Name: Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 학습하세요 이미징 유세포측정법을 사용하여 인간 T세포와 항원제시세포 간 면역 시냅스를 정성적 및 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 정제되지 않은 인간 T세포를 생체 외에서 신속하게 분석할 수 있어 면역학 연구에 활용됩니다.

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작품 번호 보조금 독일 연구 위원회 (DFG)에 의해 투자 되었다 SFB-938-M 고 SA 393/3-4.

1입니다. 팬 백혈구의 준비
<ol><li>Heparinized 주사기에 건강 한 기증자 (또는 환자)에서 말 초 혈액의 1 mL를 그립니다. 헌 혈에 대 한 책임 윤리 위원회에 의해 승인 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>믹스 1 mL의 인간 주변 혈액을 30 mL 50 mL 튜브에 ACK 세포의 용 해 버퍼 (150mm NH4Cl, 1 mM KHCO3, 그리고 0.1 m m EDTA, pH 7.0)와 고 실 온에서 8 분 동안 품 어.</li>
	<li>PBS와 6 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기 튜브와 ACK 세포의 용 해 버퍼의 30 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>1.2와 1.3 단계를 반복 하는 상쾌한 분명 하다. 마지막으로, PBS, 실 온에서 6 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기에에서 셀을 세척 하 고 문화 매체 (RPMI1640 + 10 %FCS) 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 60 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.</li>
</ol>2. 로드 들의 삶 문의 세 브와 셀
<ol><li>1.5 x 10 2 개의 15 mL 송 골 매 관 관 당6 들의 삶 문의 셀을 준비 합니다. 셀 (300 x g 6 분 실 온에서) 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>잔여 중간에 셀 resuspend (약 50-100 µ L), 1.9 µ µ (1.9 G) L 추가 셉, 그리고 15 분 추가 5 mL의 문화 매체에 대 한 실 온에서 품 어, 셀 (300 x g 실 온에서 6 분), 아래로 회전 및 문화 매체 (RPMI에에서 펠 릿 resuspend 1640 + 10 %FCS) 1 x 106 셀/mL의 조밀도에.</li>
</ol>3. 면역 시 냅 스 및 프로토콜을 얼룩이 지기의 유도
<ol><li>FACS 튜브로 셉 로드 들의 삶 문의 셀의 준비 및 다른 FACS 튜브로 역된 들의 삶 문의 셀의 준비의 500 µ L의 500 µ L 플라스틱 각 튜브와 셀 (실 온에서 10 분 동안 300 x g) 아래로 회전 팬 백혈구의 650 µ L를 추가 합니다. 삭제는 상쾌한 고 문화 매체 (RPMI1640 + 10 %FCS)의 150 µ L에 펠 릿을 resuspend. 37 ° C (일반적으로 45 분)에서 품 어.</li>
	<li>부드럽게 소용돌이 셀 (10 s 1000 rpm에서) 셀을 해결 하기 위해 소용돌이 동안 paraformaldehyde (1.5%)의 1.5 mL를 추가. 1 mL의 PBS + 1 %BSA 추가 하 여 고정을 중지 합니다. 작은 셀 (300 x g 실내 온도 물의 resuspension PBS + 10 분 동안 실내 온도에 잠복기 후 1 %BSA 1 mL에 셀 펠 릿에서 10 분.</li>
	<li>펠 렛 (300 x g 실 온에서 10 분 동안) 및 세포를 permeabilize PBS + 1 %BSA + 실 온에서 15 분 동안 0.1% 사포닌 100 µ L 셀 resuspend (96-잘 플레이트, U 모양).</li>
	<li>PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌 원심 (300 x g 실 온에서 10 분)와 셀을 세척 하 고 PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌 fluorophore 분류 항 체 또는 화합물 (CD3-PE-TxRed (1:30), 포함 된 50 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend Phalloidin-AF647 (1:150), 그리고 DAPI (1:3, 000)).</li>
	<li>품 어 30 분 세척에 대 한 어둠 속에서 실 온에서 셀 셀 3 회 PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌의 1 mL을 추가 하 여. 실 온에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심. Re-resuspend 이미징 cytometry에 대 한 PBS의 60 µ L에 셀.</li>
</ol>4. 이미지 수집 교류 Cytometer를 사용 하 여
참고: 다음 이미지 수집 절차 및 데이터 분석 이미징 cytometry imagestream (IS100), 영감, 그리고 아이디어와 같은 소프트웨어를 사용 하 여 기반으로 합니다. 그러나, 다른 흐름 cytometers 및 분석 소프트웨어 또한 사용할 수 있습니다.
<ol><li>영상 교류 cytometer에 연결 된 컴퓨터에 분석 소프트웨어 열고 초기화 응용 악기 메뉴의를 클릭 합니다. 구슬 그렇게 할 것인지 묻는 메시지가 나타나면 올바른 포트에 적용 됩니다.</li>
	<li>파일 메뉴에서 기본 서식 파일을 로드 하 고 실행/설치를 클릭 하십시오. 구슬 보기 드롭다운 메뉴에서 선택 합니다.</li>
	<li>지정 된 값이 200 강도 설정를 클릭 하 여 필드 밝은 조명 기를 조정 합니다.</li>
	<li>보정을 실행 하 고 모든 시작을 클릭 하 여 지원 탭에서 루틴을 테스트.</li>
	<li>플러시/잠금/부하에 클릭 하 고 그렇게 하 라는 메시지가 나타나면 왼쪽된 포트에 샘플을 적용. 교류 cytometer 세포를 로드 한 후 셀 분류자 열고 값을 다음과 같이 조정: 각 채널, 피크 강도 낮은 제한 50 채널 2 (DAPI) 및 채널 5 (CD3-Pe-TxR), 50에서 지역 더 낮은 제한에 대 한 1,022에서 피크 강도 상한값 채널 1 (사이드 분산형), 및 1, 500에 상한.</li>
	<li>405는 레이저 전원을 변경 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), 그리고 647 nm (90 mW) 설정 탭에서.</li>
	<li>보기 드롭다운 메뉴 셀 분류자 및 레이저 전원 조정 평가 셀 구슬 사이 전환 합니다. 참고: 모든 셀 및 셀 커플 셀 보기 발견 되 고 그 세포 덩어리, 파편, 및 포화 픽셀 이미지에서에서 있다 파편 보기 셀 분류자 및 여기 레이저 능력을 변경 하 여 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>설치 탭 클릭 실행/설치 취득 하려면 샘플 이름 및 이미지 (15000-25000 샘플에 대 한)와 보상 컨트롤에 대 한 500를 정의 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>데이터 분석 컴퓨터에 raw 이미지 파일 (.rif)를 전송 및 분석 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>보상 드롭다운의 지침에 따라 보상 매트릭스를 생성 합니다. Comp_Date.ctm로 보상 매트릭스를 저장 합니다.</li>
	<li>샘플 raw 이미지 파일 (.rif)를 열고 보상된 이미지 파일 (.cif) 및 기본 데이터 분석 파일 (.daf)을 생산 하 고 나타나는 창에서 comp_Date.ctm를 적용 합니다.</li>
	<li>보상된 이미지 파일을 엽니다. 이미지 색상 모드로 변환 하 고 이미지 갤러리 속성 도구 모음에서 최적의 표시 색상을 얻기 위해 조회 테이블을 조정 합니다. 복합 이미지 갤러리 속성 도구 모음 탭을 사용 하 여 RGB 병합 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>
분석에서 마스크 관리자를 엽니다. T 세포와 면역 시 냅 스를 다음과 같이 정의 하는 마스크를 만듭니다.
	<ol>
<li>T-셀 마스크를 선택: "(작성 (Threshold_Ch05, 60)." 계곡 마스크를 선택: "Valley(Ch02,3)" T-세포 시 냅 스 마스크를 선택: "T-셀 마스크와 밸리 (M02, Ch02, 3)."</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분석에서 기능 관리자를 엽니다. 다음과 같은 기능을 계산:
	<ol>
<li>T 세포의 총 CD3 식 선택 "Intensity_T-cells_Ch5." T 세포에서 F-말라의 총 금액에 대 한 선택 "Intensity_T-cells_Ch6." CD3 식 면역 시 냅 스에, "Intensity_T-셀 synapse_Ch5." 선택 F-말라 면역 시 냅 스에, 양을 선택 "Intensity_T-셀 synapse_Ch6."</li>
		<li>T-셀 영역을 계산 하려면 선택 "Area_T-셀." T 세포 면역 시 냅 스 영역을 계산 하려면 "Area_T-셀 시 냅" 선택</li>
	</ol>
</li>
	<li>기능 관리자에서 방정식을 사용 하 여 F-말라와 면역 시 냅 스에서 CD3 농축을 확인 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55345/55345eq1.jpg">
</li>
	<li>
히스토그램을 사용 하 여 다음과 같은 제어 전략을 적용 하 고 점 (대 한 더 자세한 내용은, 참조 참조 17 및 19) 분석 영역에서 플롯:
	<ol>
<li>히스토그램; "그라데이션 RMS_M2_Ch2"을 그려서 초점 아웃 셀 삭제 15에서 임계값을 설정 합니다.</li>
		<li>점 작의에서 CD3 강도 대 SSC를 플롯 합니다. CD3 양성 이벤트에 대 한 게이트를 설정 합니다.</li>
		<li>M02의 "화면 비율" 플롯 (DAPI 얼룩) M02 영역 대 (Dapi 얼룩). T-셀 singlets 및 셀 게이트 따라 커플. 사실 셀 커플17,19위에서 설명한 대로 냅 마스크 영역을 사용 하 여 수정 합니다.</li>
		<li>F-말라 singlets T-세포와 T 세포 T-셀/APC 커플의 금액과 면역 시 냅 스에 F 걸의 %를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+Costimulation%3A+From+Mechanism+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li>
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<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421(2012).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
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<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
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<li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 제시 된 워크플로 (ex vivo) 인간 T 세포와 APCs 사이 면역 시 냅 스의 정량화를 수 있습니다. 특히, 팬-백혈구 적혈구 lysed 불가결 T 세포 정화 단계를 만드는 T-셀 원본으로 사용 되었다. B-세포 림프 종 세포 라인 들의 삶 문의 대리 APCs 역임 했습니다. 면역 시 냅 스의 T-세포의 혈액 기증자 사이 비교 수 있기 때문이 맺는 중요 한 이점이 다. 또한, 헌 Dc 거의 주변 인간의 혈액에서 직접 사용할 수 있습니다. Monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDCs)의 생산 도전 임상 연구에 응용 프로그램을 만드는 몇 일 걸립니다. 그러나, 다른 Apc (예:, transdifferentiated neutrophils)20이미징 cytometry와 여기에 제시 된 분석 전략을 적용할 수 있습니다. 또한, 그것은 CD4 T 세포 사이 ex vivo Dc9 또는 B 세포<sup class="xre...

T 세포는 적응 면역 시스템의 주요 규제 하 고 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC)의 맥락에서 제시 하는 항 원 펩 티 드를 통해 활성화 됩니다. 전체 T 세포 활성화 필요 2 개의 신호, 항 원 특정 T 세포 수용 체 (TCR)를 통해 능력 신호 / CD3 복합물 및 액세서리 수용 체를 통해 costimulatory 신호. 두 신호는 항 원 제시와 T 세포의 직접적인 상호 작용을 통해 생성 된 세포 (Apc). 성숙한 APCs MHC 펩 티 드 복합물을 통해 T 세포 활성화에 대 한 적성 신호를 제공 하 고 그들은 costimulatory ligands 표현 (예:, CD80 또는 CD86) T 세포 활성화1의 진행을 보장 하기 위해서. Costimulation의 1 개의 중요 한 기능 말라 골격2,,34의 재배치입니다. 대뇌 피 질의 F 걸 T 세포 휴식에서 상대적으로 정적입니다. 항 원-베어링 APCs 통해 T 세포 자극 말라 골격의 심오한 재배치에 지도 한다. 말라 역학 (즉,, 빠른 걸 합/depolymerization 원) T 세포를 만드는 단백질 이나 세포, 예를 들어 전송 하는 데 사용 되는 힘을 사용 합니다. 또한, 말라 골격은 T 세포 및 면역 시 냅 스 라고 하는 APCs 사이 특별 한 연락처 영역을 개발 하기 위한 중요 합니다. 면역 시 냅 스를 말라 골격의 중요성 때문에 그것은 T 세포5,6,,78 의 말라 골격에 변화를 측정 하는 방법을 개발 하기 위해 필수적인 되고있다 , 9.
말라 cytoskeletal 원조에 의하여 표면 수용 체와 신호 전달 단백질 supramolecular 활성화 클러스터 (SMACs) 면역 시 냅 스 내에서 차별 됩니다. 면역 시 냅 스의 안정성은 말라 골격의 신축성을 증가 하는 F-말라 번들에 수용 체의 바인딩을 의해 보장 됩니다. 면역 시 냅 스 형성은 적응형 면역 반응의 생성에 대 한 중요 한 것을 보였다. Vivo에서 결함이 있는 면역 시 냅 스 대형의 해로운 효과 했다 깨 달 았에서 Wiskott 올드 리치 증후군 (WAS), 어떤 걸 중 합에는 질병을 고통 받아 환자에서 면역 시 냅 스 형성을 방해 하는 수반, 그리고10 . 환자는 습 진, 심한 재발 성 감염, 자가 면역 질환, 그리고 정면을에서 고통을 수 있습니다 했다. 이 발견에도 불구 하 고 그것은 현재 알 수 없습니다 면역 결함 또는 자가 면역 질환으로 고통 받는 환자와 건강 한 개인의 T 세포에서 면역 시 냅 스 형성 다릅니다 여부.
형광 현미경 검사 법, confocal 포함, TIRF, 및 최고 해결책 현미경 검사 법, 면역 시 냅 스11,12,,1314의 아키텍처를 밝히기 위해 사용 되었다. 이러한 시스템의 높은 해상도 라이브 셀 이미징 수행 가능성 말라 골격과 면역 시 냅 스에 표면 또는 세포내 단백질에 대 한 정확한, spatio 시간적 정보 수집 수 있습니다. 그러나 많은 결과, 몇 수십 T 세포의 분석에 근거한 다. 또한, 이러한 유형의 형광 현미경 검사 법에 대 한 T 세포를 정화 해야 합니다. 그러나, 많은 연구 질문에 대 한 unpurified 셀 보다는 가능한 가장 높은 해상도의 사용은 매우 중요. 이것은 환자에서 T 세포는 분석 때문에 헌 혈 된 혈액의 양을 제한 하 고 동시에 많은 샘플을 처리할 필요가 있을 수 있습니다 하는 경우 이다.
우리 인간의 시스템15,,1617면역 시 냅 스에 걸 골격의 분석을 허용 하는 현미경 방법을 설립 했다. 이러한 메서드는 흐름에 현미경18라고도 cytometry 이미징 기반으로 합니다. Multispectral 흐름 cytometry 및 형광 현미경 사이의 하이브리드, cytometry 이미징 장점이 그것의 형태학 매개 변수 및 다른 유형의 세포 인구에서 팬 백혈구 등에서 단백질 지역화 분석에 주변 혈액입니다. 우리는 우리가 시간과 비용이 많이 드는 정화 단계17의 필요 없이 전체 혈액 샘플에서 인간 T 세포의 T-셀/APC 어원이 같은 말에 F-말라를 계량 수 있습니다 하는 방법 소개. 여기에 제시 된 기술은 면역 시 냅 스에 F 걸의 정량화를 혈액 샘플에서 전체 워크플로 구성 되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>>Multifuge 3 SR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>LifeTechnologies</td><td>#11875085</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Pan Biotech#3302-P101102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 원형 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>#352054</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Kulturflasche</td><td>Thermo Scientific</td><td>#178883</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Roth</td><td>#8076.3</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#16005</td><td></td></tr><tr><td>FACS 워시 사포닌</td><td></td><td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td><td></td></tr><tr><td>ReaktiosgefaB</td><td>Sarstedt</td><td>72.699.002</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>스피드 비드</td><td>Amnis</td><td>#400041</td><td></td></tr><tr><td>미니쉐이커 MS1</td><td>IKA Works</td><td>&nbsp; MS1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Greiner Bio One</td><td>#650101</td><td>96U</td></tr><tr><td>엔테로톡신 SEB</td><td>시그마 알드리치</td><td>S4881</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마 알드리치</td><td>D9542</td><td>1:3000</td></tr><tr><td>CD3-PeTxR</td><td>인비트로겐</td><td>MHCD0317</td><td>1:30</td></tr><tr><td>팔로이딘-AF647</td><td>분자 프로브</td><td>A22287</td><td>1:150</td></tr><tr><td>IS100</td><td>Amnis</td><td></td><td>이미징 유세포 분석기</td></tr><tr><td>IDEAS</td><td>Amnis</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>INSPIRE</td><td>Amnis</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr></tbody></table>

cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

면역 시 냅 스는 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) 간의 통신의 영역입니다. T 세포 표면 수용 체와 안정적인 바인딩을 확신 하 고 교류 신호를 면역 냅으로 단백질 분극. 클래식 confocal, TIRF, 또는 슈퍼 해상도 현미경 면역 시 냅 스 연구에 사용 되었습니다. 때문에 이러한 방법을 사용 하려면 수동 이미지 수집 및 시간이 걸리는 정량화, 드문 이벤트의 영상 도전 이다. 여기, 우리 세포의 수천 수만의 형태소 분석을 가능 하 게 워크플로 설명 합니다. 면역 시 냅 스는 Apc로 팬 백혈구 준비에 기본 인간 T 세포와 황색 포도상구균 enterotoxin B 셉 로드 들의 삶 문의 세포 사이 유도. 이미지 수집 이미징 cytometry 라고도 흐름에 현미경 검사 법, 교류 cytometer 및 형광 현미경의 기능을 결합 하 여 수행 됩니다. T 세포/APC 커플 식별 하 고 분석 하는 면역 시 냅 스에 대 한 완전 한 제어 전략은 제공 됩니다. 면역 분석 unpurified 팬-백혈구 준비에 synapses 하며 따라서 작은 양의 혈액이이 허용 (즉,, 1 mL), 환자에서 샘플에 적용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 여러 샘플 준비, 측정, 고 병렬로 분석.

여기서 설명 하는 방법의 주요 목표는 단백질 농축의 정량화 (예:, F-말라) 사이 면역 시 냅 스에서 대리 Apc (셀 들의 삶 문의)와 낮은 볼륨 (1 mL) 인간의 혈액 샘플에서 가져온 unpurified 팬 백혈구에 T 세포. 그림 1 의 스크린샷은이 방법의 중요 한 제어 전략에 대 한 개요를 제공합니다. 그것은 왼쪽 및 오른쪽 (그림 1)의 분석 영역에 이미지 갤러리를 보여줍니다. 이미지 갤러리 "에 초점" 게이트를 보여줍니다. 묘사 된 이미지는 주로 granulocytes 그리고 두 T-셀/APC 커플. F-말라와 CD3 셀 몇 수 30272 농축 됩니다. 셀 커플 같은 농축의 양을 계량 제어 전략 분석 영역에 표시 됩니다 및 프로토콜에서 설명 하는 (단계 5.8 참조) 또는 다른17,19<...

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

이 방법은 백혈구 사이의 통신이 분자 및 세포 수준에서 발생하는 방법과 같은 인간 면역 학적 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무정제 인간 T 세포가 비교적 짧은 기간 동안 ex vivo를 분석할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 헤닝 Kirchgessner 될 것입니다.50 밀리리터 원뿔관에 30 밀리리터의 ACK 용해 완충제와 갓 뽑은 인간 말초 혈액 1밀리리터를 혼합하여 시작합니다. 실온에서 8분 후, 원심 분리 세척을 위해 PBS로 튜브를 채우고 37°C에서 60분 동안 배양 배지 2밀리리터로 펠릿을 재보냅니다. 인큐베이션이 끝나면 500마이크로리터의 개별 FACS 튜브에 배양 배지의 500마이크로리터에 제5차 황색포도상구균 B 또는 SEB 장전 또는 언로드 라지 세포에 5회 10번 추가한 다음, 650마이크로리터의 팬백세포를 첨가한다.공동 배양을 회전시키고, 37섭씨에서 45분 간 잠복할 수 있도록 신선한 배양 배지의 150마이크로리터에서 펠릿을 재보선한다. 그런 다음 100 rpm에서 10 초 동안 세포를 부드럽게 소용돌이치면서 1.5 % 파라 포름알데히드의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 실온에서 10 분 후, 1 %BSA로 보충 된 PBS의 1 밀리리터로 고정을 중지하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.PBS 플러스 BSA 및 0.1% 사포닌의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 96-well, U-바닥 플레이트의 두 개의 개별 우물에 세포 샘플을 추가합니다. 실온에서 15분 후, 플레이트를 원심분리하고 PBS 의 50 마이크로리터에 펠릿을 재분배하고 실온에서 어둠 속에서 30분 동안 용해된 형광구 공주 항체 또는 화합물을 포함하는 BSA 및 사포닌의 마이크로리터로 펠릿을 재연한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 플러스 BSA 및 사포닌의 150 마이크로리터에서 세포를 세 번 세척하고 PBS의 60 마이크로리터에서 펠릿을 재보종합니다.흐름 세포측정에 의해 셀을 이미지하려면 분석 소프트웨어를 열고 액체 수준을 확인하고 악기 메뉴에서 시작을 클릭합니다. 다음으로 로드를 클릭하고 메시지가 표시되면 샘플을 포트에 로드합니다. 조명 탭에서, 적절한 나노 미터 길이에 여기 레이저 전력을 변경합니다.그런 다음 채널 4및 11의 게이트를 조정하고 채널 1의 영역을 조정합니다. 게이팅 및 레이저 전원 조정을 평가하려면 View 메뉴를 각 게이트로 전환하고 셀과 셀 커플이 표시될 때까지 게이트 및 레이저 전원을 조정합니다. 그런 다음 파일 수집 탭에서 수집할 샘플 이름과 이미지 수와 CD3 염색에 적합한 게이트를 정의하고 인수를 클릭하여 인수를 시작합니다.획득한 셀 이미지를 분석하려면 적절한 분석 소프트웨어를 엽니다. 보상 드롭다운의 지침에 따라 보정 행렬을 생성하고 매트릭스를 컴포지션 날짜 ctm로 저장합니다. 다음으로 샘플 원시 이미지 파일을 열고 창에 컴프 날짜 ctm을 적용하여 보정된 이미지 및 기본 데이터 분석 파일을 생성합니다.보정된 이미지 파일을 연 후 이미지를 색상 모드로 변환합니다. 조회 테이블을 조정하여 이미지 갤러리 속성 도구 모음에서 최적의 가시 색상을 가져옵니다. 분석 메뉴에서 마스크 관리자를 열고 채널 5용 60%임계값 마스크를 선택하고 마스크를 채우고 T 셀 마스크를 작성하여 T 셀 셀을 정의합니다.다음으로, 밸리 마스크를 만들기 위해 3 픽셀의 폭으로 채널 2에 대한 밸리 마스크를 선택하고 T 셀과 밸리 마스크를 결합하여 T 셀 시냅스 마스크를 만듭니다. T 셀에서 총 CD3 식을 계산하려면 피처 관리자를 열고 피쳐 강도, T 셀, 채널 5를 만듭니다. T 셀에서 F-actin의 총 양을 계산하려면 피쳐 강도, T 셀, 채널 6을 만듭니다.면역 시냅스에서 CD3 양을 평가하려면 피쳐 강도, T 셀 시냅스, 채널 5를 만듭니다. 면역 시냅스에서 F-actin의 양을 결정하려면, 기능 강도, T 세포 시냅스, 채널 6을 만듭니다. 마지막으로, F-actin 및 CD3 농축을 정의하기 위해, 면역 시냅스에서 F-액틴 또는 CD3의 비율과 선택된 단백질의 총 발현을 각각 계산한다.이들 그래프에서, 대리 항원 제시 세포, 또는 AFC 사이의 면역 시냅스에서 단백질 농축을 정량화하기 위한 중요한 게이팅 전략의 개요, 그리고 낮은 부피 인간 혈액 샘플에서 채취한 무정제 범류세포에서 T 세포가 나타난다. 여기서, T세포-APC의 대표적인 이미지는 SEB의 부재 시내에 있는 CD3 및 F-actin의 낮은 수준을 가진 공자, 이러한 T세포-APC 컨쥬게이트는 SEB의 존재에 강한 CD3 및 F-actin 농축을 보여줍니다. 초항제의 부재에서, T 세포의 15%는 면역 시냅스에서 CD3와 F-actin 의 농축을 나타내고, 반면 29%의 농축은 초안티겐의 존재에서 관찰된다.실제로, 초항제가 없는 경우, 세포내 총 F-actin의 20% 미만이 면역 시냅스에서 축적되고, 초대형항성원이 있는 시냅스에서 30% 이상이 관찰된다. 특히, CD3는 초항제가 없는 경우에도 면역 시냅스에서 축적되지만, 이러한 축적은 또한 수퍼안티겐의 첨가에 의해 현저하게 증가하지만, T세포-APC 면역 시냅스에서 단백질 축적을 정량화하는 이 방법의 적합성을 입증한다. 일단 마스터되면 제대로 수행하면 6~7시간 안에 이 기술을 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 단백질 농축은 또한 SEB없이 APC를 사용하는 경우에 생깁니다, 초항제없이 견본을 포함하여 모든 관련 대조를 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 초해상도 현미경 검사법과 같은 다른 방법은 면역 시냅스의 미세 한 구조에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 기본적인 연구, 임상 시험 및 번역 과학을 위한 인간에 있는 면역 시냅스를 탐구하기 위하여 세포 통신의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.이 비디오를 본 후, 당신은 인간 T 세포 ex vivo에서 T 세포-APC 결합 영역 및 면역 시 냅 스를 분석 하는 방법의 좋은 이해 해야. 1차 인간 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 장갑을 착용하거나 생물 안전 수준 하에서 작업하는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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출처: Hidmark, A. S., et al. 유세포 분석을 이용한 단일 마우스 좌골 신경 및 배근 신경절의 면역 세포 분석. J. Vis. 특급{{TAG_ 27}} (2017).  이 비디오는 마우스 좌골 신경과 등쪽 뿌리 신경절(DRG)의 면역 세포를 분석하기 위해 유세포 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스에는 형광단 및 비오틴 태그가 지정된 항체로 면역 세포를 라벨링하고, 세포를 안정화 및 투과화하고, 형광 마커를 사용하여 세포 표면 및 핵 특성을 감지하는 작업이 포함됩니다. 이 기술을 사용하면 신경 조직에서 면역 세포의 이질성을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

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염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

T 세포 면역학적 시냅스에서 필라멘트 액틴의 유속과 방향성을 조사하기 위해 라이브 셀 초해상도 이미징을 내부 전반사 형광과 결합하고 시공간 이미지 상관 분광법으로 정량화합니다.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

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여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

이 문서 유동세포계측법를 사용하여 고정하고 살아있는 세포에서 calpain 활동을 측정하기위한 세부 프로토콜을 것입니다.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

학습하세요 이미징 유세포측정법을 사용하여 인간 T세포와 항원제시세포 간 면역 시냅스를 정성적 및 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 정제되지 않은 인간 T세포를 생체 외에서 신속하게 분석할 수 있어 면역학 연구에 활용됩니다.

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