태아 알코올 스펙트럼 장애의 쥐 모델에서 Hippocampal 기능 장애를 평가 하기 위해 추적 Eyeblink 클래식 컨디셔닝의 사용

본 실험의 전반적인 목표는 연합 학습의 한 형태인 추적 눈깜빡임 고전적 조건화(trace eyeblink classical conditioning)의 활용이 태아 알코올 스펙트럼 장애 쥐 모델에서 해마 기능 장애를 탐지하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 입증하는 것입니다. 신생 쥐 새끼들에게 뇌 성장 단계 기준 인간의 임신 3분기에 해당하는 시기에 11.9% volume volume 농도의 고농도 알코올을 폭음(binge) 방식으로 투여합니다.

이러한 알코올 노출 패턴과 용량은 인간의 FASD 사례와 유사하게 생애 전반에 걸쳐 뇌 결손을 유발하는 핵심 요인입니다. 초기 알코올 노출로 인해 손상되는 중요한 뇌 영역 중 하나는 해마입니다. 쥐가 성체로 성장한 후, 흔적 안구깜빡임 고전적 조건형성을 이용하여 해마 기능 장애 여부를 검사합니다.

이는 해마의 온전함에 의존하는 고차원적인 연합 학습 형태입니다. 생후 4일부터 9일까지, 매일 아침 새끼 쥐의 체중을 측정하고 기록합니다. 그 후 체중에 근거하여 미리 인쇄된 표에서 수유량을 결정합니다.

11.9% 부피 백분율 알코올 용액을 2시간 간격으로 두 번에 나누어 쥐 새끼에게 투여합니다. 알코올의 총 일일 투여량은 kg당 하루 5.25 g입니다. 이 폭음 노출 패러다임은 우유 용액 상태로 1회 투여 시 체중 g당 0278 ml의 알코올을 투여합니다.

멸균된 1 mL 주사기를 사용하여 알코올이 포함된 우유를 추출합니다. 그 다음, 필요한 정확한 양을 얻기 위해 과잉 용액을 밀어내어 제거합니다. PE-10 튜브의 끝부분을 신선한 옥수수유에 담급니다.

이는 삽입을 용이하게 합니다. 새끼 쥐의 입부터 위까지의 PE-10 튜브 길이를 측정하십시오. 필요한 경우, 정지 지점을 시각적으로 안내하는 가이드 역할을 하도록 PE-50 스토퍼를 조정하십시오.

PE-10 튜브를 새끼 쥐의 입안으로 조심스럽게 삽입하십시오. 튜브 끝이 목에 닿으면 보통 어느 정도의 저항이 느껴집니다. 튜브 끝이 식도 입구로 굽어 들어갈 때까지 튜브를 조절하십시오.

오일로 인해 미끄러울 수 있으므로 튜브가 뒤로 밀려나지 않도록 주의하십시오. 식도를 따라 내려가 팁이 위식도 괄약근을 통과하면 위로 진입하게 됩니다. 이 지점에서 멈춰 펌프를 고정하고 용액을 주입하십시오.

이 과정은 천천히 수행해야 합니다. PE-10 튜브를 조심스럽게 제거하고, 새끼 쥐에 용액의 역류, 출혈 또는 물리적 손상이 있는지 확인하십시오. 상태가 양호하다면 새끼 쥐를 형제들과 함께 다시 두십시오.

눈꺼풀 수술 절차에 사용된 구체적인 기구는 서면 프로토콜과 재료 목록을 참조하십시오. 승인된 소독제로 수술 부위를 멸균하고, 모든 수술 기구와 소모품은 사전에 오토클레이브(autoclave) 처리하십시오. 이소플루란(isoflurane)으로 쥐에게 적절한 마취를 유도한 후, 털 제거기를 사용하여 머리를 면도하여 절개 부위와 왼쪽 눈꺼풀이 충분히 드러나도록 합니다.

70% isopropyl alcohol과 povidone iodine를 이용하여 세 번 교대로 피부를 세척하여 소독합니다. 표준 절차에 따라 이어바(ear bars)를 사용하여 쥐를 정위 고정 장치에 고정합니다. 쥐가 적절한 마취 단계에 도달하면 수술을 진행합니다.

메스 날을 사용하여 정중선에서 전후 절개를 실시합니다. 이 절개 부위는 양안의 전방과 람다 봉합선(lambda sutoral line)의 약간 후방까지 충분한 영역이 노출되어야 합니다. 메스 날을 사용하여 두개골 상단의 골막을 긁어내되, 과도한 출혈이 발생하지 않도록 주의하십시오.

면봉으로 과도한 결합 조직과 혈액을 닦아내고, 긁어내는 단계 사이에 해당 부위를 멸균 식염수로 헹굽니다. 한쪽 두정골의 관상봉합선 바로 뒤쪽부터 구멍을 뚫습니다. 면봉으로 혈액과 뼈 부스러기를 제거합니다.

스플린터 핀셋을 사용하여 0 80 나사를 잡습니다. 정밀 드라이버를 사용하여 나사를 구멍에 고정하고, 뇌 피질 조직을 손상시키지 않을 정도로만 나사를 조입니다. 보통 3~4바퀴 정도 완전히 돌려 조입니다. 동일한 절차를 반복하여 나머지 나사들을 고정합니다.

관상봉합(coronal suture) 뒤쪽으로 양측에 두 개의 나사가 고정되어 있어야 하며, 람다봉합(lambda suture) 앞쪽 우측 두정골(parietal bone)에 하나가 있어야 합니다. 4인치 드레싱 포셉을 사용하여 왼쪽 눈 절개 부위의 상단 피부를 잡고, 3인치 드레싱 포셉을 눈꼬리 방향으로 향하게 합니다. 26게이지 3/8인치 바늘 하나를 집어 눈꺼풀 구석을 통해 삽입합니다.

바늘의 사면이 위를 향하도록 바늘을 회전시킵니다. 두 번째 바늘을 눈꺼풀 중앙에 삽입합니다. 미세 핀셋을 사용하여 3T 와이어를 잡고 바늘 중 하나에 삽입합니다.

끝까지 삽입할 필요는 없습니다. 두 번째 3T 와이어에 대해서도 동일한 절차를 따르십시오. 한 손으로 두 바늘을 잡고, 다른 손으로는 헤드 스테이지를 잡으십시오.

헤드 스테이지를 같은 방향으로 안내하면서, 한 번의 연속적인 동작으로 바늘을 눈꺼풀에서 당겨 뺍니다. 한 손으로 EMG 헤드 스테이지를 잡고, 다른 한 손으로는 3인치 드레싱 포셉을 사용하여 10T 와이어를 오른쪽의 나사 하나 또는 두 개 모두에 감습니다. 이 와이어가 나사 밖으로 튀어나오지 않도록 잘 밀어 넣습니다.

다음 단계로 넘어가기 전에 EMG 헤드 스테이지의 중심을 맞추어야 합니다. 4인치 드레싱 포셉을 사용하여 피부, 즉 표층 근막을 측두근으로부터 분리하여 작은 포켓을 만듭니다. 포켓이 생성되면 아이리스 가위를 사용하여 왼쪽 눈 구석 방향으로 더 많은 결합 조직을 절제합니다.

너무 깊게 들어가거나 혈관을 절단하지 않도록 주의하십시오. 바이폴라 전극을 가져와 와이어 리드가 측두근의 곡선을 따라 배치될 수 있도록 모양을 잡습니다. 두 개의 프롱은 왼쪽 눈 뒤쪽에 위치하게 하며, 바이폴라 전극의 하단부는 두개골 바로 위에 위치시킵니다.

Ortho Jet 분말을 액상 성분에 섞어 액상 제형으로 만듭니다. 마이크로 스파툴라를 사용하여 절개 부위 주변에 페이스트를 도포합니다. 페이스트가 쥐의 눈에 들어가지 않도록 주의하며, 도포 범위 내에 유지하십시오.

Ortho Jet이 반건조 상태가 될 때까지 기다린 후, 스플린터 포셉을 사용하여 EMG 헤드 스테이지와 바이폴라 전극의 나사산에 묻은 과잉 아크릴을 제거합니다. 작업 공간 확보를 위해 수 센티미터 정도만 남기고 남은 3T 와이어를 잘라냅니다.

미세 해부용 핀셋을 사용하여 각 3T 와이어에서 PTFE 차폐물을 조심스럽게 제거합니다. 이를 통해 와이어가 안륜근과 접촉할 수 있게 합니다. 미세 해부용 핀셋을 사용하여 각 3T 와이어의 양 끝에 갈고리를 만듭니다.

남은 와이어가 눈꺼풀 안으로 다시 들어가지 않도록 주의하며 여분의 와이어를 잘라냅니다. 케이블링은 자체적으로 제작되었습니다. 먼저 흰색 바이폴라 플러그를 연결하며, 이를 통해 충격 초음파(US) 자극을 전달할 수 있습니다.

그 후 오렌지색 EMG 헤드 스테이지 플러그를 연결합니다. 이는 쥐가 눈을 깜빡일 때 근전도 활동을 기록합니다. 두 플러그는 모두 암 상단의 원형 정류기(commutator)로 연결되어 쥐가 자유롭게 움직이는 동안 신호의 연속성을 유지합니다.

자극 격리기를 켜고 최종 하드웨어 점검을 수행합니다. 여기에는 컴퓨터 화면에서 확인할 수 있는 수준으로 EMG 기선(baseline)을 조정하는 과정이 포함됩니다. 첫 번째 세션에서는 충격 강도를 먼저 4 mA로 설정하며, 매 2회 시행마다 4 mA 단위로 강도를 높입니다.

이 단계적 도입 절차를 통해 쥐가 전기 충격 자극에 적응하도록 합니다. 8회차 실험부터는 전기 충격 강도를 1.6 milli amps로 유지하며, 이는 해당 세션과 이후의 모든 세션 전반에 걸쳐 동일하게 적용됩니다. 별도의 컴퓨터로 4채널 디지털 오실로스코프를 작동시켜 실시간 신호 진단을 수행합니다.

1번 박스의 쥐가 보인 눈깜빡임을 확인하십시오. 오실로스코프를 통해 기저 EMG 신호가 잡음이 적고 비교적 깨끗함도 알 수 있습니다. 웹캠을 통해 각 쥐를 모니터링할 수도 있습니다.

이것은 1400 밀리초 동안 지속되는 시행 에포크(trial epoch)를 보여주는 blink 소프트웨어 버전 4.0의 스크린샷입니다. 처음 280 밀리초 동안은 기선(baseline) EMG 활성도를 측정하기 위해 어떠한 자극도 제시하지 않습니다. 노란색 선은 임계값 선을 나타내며, 평균 pre-CS 기선 값보다 4 볼트 이상 높은 모든 EMG 반응은 눈깜빡임 반응으로 인정됩니다.

85 decibels의 톤 조건 자극이 280 millisecond 시점에 제공됩니다. 톤은 380 milliseconds 동안 지속되며, 이는 660 millisecond 시점에 해당합니다. 톤이 꺼진 후, 자극이 제공되지 않는 500 millisecond의 간격이 있으며, 이를 추적 기간(trace period)이라고 합니다. 이 기간 동안 쥐는 톤 CS의 종료 시점과 1160 millisecond 지점에서 제공될 쇼크 US의 시작 시점을 연관 지어 인식해야 합니다.

충격 무조건자극(US)은 100밀리초 동안 지속됩니다. 당연하게도 충격 US는 무조건반응(UR)으로 알려진 방어적 눈깜빡임 반응을 유발하며, 이는 140밀리초의 시간 창 내에서 측정됩니다. 한 번의 훈련 세션은 100회의 시행으로 구성됩니다.

CS와 US가 짝지어지는 시행이 90회 있으며, 매 10번째 시행마다 CS만 제공됩니다. 세션당 10회의 CS 전용 시행이 포함됩니다. 이러한 시행을 통해 CS-US 연합 학습이 일어났는지 여부를 조사할 수 있습니다.

조건 반응 또는 CR의 형태로, 충격 US가 없을 때 표현됩니다. 시행 간 간격은 평균 30초로 설정하여 각 시행의 시작 시점을 예측할 수 없게 합니다. 특정 시행 중에 쥐가 어느 시점에서든 눈을 깜빡일 수 있으며, 이때의 EMG가 소프트웨어에 의해 기록됩니다.

임계선을 초과하는 모든 개별 눈깜빡임은 발생 시점과 시도 에포크(trial epoch)에 따라 네 가지 범주 중 하나로 반응이 간주됩니다. 톤 CS 시작 후 첫 80밀리초 동안 쥐가 눈을 깜빡이면, 이 반응은 놀람 반응(startle response) 또는 SR로 간주됩니다. 이는 감각 운동 성능을 나타내는 비연합 반응이며, CS-US 연합 학습 자체를 의미하지는 않습니다. SR 기간 이후부터 충격 US가 전달되기 전에 눈을 깜빡이면, 이는 조건 반응(conditioned response)을 보인 것으로 간주합니다.

앞서 언급했듯이, 조건 반응(CR)은 연합 학습의 주요 측정 지표입니다. 훈련 초기 단계에서는 조건 반응이 나타나지 않을 것으로 예상되나, 여러 회차의 시도와 세션을 통해 훈련이 진행됨에 따라 이러한 유형의 반응이 더 빈번해지고, 진폭이 높아지며, 타이밍이 더 정확해질 수 있습니다. 우리는 조건 반응을 전체 조건 반응과 적응적 조건 반응의 두 가지 유형으로 구분합니다.

전체 CR은 일반적인 학습 능력을 반영하는 반면, 적응적 CR은 동물이 눈깜빡임의 타이밍을 적절히 조절하는 능력을 반영합니다. 충격이 시작되기 직전, 스스로를 대비하기 위한 적응적 CR 기간은 충격 US 시작 전 200 milliseconds입니다. 해마가 온전한 포유류에서 적응적 CR의 발현은 두 자극의 제공과 관련하여 눈깜빡임의 타이밍을 적절히 맞추는 과정에 해마가 고도로 관여하고 있음을 나타냅니다.

그 특성상, 흔적 안구 깜빡임 고전 조건화는 톤 CS와 충격 US가 시간상으로 겹치는 지연 안구 깜빡임 고전 조건화보다 습득하기가 훨씬 어렵습니다. CR의 발현은 피험자마다 다를 수 있으며 개별 뇌 회로의 손상으로 인해 심각한 영향을 받을 수 있지만, UR은 매 쌍의 CS US 시행 동안 방출될 것으로 예상됩니다. 따라서 이 측정치는 감각 운동 성능을 반영하며, 깜짝 반응과 마찬가지로 그 자체로 CS US 연합 학습을 나타내는 것은 아닙니다.

다음 일련의 비디오 클립에서는 소프트웨어 설정과 안구 깜빡임 훈련의 시작 과정을 확인하실 수 있습니다. 깜빡임 소프트웨어를 활성화하고 두 개의 관련 파일을 불러옵니다. 피험자 데이터가 포함된 쥐 파일과 흔적 안구 깜빡임 조건 형성 파일입니다.

프로그램은 훈련이 시작될 때까지 설정됩니다. 훈련이 시작되면 화면 오른쪽 하단에 다음 시행까지의 시간이 표시되는 타이머가 있음을 확인할 수 있습니다. 다음은 세션 1의 시행 15에 대한 실제 녹화 영상으로, UR은 방출되지만 CR은 아직 발달하지 않은 상태입니다.

다음은 3분의 1 속도로 재생하는 영상입니다. 이어지는 일련의 클립에서는 기관 삽관을 하지 않은 동일한 대조군 쥐가 6회의 훈련 세션을 진행하는 과정의 스크린샷을 보시게 됩니다. 이 쥐는 결과적으로 전체 조건반사(CR)와 적응적 조건반사(CR)를 모두 나타냅니다.

다음은 세션 6의 96회 시행에 대한 실제 비디오 클립으로, 두 번의 눈 깜빡임이 나타나는데, 하나는 적응적 CR이고 다른 하나는 UR입니다. 다음은 3분의 1 속도로 재생한 영상입니다. 마지막 클립에서는 알코올이 삽입된 쥐가 세션 6의 마지막 시행인 CS 단독 시행을 수행하는 실제 비디오를 볼 수 있으며, 600회의 훈련 후에도 적응적 CR을 안정적으로 나타내지 않습니다. 데이터 수집 후, 이상치 검출을 위한 내장 오류 알고리즘을 사용하여 높은 노이즈 아티팩트나 비정상적인 pre-CS 기선 EMG 활성도가 포함된 잘못된 시행들을 스크리닝합니다.

유지된 양호한 시험들은 응답 비율, 진폭, 잠복기 및 기타 임계 측정치에 대하여 SR, UR, 총 CR 및 적응적 CR을 추가로 분석합니다. 6회차의 훈련 세션에 걸친 평균 적응적 CR이 이 첫 번째 결과 세트에 나타나 있습니다. 세션 2부터 세션 6까지 알코올 삽입군과 두 대조군 사이에 응답 비율과 진폭 측정치 모두 통계적으로 유의미한 차이가 있었습니다.

이는 초기 발달 단계에서 알코올에 노출된 쥐의 경우 적응성 CR의 빈도와 강도가 손상되었음을 나타냅니다. 두 번째 결과 세트에는 평균 무조건 반응이 표시되어 있습니다. 빈도와 진폭 측정값 모두 모든 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 없었습니다.

이러한 결과는 초기 알코올 노출이 무조건 자극에 대해 눈을 깜빡이는 쥐의 능력을 손상시키지 않았으나, 관찰된 손상은 습득 과정 중 조건 자극(CS)과 무조건 자극(US)을 적절하게 연합시키지 못한 것에서 기인했음을 나타냅니다. 본 실험에서 우리는 폭음 방식으로 투여된 발달기 알코올 노출이 흔적 안구 깜빡임 고전적 조건화의 결손으로 나타나는 해마에 영향을 미치는지 확인하여 뇌와 행동의 관계를 조사하였습니다. 실제로 안구 깜빡임 고전적 조건화는 뇌 발달 중 알코올 노출과 관련된 신경행동학적 결과를 평가하는 데 유용한 도구입니다.

자극 파라미터나 연합 학습 요구 사항을 변경함으로써 해마 외의 다른 뇌 시스템의 기능적 무결성 또한 평가할 수 있다는 점에서 매우 다재다능합니다. 이 영상을 시청하신 후에는 신생 쥐 새끼에게 알코올을 투여하고, 전극을 삽입하며, 안구 깜빡임 테스트 절차를 수행하는 과정의 복잡한 세부 사항들을 충분히 이해하시게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사합니다.