혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

이 미세유체 실험의 전반적인 목표는 실시간 비디오 현미경을 사용하여 유동 조건의 반응성 표면에서 피브린 형성의 혈소판 침착을 동시에 측정하는 것입니다. 이 방법은 수혈 의학 분야에서 혈소판 농축액 제제가 수혈된 혈액의 응고성 특성에 미치는 영향에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 혈소판 기능과 혈류 내 응고의 동시 분석을 용이하게 하여 두 프로세스 간의 상호 작용을 검사할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 접촉 경로 유도 혈소판 응고에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 지질 조직 인자로 코팅하여 외부 경로 연구에 적용할 수도 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자인 Rosalie Devloo가 맡을 것입니다. 0.8 마이크로리터의 갓 재구성된 콜라겐을 8개의 직선 병렬 채널이 있는 새로운 일회용 미세유체 바이오칩의 한쪽 끝에 있는 각 채널 길이의 5/6로 피펫팅하고 마이크로칩의 이 끝을 배출구로 표시하여 미세유체 흐름 챔버 설정을 시작합니다.

바이오칩을 섭씨 4도에서 최소 4시간 동안 가습 및 밀봉된 용기에서 배양합니다. 배양이 끝나면 블로킹 버퍼가 있는 혼합 바이오칩에서 동일한 수의 Y자형 채널에 코딩된 채널을 채웁니다. 마이크로칩을 실온에서 1시간 동안 용기에 다시 넣습니다.

그런 다음 사용 중인 각 채널에 대해 8cm 길이의 2개 및 2cm 길이의 튜브 조각 1개 및 46cm 길이의 튜브 조각 중 하나 끝에 핀을 놓습니다. 다음으로, Nanopump 소프트웨어를 사용하여 연결된 튜브의 모든 펌프 유체를 증류수와 주사기 커넥터 핀의 주사기로 헹구어 다른 모든 튜브를 차단 버퍼로 채웁니다. 그런 다음 실험실용 가위 잭을 사용하여 코딩된 바이오칩을 자동 현미경 스테이지에 고정하여 혼합 바이오칩을 현미경 스테이지와 동일한 높이에 고정합니다.

8cm 튜브의 핀을 사용하여 이러한 튜브 조각을 혼합 바이오칩 주입구에 고정하고 각 튜브의 자유 끝을 HEPES 완충 식염수 바이알에 넣습니다. 이제 코딩된 바이오칩을 유연하지만 직선으로 46cm 길이의 튜브 조각을 사용하여 혼합 바이오칩에 연결합니다. 헹굼 펌프의 루어 호환 튜브에 주사기 커넥터 핀을 부착합니다.

그런 다음 핀을 2cm 길이의 튜빙 조각의 다른 쪽 끝에 연결하고 튜브의 다른 쪽 끝을 코딩된 바이오칩의 배출구에 고정합니다. 그런 다음 모든 튜브와 채널을 1ml의 HBS로 헹굽니다. 관류 펌프를 준비하려면 Microfluidic Perfusion Pump Driver 소프트웨어를 열고 주사기 아이콘을 두 번 클릭하여 펌프를 초기화합니다.

사용할 주사기 유형을 선택하고 헹굼 펌프와 연결된 2cm 튜브를 분리합니다. 주사기 커넥터 핀이 있는 분리된 2cm 튜브를 두꺼운 벽의 폐관 조각의 루어 잠금 장치에 연결하고 주사기를 사용하여 두꺼운 벽의 튜브를 표준 펩신 용액으로 채웁니다. 그런 다음 Kocher cl로 두꺼운 벽으로 된 튜브의 열린 끝을 고정합니다.amp.

튜빙을 코딩된 바이오칩의 배출구에 고정합니다. 혼합 흐름 챔버에서 두 개의 튜브를 함께 분리하고 HBS 용기를 폐기합니다. 배출된 구연산나트륨 용기에서 혈액 샘플을 채취한 후 튜브를 원심분리하고 혈소판이 풍부한 혈장을 새 원심분리 튜브로 옮깁니다.

혈소판이 풍부한 혈장이 있는 용기를 다시 스핀다운합니다. 그런 다음 상층 혈소판이 부족한 혈장을 다른 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 21게이지 바늘을 사용하여 구연산나트륨 용기의 바닥을 뚫어 포장된 적혈구가 새 원뿔형 튜브로 떨어지도록 합니다.

꽉 찬 적혈구를 모두 채취한 후 분리된 꽉 찬 적혈구를 혈소판이 부족한 혈장과 결합하여 혈액을 부드럽게 재구성하고 수혈을 위해 준비된 혈액 은행 혈소판을 추가하여 40% 헤마토크릿과 2.5배 10을 가진 샘플을 마이크로리터 농도당 5번째 혈소판에서 2.5ml 최종 부피로 얻고 완전한 혈구 수를 얻습니다. 다음으로, 13마이크로리터의 형광단 표지 피브리노겐을 폴리스티렌 원뿔형 튜브에 추가합니다. 그 다음에는 재구성된 혈액 1밀리리터가 나옵니다.

또 다른 1ml의 혈액과 2마이크로리터의 형광 혈소판 염료를 혼합하고 라벨이 부착된 혈액 샘플을 함께 추가합니다. 그런 다음 혼합된 혈액 샘플을 부드럽게 뒤집고 섭씨 37도에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 관류 분석을 시작하기 전에 현미경 광학 장치를 첫 번째 채널의 바닥에 부착된 콜라겐 섬유에 초점을 맞춥니다.

수집 소프트웨어를 사용하여 선택한 채널에서 관심 영역을 정의합니다. 예열된 응고 완충액 1ml를 1ml 주사기에 넣고 주사기를 관류 펌프에 장착합니다. 두 번째 부드러운 반전 후 2ml 주사기에 혈액을 넣고 주사기를 관류 펌프에 장착합니다.

그런 다음 주사기 커넥터 핀을 사용하여 두 주사기를 8cm 튜브 한 조각에 부착하고 커넥터와 튜브를 분당 400마이크로리터로 프라이밍합니다. 모든 튜브가 응고 완충액 또는 혈액으로 채워지면 두 튜브의 다른 쪽 끝을 혼합 바이오칩의 Y자형 채널의 갈라진 다리에 고정합니다. 그런 다음 배설관의 배출구에서 Kocher 클램프를 제거하고 응고 완충액의 경우 분당 4.4마이크로리터, 재구성된 혈액의 경우 분당 44마이크로리터로 관류를 시작합니다.

30분 동안 10초마다 이미지를 실시간으로 기록하고, 30분 후 또는 신호가 포화 상태가 되면 펌프 및 이미지 획득을 종료합니다. 그런 다음 모든 튜브와 주사기를 생물학적 유해 폐기물로 폐기하십시오. 이 비디오는 혈소판 혈전 및 피브린 침착의 축적에 대한 훌륭한 예를 제공합니다.

관류가 시작될 때 혈소판이 반응성 표면에 부착되어 기록된 녹색 형광이 꾸준히 증가했습니다. 이 접착 단계에서는 보라색 형광이 거의 없는데, 이는 피브린이 미미하게만 형성되었음을 나타냅니다. 응고가 시작되면 격렬한 형광 피브린이 빠르게 침착되고 혈소판 녹색 형광이 거의 같은 속도로 축적됩니다.

따라서 응고 시작의 순간은 혈소판 응고 전위의 결정 요인으로 외삽될 수 있습니다. 재구성된 혈액에 옥수수 트립신 억제제를 첨가하는 것은 혈소판 접착에 영향을 미치지 않지만 관류 실험의 총 기간 동안 응고가 시작되지 않습니다. 재구성된 샘플에서 혈소판의 수를 증가시킴으로써, 접착력, 축적 및 응고 속도가 선형적으로 증가합니다.

발병 시점은 혈소판 농도를 증가시킴으로써 현저히 단축되며, 이는 응고를 유발하기 위해 활성화된 침착된 혈소판의 역치 수가 필요하다는 것을 시사합니다. 또한, 콜라겐만 코팅된 채널의 쌍 분석에서 또는 재조합 지질 조직 인자와 조합한 경우, 전체 응고 속도나 혈소판 축적 모두 조건에 따라 다르지 않지만 응고 시작이 훨씬 빠릅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 혈소판 기능과 응고의 동시 분석을 위해 이중 표지된 재구성 혈액으로 미세유체 유동 챔버 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

개발 후, 이 기술은 수혈 의학 분야의 연구자들이 혈소판과 혈류 하의 응고 사이의 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오에서는 표준화된 실험을 시연하는 데 중점을 두었습니다. 그러나 표면 코팅, 차폐 응력 또는 칼슘 농도의 변화를 도입하여 관심 있는 특정 연구 질문에 답할 수 있습니다.