣습니다. 열린 O 캡 남기기 / N 뼈를 건조합니다. </li></ol> 2. MicroCT 스캐닝 <ol><li> 꽃집 거품의 실린더를 만드는 꽃집 거품의 벽돌로 microCT 스캔 원통형 홀더를 누르십시오. </li><li> 꽃집 거품의 실린더를 추출하고 2-5cm 두께 ~ 조각을 잘라. </li><li> 스캔하는 동안 간섭을 최소화하기 위해 개별 조각의 주위에, 꽃집 폼에 건조 bacula을 누릅니다. 뼈의 정확한 방향은 프로토콜 4 각 시편의 적절한 식별을 가능하게 주목해야한다. </li><li> 조심스럽게 microCT 홀더에 삽입 된 뼈 조각을 배치합니다. </li><li> microCT 스캔을 획득. 마우스 bacula (14)의 경우, </sup90 KVP, 155 μA, 0.5 mm 알루미늄 필터, 180 (360 범위) 당 750 돌기의 노출 시간 :&gt;, 우리는 다음과 같은 설정 아래에있는 USC 분자 이미징 센터에서 uCT50 스캐너 (Scanco 의료 AG, Bruttisellen, 스위스) 사용 500 밀리, 15.5 mm의 복셀 크기입니다. </li></ol> 3. MicroCT 처리 : 단일가 .xyz 파일에 .DCM 스택 변환 참고 : 각 microCT 스캔이 .DCM의 스택, 또는 &quot;DICOM&quot;개체를 통해 촬영 한 이미지 조각을 나타내는 파일을 생성합니다. x, y 및 각 화소의 Z 좌표와 -5,000 (검은 색)에서 5000의 범위의 화소의 강도 - 모든 다운 스트림 계산 기하학 네 개의 컬럼을 포함하는 텍스트 파일이 단순히 인 평면 .xyz 인 파일이 필요 (화이트). 3,000 위의 픽셀 임계 값은 일반적으로 뼈를 정의하기위한 임계 값으로 잘 작동합니다. <ol><li> 설치 파이썬 (www.python.org)와 파이썬 모듈 명령, DICOM, PYLAB, SYS, 그리고 NumPy와. </li><li> 열기 &quot;01_process_dicom.py &quot;텍스트 편집기와 {Figshare}. 필요에 따라 변수 섹션, 변경 경로, 픽셀 임계 값 및 디렉토리 이름에서. </li><li> &quot;파이썬 01_process_dicom.py&quot;를 실행합니다. 진행 화면이 출력됩니다. 단계 3.2에 지정된 각 디렉토리 내에서 새 파일의 이름은 만든되며, 예 PT3000 화소 임계치를 나타내는 directory_name.PT3000.xyz는 단계 3.2에 나타내었다. </li></ol> 4. MicroCT 처리 : 분단 아웃 개별 표본을 파일가 .xyz <ol><li> 라이브러리 RGL와 R을 (https://www.r-project.org/)를 설치합니다. </li><li> 텍스트 편집기를 사용하여 파일 &#39;02_segment_dicoms.r&#39;{Figshare}을 엽니 다. 변수 섹션에서 위의 프로토콜 3에서 만든 .xyz 인 파일을 가리 키도록 경로 이름을 변경합니다. </li><li> R 내에서 (따옴표없이) 명령 &quot;소스 ( &#39;02_segment_dicoms.r&#39;)를&quot;실행합니다. </li><li> 프로토콜 3에서 만든 .xyz 인 파일의 세 가지 차원 이미지 후에 나타나면 한 접점을 입력전체가 .xyz 파일에서 표본의 연구. 그런 다음 레이블과 스크롤 및 줌 기능을 사용하여 각 시편의 점을 선택합니다. 참고 : 배경에서 분리가 .xyz 파일은 각각의 시료에 대하여 설명한다. 이들은 PT3000 사용 된 픽셀 임계 값을 나타냅니다 예를 들어, XYZ_FILES_PT3000에 대해,라는 이름의 디렉토리에 나타납니다. </li></ol> &quot;정렬&quot;5. 표본은 일반 좌표로 파일이 .xyz. <ol><li> 추가 모듈 mattdean_modules.py {Figshare}뿐만 아니라이 자립 응용 프로그램을 필요로하는 파이썬 스크립트 &quot;03_transform.py&quot;{Figshare}을 열고 &quot;rotate_translate_cylindrical&quot;(https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) 와 &quot;qconvex&quot;(www.qhull.org/html/qconvex.htm)이 스크립트에 의해 사용되는. </li><li> 변수 섹션에서, rotate_path 및 qconvex_dir을 mattdean_modules.py의 전체 경로 이름을 식별합니다. 또한, 개별 xy를 들어있는 디렉토리의 전체 경로를 확인4 단계에서 만든 Z 파일. </li><li> 접미사 .TRANSFORMED.xyz와 시편마다 새 파일을 만들어 실행 03_transform.py. </li></ol> 파일가 .xyz 6. &quot;슬라이스&quot;정렬 된 표본은 세미 랜드 마크를 확인합니다. <ol><li> 열기와 파이썬 스크립트 &quot;04_identify_landmarks.py&quot;를 실행 {Figshare}. 변수 섹션에서 .TRANSFORMED.xyz 파일이있는 디렉토리에 전체 경로 이름을 식별합니다. 이 스크립트는 구조의 크기 및 형상을 정량화하는데 사용될 수있다 (802) 준 최적를 식별한다. </li></ol>

<ol><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.anthro.34.081804.120613">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li>
<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlice%2C+DE+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. 6, Springer. (2005).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , 2nd, Elsevier. (2012).</li>
<li>Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBookstein%2C+F+%22Morphometric+tools+for+landmark+data%3A+geometry+and+biology%22">Morphometric tools for landmark data: geometry and biology</a>. , Cambridge University Press. (1991).</li>
<li>Rohlf, F. J., Marcus, L. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21236128">A Revolution in Morphometrics.</a> Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).</li>
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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

위의 프로토콜의 중요한 단계는 1) bacula를 해부하고, 2) microCT 이미지를 수집, 3) XYZ의 플랫 파일에 microCT 출력을 변환, 4) 각 시편의 점 구름을 분할 좌표, 5)에 각각의 시료를 변환 표준화 좌표계, 6) 반 랜드를 형성 할 수있다. 이러한 단계는 용이하게 다른 물체를 수용하도록 수정된다. 이러한 방법은 가능성도 곡선 적어도 본질적으로 &quot;막 대형&quot;, 또는 임의의 객체에 적용 할 수있다. 그 뒤로 그 자체에 곡선 개체 (그림 1G)를 슬라이스하는 객체의 다른 부분에서 포인트를 반환하기 때문에 &quot;U 자형&quot;은 현재, 분석 할 수 없습니다 될 수 있습니다. 이러한 객체는 계산 전에 슬라이스에 개체를 교정하여 미래에 수용 될 수있다. 우리의 부족 모양에서 수학적으로 정의 세미 랜드 마크에 대한 일반적인 방법을 제시올 리드 랜드 마크. ...

morphometrics의 필드 크기 및 생물 형태의 모양, 과학 탐구 1, 2, 3, 4, 5, 6에 기초하는 단계를 정량화하는 방법의 다양성을 포함한다. 전통적으로, 크기 및 형태의 통계적 분석은 생물학적 최적 구조를 식별하고 다변량 분석 워크 수 직선 거리, 각도 및 비율을 측정함으로써 시작된다. 랜드 마크 기반의 기하학적 Morphometrics 분석 및 시각화 (5)를 통해 데이터 수집에서 기하학적 정보를 보존, 랜드 마크의 공간 위치를 유지 접근 방식이다. 일반화 된 프로크루스테스 분석 (GPA)이 있어요 표본 사이의 정렬을 생산하기 위해 위치, 규모 및 랜드 마크의 회전에 변화를 제거하기 위해 적용 할 수 있습니다자신의 제곱의 차이를 inimizes - 무엇을 유지하는 형상 유사성 (7)이다. 어떤 형태 계측 학적 분석의 중요한 개념은 동성, 또는 하나가 안정적으로 표본 또는 구조 사이에 해당하는 생물학적 의미 및 이산 기능을 대표하는 랜드 마크를 식별 할 수있는 생각이다. 예를 들어, 인간의 두개골 형태 계측 학적 분석을 활성화 할 수 있습니다 상동 프로세스, foramina, 봉합 및 덕트가 있습니다. 불행히도, 대응하는 최적의 식별은 평활 표면 또는 곡선 8, 9, 10, 특히 많은 생물학적 구조 걸쳐 어렵다. 우리는 계산 기하학을 사용하여 아래이 문제를 접근. 일반적인 워크 플로는 모든이야 있도록 그 점 구름을 점 구름으로 표현 될 수있는 물체의 3 차원 스캔을 생성 한 다음 회전 변환하는 것입니다pecimens는 공통 좌표계의 방향. 그 다음 우리는 수학적 개체의 특정 지역에서 세미 랜드 마크를 정의합니다. 같은 지역에 배치 이산 세미 랜드 마크 (11) 생물학적으로 임의의 수 있습니다. 임의로 배치 랜드 마크가 생물학적으로 상동하지 않을 수 있기 때문에 GPA 이후의 통계 분석을 실시하는 것은 바람직하지 않은 유물 8, 12을 생성 할 수 있습니다. 따라서 우리는 이러한 반 랜드 마크가 수학적으로 &quot;슬라이드&quot;에 있습니다. 이 절차는 구조물과의 전위차를 최소화한다. 다른 곳에서 논의 된 바와 같이 여기에 사용되는 알고리즘 슬라이딩 부족 유사한 해부학 적 영역을 정량화하는 것이 적절하다 쉽게 최적 3, 6, 8, 10, 11, 12에 대응하는 식별. 이 방법은 리튬이mitations (13),하지만 서로 다른 크기와 모양의 객체에 적용 할 수 있어야합니다. 여기, 우리가이 방법은 마우스 음경 골 (14)의 최근 연구에 적용된 방법을 설명, 얻고 포유 동물의 진화 15시에 여러 개의 독립적 번 손실 된 음경의 뼈. 우리는 절개 특정 뼈의 제조 상기 음경 골 (프로토콜 1) microCT 이미지의 생성 (프로토콜 2) 모든 다운 스트림 계산 기하학을 가능하게하는 형식으로 이러한 이미지 변환 논의 (프로토콜 3, 4). ~ 100K의 XYZ 좌표에 의해 다음 단계 후, 각 시편 표시됩니다. 우리는 다음을 효과적으로 공통의 방향에 모든 검체 (프로토콜 5) 정렬 변환의 시리즈를 통해 도보로, 다음 정렬 표본 세미 랜드 마크 (프로토콜 6)를 정의합니다. 프로토콜 1-4에 관계없이 객체가 분석되는 유사해야합니다. 프로토콜 5 및 의정서 6 SPE 있습니다cifically 음경 골을 위해 설계,하지만이 단계를 자세히 설명하여 연구자가 관심을 자신의 객체에 대한 중요한 것 수정을 상상할 수있는 우리의 희망입니다. 예를 들면, 이러한 방법의 변형은 고래 골반 뼈와 뼈 리브 (16)를 연구하기 위해 적용 하였다.

<table><tbody><tr><td>해부 가위</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>대부분의 크기가 작동해야 합니다</td></tr><tr><td>해부 집게, 미세 팁, 곡선</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>해부를 위해 70 %로 희석</td></tr> 플로<tr><td>럴 폼</td><td>도매 플로럴</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>uCT50 스캐너&nbsp;</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, 스위스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

음경 골의 해부, microct 스캔 및 형태 학적 분석

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

현대 morphometrics는 크기와 모양 변화를 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 기본 요구 사항은 랜드 마크를 정의하는 좌표의 목록입니다; 그러나 이러한 좌표는 표본에서 상동 구조를 표현해야합니다. 많은 생물학적 개체 동성의 가정을 만족시키기 쉽게 식별 최적 구성되어 있지만, 많은 그러한 구조물이 없다. 하나의 잠재적 인 솔루션은 표본에서 동일한 형태 학적 영역을 나타내는 개체에서 발생하는 세미 랜드 마크를 수학적으로하는 것입니다. 여기, 우리는 수학적으로 마우스 음경 골 (음경 뼈) 세미 랜드 마크를 정의하기 위해 최근에 개발 된 파이프 라인을 보여줍니다. 우리의 방법은 개체의 넓은 범위에 적용될 수 있어야한다.

프로토콜 (6)에서 생성 된 세미 랜드 마크의 XYZ 좌표는 직접 랜드 마크 기반의 기하학적 morphometrics 분석 (17)로 가져올 수 있습니다. 연산 파이프 라인은 상기 마우스 bacula (14)뿐만 아니라 고래 골반 뼈와 리브 (16)를 연구하기 위해 적용되었다. 세미 랜드 마크의 계산 정의에 대한 자세한 내용은 연구자들이 관심을 자신의 특정 개체를 수용하기 위해 수정 될 수 있습니다 단계를 시각화하기위한 시도로, 여기에 표시됩니다. 음경 골은 특정 변환을 자동화하는 데 악용 된 몇 가지 독특한 기능이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 계산 - 근위 말단부 축을 따라 두 개의 절반으로 뼈를 절단 한 후, 우리는 단순히 총 포인트 수 (근위 더 있음)과 비교하여 근위 절반 식별. 한 이와 같은 독특한 기능이 존재하는 한, 우리의 방...

많은 생물학적 구조 어려운 현대 형태 계측 학적 방법을 적용 할 수있어 쉽게 정의 최적 부족하다. 여기에서 우리는 크기를 정량화하고 변화를 형성하는 데 사용되는 세미 랜드 마크를 정의하는 계산 방법 다음 해부 및 microCT 스캔을 포함하여 마우스 음경 골 (음경의 뼈), 공부하는 방법을 설명한다.

음경 골의 해부, MicroCT 스캔 및 형태 학적 분석

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

이 해부 및 형태측정 분석의 전반적인 목표는 생쥐의 음경골과 같이 복잡한 형태를 가진 구조를 연구함에 있어 본 형태측정 방법론의 견고함을 입증하는 것입니다. 우리는 길이나 너비 치수를 측정하는 것과 같은 기존의 baculum 변이 측정 방식이 곡률과 형태의 복잡성에 대한 모든 정보를 소실한다는 점을 깨닫고 이 연구에 대한 아이디어를 처음 얻었으며, 이에 따라 관심 있는 모든 뼈나 구조의 크기 및 형태 변이를 3차원으로 정량화하는 이 방법을 고안하였습니다. 이 기술의 주요 장점은 랜드마크가 없는 구조에 현대적인 형태측정학을 적용할 수 있다는 점입니다.이는 복잡한 구조에 대해 개선된 반복 측정 방법을 제공함으로써 해당 분야를 발전시킬 것입니다. 안락사시킨 성성숙 수컷 마우스를 등으로 눕히고, 전정 개구부의 외측에 엄지손가락으로 압력을 가하여 음경을 돌출시킵니다. 음경이 나오면, 전정 피부를 통해 조직을 가능한 한 멀리 확장합니다.다음으로, 가위를 사용하여 baculum이 위치한 귀두 근위측의 음경체를 절단하여 음경을 분리합니다. 그런 다음 마이크로원심분리 튜브에 담긴 약 200 µL의 수돗물에 음경을 완전히 침전시킵니다. 조직을 연화시키기 위해 약 50 °C에서 3~5일 동안 배양합니다.조직 연화 처리는 발거 중 뼈가 파손될 가능성을 줄여줍니다. 배양 후, 해부 현미경과 포셉을 사용하여 baculum 주변의 조직 대부분을 제거합니다. 육안 해부 후, 70% 에탄올을 가볍게 분사하여 남은 조직을 밀어내고 뼈를 세척합니다.그런 다음 적출한 음경골을 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, 캡을 연 채로 실온에서 뼈를 건조시킵니다. 우선 뼈를 배치할 재료를 준비합니다. CT 스캔용 원통형 홀더를 플로리스트용 폼 벽돌에 눌러 고정합니다.그 다음 결과물인 원통형 폼을 꺼내어 2에서 5cm 두께의 폼 조각으로 자릅니다. 이제 스캔 중 간섭을 최소화하기 위해 개별 조각의 주변부에 건조된 bacula 10~15개를 플로리스트 폼에 꽂습니다. 추후 식별을 위해 뼈의 정확한 방향을 기록해 둡니다.다음으로, 폼에 고정된 뼈를 micro CT 홀더에 조심스럽게 넣고 홀더를 micro CT 50 스캐너에 장착합니다. micro CT 50 스캐너를 다음과 같이 설정합니다. 90 kilovolt pascals, 155 angstroms의 복셀 크기, 5 milliliter 알루미늄 필터, 180도당 750회의 투영, 그리고 500 millisecond의 노출 시간을 사용합니다.그런 다음 검체를 스캔하십시오. Baculum 뼈는 설명된 프로토콜에 따라 절제, 준비 및 스캔되었습니다. 많은 수의 뼈를 하나의 CT 스캔에 함께 넣을 수 있습니다.그 후 이미지들은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 계산 기하학을 사용하여 처리되었습니다. 이 이미징 프로세스는 광범위한 뼈 및 기타 관심 대상의 연구에 적용 가능할 것입니다. 이 분석은 대상의 랜드마크 특징에 대한 상세한 정보를 제공하며 고도로 자동화되어 있습니다.이 과정은 369개의 bacula를 분석하는 동안 약 10회의 수동 조정만 필요했습니다. 고무적인 점은 우리의 방법이 매우 다양한 복잡한 구조에 적용될 수 있다는 것입니다. 이러한 방법들을 통해 우리는 baculum의 크기와 모양을 3차원으로 정량화할 수 있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

이 프로토콜은 Hematoxylin-Eosin(HE) 염색과 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT) 기술을 결합하여 골다공증 마우스 모델에서 뼈 미세구조의 정량적 평가를 위한 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

골다공증 마우스 모델에서의 섬유주 뼈 미세구조 평가

여기에서는 마이크로컴퓨터 단층촬영을 기반으로 하는 방법을 자세히 설명하여 마우스의 두개악안면뼈의 3D 모델을 분할하고 측정하여 현재 방법으로 가능한 것보다 마우스의 두개악안면뼈 발달을 더 잘 평가할 수 있습니다.

3차원 마이크로컴퓨터 단층촬영을 사용한 마우스의 두개악안면 기형 분석

우리는 다양한 계층적 수준에서 뼈 재생을 평가하는 프로토콜을 제안합니다. 이 다중 모달 접근법은 다양한 길이 척도에서 구조 분석을 가능하게 하여 시료 준비의 문제를 효과적으로 해결합니다. 또한 생체 재료가 뼈 재생을 촉진하는 효과를 평가하는 신뢰할 수 있는 워크플로우를 제공합니다.

골 재생 및 스캐폴드 성능 평가를 위한 다중 모드 접근법

배우세요 생쥐 음경 골의 해부 및 MicroCT 스캔을 통한 형태 측정 분석법입니다. 랜드마크가 없는 복잡한 구조의 3차원 크기와 형태 변화를 정량화하여 생물학적 형태측정 연구의 정확성과 재현성을 향상시킵니다.

음경 골의 해부, MicroCT 스캔 및 형태 학적 분석

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