태아 알코올 스펙트럼 장애의 쥐 모델에서 Hippocampal 기능 장애를 평가 하기 위해 추적 Eyeblink 클래식 컨디셔닝의 사용

이 실험의 전반적인 목표는 연상 학습의 한 형태인 추적 눈 깜박임 고전적 조건화를 사용하여 태아 알코올 스펙트럼 장애의 쥐 모델에서 해마 기능 장애를 감지하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 보여주는 것입니다. 신생아 쥐 새끼는 패션과 같은 폭식에서 11.9% 부피의 알코올 농도인 고용량의 알코올에 도전합니다. 뇌 성장과 관련하여 인간의 세 번째 삼 분기에 해당합니다.

이러한 알코올 노출 및 복용량 패턴은 평생 동안 뇌 결손을 일으키는 핵심 요인이며, 이는 인간의 FASD 사례를 모방합니다. 조기 알코올 노출로 인해 손상되는 중요한 뇌 영역은 해마입니다. 쥐가 성인으로 자란 후, trace eyeblink classical conditioning을 사용하여 해마 기능 장애를 검사합니다.

이것은 해마의 무결성에 의존하는 고차원 형태의 연관 학습입니다. 출생 후 4일에서 9일 동안 새끼 쥐의 체중을 매일 아침 측정하고 체중을 기록합니다. 그런 다음 체중에 따라 미리 인쇄된 테이블에서 사료를 얻습니다.

11.9% 부피의 알코올 용액을 2시간 간격으로 두 번의 먹이를 통해 새끼 쥐에게 전달합니다. 일일 총 알코올 섭취량은 하루 킬로그램당 5.25g입니다. 이 폭음 노출 패러다임은 우유 용액에 수유할 때마다 체중 1g당 0278mil의 알코올을 제공합니다.

멸균 1ml 주사기를 사용하여 알코올이 함유된 우유를 추출합니다. 그런 다음 필요한 정확한 양을 얻기 위해 초과 용액을 밀어냅니다. PE-10 튜브의 끝을 신선한 옥수수 기름에 담그십시오.

이것은 삽입을 용이하게 합니다. 강아지의 입에서 위까지 PE-10 튜브의 길이를 측정합니다. 필요한 경우 PE-50 스토퍼를 정지 지점에 대한 시각적 가이드 역할로 조정하십시오.

PE-10 튜브를 강아지의 입에 조심스럽게 삽입하십시오. 일반적으로 끝이 목구멍에 닿을 때 약간의 저항에 부딪히게 됩니다. 끝이 식도 입구로 구부러질 때까지 튜브를 움직입니다.

튜브가 오일로 인해 미끄러울 수 있으므로 뒤로 미끄러지지 않도록 하십시오. 식도를 따라 내려가다가 끝이 위식도 괄약근을 통과하면 위로 들어갑니다. 이 시점에서 중지하고 펌프를 안정화하고 용액을 제공합니다.

이 작업은 느린 속도로 수행해야 합니다. PE-10 튜브를 조심스럽게 제거하고 강아지에게 용액, 혈액 또는 신체적 부상의 역류가 있는지 검사합니다. 괜찮으면 강아지를 새끼 동료로 교체하십시오.

눈꺼풀 수술 절차에 사용되는 특정 도구에 대해서는 서면 프로토콜 및 재료 목록을 참조하십시오. 승인된 소독제로 수술 부위를 소독하고 모든 수술 기구와 용품을 미리 고압멸균합니다. 이소플루란으로 쥐에게 적절한 마취를 유도한 후 털 트리머를 사용하여 머리를 면도하여 절개 부위와 왼쪽 눈꺼풀에 충분한 양의 피부를 노출시킵니다.

피부는 70%의 이소프로필 알코올과 포비돈 요오드를 3번 번갈아 가며 스크럽하여 살균합니다. 이어바가 있는 입체 장치에 쥐를 고정하는 표준 절차를 따르십시오. 쥐가 적절한 마취 평면을 보일 때 수술을 진행하십시오.

메스 날을 사용하여 정중선을 전방 또는 후방 절개합니다. 이 절개는 눈 앞쪽에 충분한 영역이 노출되어야 하고 람다 봉합선에 약간 뒤쪽에 노출되어야 합니다. 메스 날을 사용하여 과도한 출혈이 발생하지 않도록 두개골 상단의 골막을 조심스럽게 긁어냅니다.

면봉으로 여분의 결합 조직과 혈액을 닦아내고 긁힌 자국 사이에 멸균 식염수로 해당 부위를 헹굽니다. 관상 봉합사 바로 뒤에서 시작하여 한쪽 두정골에 구멍을 뚫습니다. 면봉으로 피와 뼈 찌꺼기를 제거합니다.

쪼개진 집게를 사용하여 0 80 나사를 잡습니다. 보석 세공 드라이버를 사용하여 나사를 구멍에 고정하고 피질 뇌 조직을 손상시키지 않을 만큼만 나사를 조이며 일반적으로 3-4 바퀴 돌립니다. 동일한 절차에 따라 나머지 나사를 고정합니다.

관상 봉합사 뒤에 양측으로 고정된 두 개의 나사가 있어야 하고 다른 하나는 람다 봉합사 앞쪽의 오른쪽 두정골에 고정되어야 합니다. 4인치 드레싱 겸자로 왼쪽 눈의 절개 부위의 윗 피부를 잡고 3인치 드레싱 핀셋을 이 눈가 쪽으로 향하게 합니다. 26 게이지 3/8인치 바늘 하나를 가져다가 눈꺼풀 가장자리에 삽입합니다.

경사진 면이 위를 향하도록 바늘을 돌립니다. 두 번째 바늘을 눈꺼풀 중앙에 삽입합니다. 가는 집게를 사용하여 3T 와이어를 잡고 바늘 중 하나에 삽입합니다.

끝까지 삽입할 필요는 없습니다. 두 번째 3T 와이어에 대해서도 동일한 절차를 따릅니다. 한 손으로 양쪽 바늘을 잡고 다른 손으로 헤드 스테이지를 잡습니다.

한 번의 연속 동작으로 바늘을 눈꺼풀에서 당겨 빼내면서 헤드 스테이지를 같은 방향으로 안내합니다. EMG 헤드 스테이지를 한 손으로 잡고 다른 손으로 3인치 드레싱 집게를 사용하여 오른쪽에 있는 하나 또는 두 개의 나사에 10T 와이어를 감습니다. 이 와이어가 나사에서 튀어나오지 않도록 밀어 넣습니다.

EMG 헤드 스테이지는 다음 단계로 이동하기 전에 중앙에 있어야 합니다. 4인치 드레싱 집게를 사용하여 피부, 즉 표재성 근막과 측두근을 분리하여 작은 주머니를 만듭니다. 주머니를 만든 상태에서 홍채 가위를 사용하여 왼쪽 눈 모서리를 향해 더 많은 결합 조직을 잘라냅니다.

너무 깊숙이 들어가거나 혈관이 끊어지지 않도록 주의한다. 양극성 전극을 사용하여 측두근의 곡률을 따라 끼울 수 있도록 와이어 리드의 모양을 만듭니다. 두 갈래는 왼쪽 눈 뒤쪽에 위치하며 양극성 전극의 아래쪽 끝은 두개골 바로 위에 위치합니다.

Ortho Jet 분말을 액체 성분에 혼합하여 액체 농도를 얻습니다. 절개 부위 전체에 마이크로 주걱으로 페이스트를 바릅니다. 쥐의 눈에 반죽을 떨어뜨리지 않도록 주의하고 격리된 상태로 보관하십시오.

Ortho Jet가 반 건조 상태가 되도록 한 다음 파편 집게를 사용하여 EMG 헤드 스테이지에서 과도한 아크릴을 제거합니다. 그리고 바이폴라 전극의 나사산. 여분의 3T 와이어를 잘라내고 작업할 수 있는 몇 센티미터를 남겨둡니다.

마이크로 해부 겸자를 사용하여 각 3T 와이어에서 PTFE 차폐를 조심스럽게 제거합니다. 이를 통해 안륜근(orbicularis oculi muscle)과 접촉할 수 있습니다. 마이크로 해부 겸자를 사용하여 3T 와이어의 양쪽 끝에 후크를 만듭니다.

여분의 와이어를 잘라내고, 남은 와이어가 눈꺼풀 속으로 다시 들어갈 정도로 많이 잘라내지 않도록 주의합니다. 케이블링은 집에서 이루어집니다. 흰색 바이폴라 플러그가 먼저 연결되며, 이를 통해 충격적인 미국 자극을 전달할 수 있습니다.

주황색 EMG 헤드 스테이지 플러그는 나중에 연결됩니다. 쥐가 눈을 깜박일 때 전기 근촬영 활동을 기록합니다. 두 플러그 모두 팔 상단에 있는 둥근 정류자로 연결되어 쥐가 자유롭게 움직일 때 신호 연속성을 유지합니다.

자극 아이솔레이터가 켜지고 최종 하드웨어 점검이 이루어집니다. 여기에는 EMG 기준선을 컴퓨터 화면에서 볼 수 있는 수준으로 조정하는 것이 포함됩니다. 세션 1에서 충격 강도는 먼저 4 밀리 암페어로 설정되고 두 번의 시도마다 4 밀리 암페어 단위로 증가합니다.

이러한 절차의 단계적 진행은 쥐가 충격 자극에 적응할 수 있도록 합니다. 여덟 번째 시험에서 충격 강도는 이 세션과 이후의 모든 세션 동안 1.6밀리 암페어로 유지됩니다. 별도의 컴퓨터에서는 실시간 신호 진단을 수행할 수 있는 4채널 디지털 오실로스코프를 실행합니다.

상자 1에서 쥐가 방출한 눈 깜빡임을 주목하십시오. 오실로스코프는 또한 기준선 EMG 신호가 노이즈가 적고 비교적 깨끗함을 나타냅니다. 웹캠을 사용하면 각 쥐도 모니터링할 수 있습니다.

이것은 1400밀리초 동안 지속되는 평가판 에포크를 보여주는 깜박임 소프트웨어 버전 4.0의 스크린샷입니다. 처음 280밀리초 동안에는 기준선 EMG 활동의 측정값을 얻기 위한 자극이 제공되지 않습니다. 노란색 선은 평균 pre-CS 기준선 값보다 4볼트 높은 EMG 응답이 눈 깜박임 응답으로 적격한 임계값 선을 나타냅니다.

85데시벨의 톤 상태 자극은 280밀리초 시점에서 전달됩니다. 신호음은 660밀리초 시점에 해당하는 380밀리초 동안 켜져 있습니다. 꺼진 후 자극이 나타나지 않는 500밀리초 간격이 있습니다.이를 추적 기간이라고 하며, 쥐는 쇼크 US의 시작과 함께 톤 CS의 오프셋을 해결해야 하며, 여전히 1160밀리초 표시에서 전달되어야 합니다.

충격적인 미국은 100밀리초 동안 지속됩니다. 당연히, 쇼크 US는 140밀리초의 시간 창에서 측정되는 무조건 반응(UR)으로 알려진 방어적인 깜박임 반응을 이끌어냅니다. 한 교육 세션은 100개의 시도로 구성됩니다.

CS와 US가 짝을 이루는 90번의 시행이 있으며 10번째 시행 중 10번째 시행에서는 CS만 전달됩니다. 세션당 10개의 CS 전용 평가판이 있습니다. 이러한 임상시험을 통해 CS US 협회에 대해 학습하고 있는지 여부를 조사할 수 있습니다.

조건 반응 또는 CR의 형태로 쇼크 US가 없을 때 표현됩니다. 시행 간 간격은 평균적으로 30초로 계산되므로 각 시행의 시작은 예측할 수 없습니다. 주어진 시험에서 쥐는 언제든지 눈을 깜박일 수 있으며 EMG는 소프트웨어에 의해 기록됩니다.

임계값을 초과하는 모든 신중한 눈 깜박임은 발생 시점과 시험 에포크에 따라 네 가지 범주 중 하나의 응답으로 간주됩니다. 톤 CS 시작 후 처음 80밀리초 동안 쥐가 깜박이면 응답은 놀람 응답 또는 SR로 간주됩니다. 이것은 감각 운동 성능을 나타내는 비연관 반응이지만 CS US 연관성 자체를 학습하지는 않습니다. SR 기간 이후 shock US가 전달되기 전에 깜박이면 조건부 응답을 방출한 것입니다.

앞서 언급했듯이 CR은 연관 학습의 기본 척도입니다. CR은 훈련의 초기 단계에서 발달하지 않을 것으로 예상되지만 많은 시도와 세션을 통해 훈련이 진행됨에 따라 이러한 유형의 반응이 더 빈번해지고 진폭이 높아지며 더 시기가 적절할 수 있습니다. CR을 총 CR과 적응형 CR의 두 가지 유형으로 분할합니다.

총 CR은 일반적인 학습 능력을 반영하는 반면 적응형 Crs는 눈을 깜박이는 동물의 능력을 반영합니다. 충격이 시작되기 직전, 스스로를 대비하는 방법으로 적응형 CR 주기는 충격 US 발병 전 200밀리초입니다. 온전한 해마를 가진 포유류에서 적응형 CR의 발현은 두 자극의 전달과 관련하여 깜박임을 적절하게 타이밍에 맞추는 데 높은 수준의 해마 관여를 반영합니다.

본질적으로 trace eyeblink classical conditioning은 tone CS와 shock US가 시간적으로 겹치는 delay eyeblink classical conditioning보다 획득하기가 훨씬 어렵습니다. CR의 발현은 피험자마다 다를 수 있으며 신중한 뇌 회로에 대한 도전에 의해 심각한 영향을 받을 수 있지만, UR은 모든 쌍 CS US 시험 중에 방출될 것으로 예상됩니다. 따라서 이 측정은 감각 운동 성능을 반영하며 놀람 반응과 마찬가지로 CS US 협회 자체의 학습을 나타내는 것은 아닙니다.

다음 비디오 클립 시리즈에서는 소프트웨어 설정 및 눈 깜박임 교육의 시작을 볼 수 있습니다. 깜박임 소프트웨어가 활성화되고 두 개의 관련 파일이 모집됩니다. 피험자 데이터를 포함하는 rat 파일 및 추적 눈 깜박임 조절 파일.

이 프로그램은 교육이 시작될 때까지 시행됩니다. 훈련이 시작되면 화면 오른쪽 하단에 다음 시도까지 카운트다운하는 타이머가 있습니다. 다음은 UR이 방출되지만 아직 CR이 발생하지 않은 세션 1, 트라이얼 15의 라이브 비디오 녹화입니다.

다음은 속도의 1/3로 다시 재생한 것입니다. 다음 클립 시리즈에서는 동일한 삽관되지 않은 대조군 쥐가 6개의 훈련 세션을 통해 진행하는 스크린샷을 볼 수 있습니다. 결국 총 CR과 적응형 CR을 모두 방출합니다.

다음은 세션 6, 트라이얼 96의 라이브 비디오 클립으로, 두 개의 눈 깜박임이 방출되며, 하나는 적응형 CR, 다른 하나는 UR입니다. 다음은 속도의 1/3로 다시 재생한 것입니다. 이 마지막 클립에서는 CS 전용 시험인 세션 6의 마지막 시험에서 알코올 삽관된 쥐의 라이브 비디오를 볼 수 있으며, 600번의 훈련 시도 후에도 적응형 CR을 안정적으로 방출하지 않습니다. 데이터가 수집된 후, 이상치를 감지하기 위해 내장된 오류 알고리즘을 사용하여 높은 노이즈 아티팩트 및 비정상적인 CS 전 기준선 EMG 활동으로 구성된 잘못된 시험에 대해 스크리닝합니다.

유지되는 양호한 임상시험은 반응 비율, 진폭, 지연 시간 및 기타 중요한 측정과 관련하여 SR, UR, 총 CR 및 적응형 CR에 대해 추가로 분석됩니다. 6개의 훈련 세션에 걸친 평균 적응형 CR이 이 첫 번째 결과 세트에 표시됩니다. 백분율과 진폭 측정 모두 알코올 삽관 그룹과 세션 2에서 세션 6까지의 두 대조군 간에 통계적으로 유의했습니다.

이는 초기 발달 동안 알코올에 노출된 쥐에서 적응형 CR의 빈도와 강도가 손상되었음을 나타냅니다. 이 두 번째 결과 집합에는 평균 무조건 반응이 표시되어 있습니다. 주파수와 진폭 측정은 모두 어떤 그룹에서도 통계적으로 다르지 않았습니다.

이러한 결과는 조기 알코올 노출이 무조건 자극에 눈을 깜박일 수 있는 쥐의 능력을 손상시키지 않았지만, 그들이 나타낸 손상은 획득 중에 CS와 US를 적절하게 연관시키지 못했기 때문이라는 것을 나타냅니다. 이 실험에서 우리는 패션과 같은 폭음으로 전달되는 발달 알코올 노출이 결핍에 반영된 해마에 영향을 미치는지 여부를 결정하고 눈 깜빡임 고전적 조건화를 추적하여 뇌 행동 관계를 조사했습니다. 실제로, 눈을 깜박일 수 있는 고전적 조건화는 뇌 발달 중 알코올 노출과 관련된 신경 행동학적 결과를 평가하는 데 유용한 도구입니다.

자극 매개변수 또는 연상 학습 요구 사항을 변경함으로써 해마 외부의 다른 뇌 시스템의 기능적 무결성도 평가할 수 있다는 점에서 매우 다재다능합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신생아 새끼 쥐에게 알코올을 전달하고, 전극을 이식하고, 눈 깜박임 테스트 절차를 수행하는 것과 관련된 복잡성을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 비디오를 시청해 주셔서 감사합니다.