Name: 의 검출을위한 자석 교반기 방법 선모충 애벌레 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 배우세요 고기 샘플에서 Trichinella 유충을 검출하는 자석 교반기 방법을. 이 기술은 식품 안전과 기생충학 연구에 필수적인 진단 도구로, 정확한 품질 관리가 필요합니다.

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1. 준비 <ol><li> 시료 채취 주 : 교반기 방법은 하나 또는 풀링 근육 샘플을 사용할 수있다. <ol><li> 적절한 취향 사이트로부터 적당량 (9)을 채취. 국가의 요구 사항 또는 ICT, OIE 또는 ISO의 권고 사항을 참조하십시오. <ol><li> 유럽 ​​연합 (EU)의 경우, 예를 들어, 돼지의 힘찬 부분으로의 전환에 다이어프램 기둥에서 1g의 샘플을 채취. 모든 근육 샘플 모든 지방과 근막이 없는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 혀가 테스트되는 경우, 테스트 이전에 표층 제거. </li><li> 샘플을 냉동하는 경우 가장 선모충의 유충이 내성 동결과 죽음 이후 풀다하지 않는 한,주의, 소화에 덜 내성 및 감소 분석 감도의 결과로, 컨테이너 벽에 집착하는 경향이있다. 참고 : 냉동 경우, 리터에서 표본의 크기를 두 배로동쪽으로는 침전 시간 (아래 참조) 증가. </li></ol></li><li> 분해 액의 제조 <ol><li> 3 L의 유리 비커에 48 °의 C - 46로 예열 수돗물의 2 L에 25 % 염산 (16 ± 0.5 mL의)를 추가합니다. 불완전 분해의 온도 결과에 너무 낮다; 온도가 너무 높은 펩신의 효소 속성을 비활성화합니다. </li><li> 비커에 교반 봉을 놓고 예열 접시에 용액을 교반 (46-48 °에 C를). </li><li> (10,000 NF, 1 : 12,500 BP, 2000 FIP 1) 산성 용액에 펩신의 10 ± 0.2 g을 추가합니다. 참고 : 펩신의 품질은 가장 중요하고 효소 활성이 생산자에 의해 인증을 받아야이다. 실험실 안전을 위해 및 펩신 활성을 유지하기 위해 분해 액 성분의 첨가 순서에 부착되어야한다. </li></ol></li><li> 근육 샘플 준비 <ol><li> 믹서 나 분쇄기에 근육 샘플 100g까지 들어온다. BLEN 용이하게하기 위해땡은 샘플을 2 mL의 물을 예열 추가하고 2 최대 속도로 혼합 - 3 초. </li><li> 제 블렌딩 전에 믹서를 열고 바닥 반복 블렌딩 블렌딩 그릇 에지 가장자리의 상단에있는 근육 샘플 옮긴다. 고기의 눈에 보이는 조각이 남아 있지 않을 때까지 3 초 - 2 버스트 혼합을 계속합니다. 참고 : 너무 작은 혼합이 불완전한 소화 될 수 있습니다, 너무 많이 혼합이 샘플 6에서 선모충의 유충 존재를 손상시킬 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 절차 <ol><li> 근육 샘플 소화 <ol><li> 실린더로 소화 유체의 1 L를 전송합니다. 비커에 다진 고기를 전송하고 숟가락 또는 포크 소화 유체에 보급. 철저 3 L 비커로 예열 소화 액 500 mL로 믹서 뚜껑, 블레이드 및 믹서 그릇을 씻어. 참고 : 불완전한 세척은 SENS의 손실이 발생할 수 있습니다itivity. </li><li> 알루미늄 호일로 비커를 덮고 (44)의 일정한 온도 유지 - 46 °의 C 및 온도계를 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 고기 입자가 사라질 때까지 30 분 튀는없이 깊은 소용돌이를 생성하는 소화 액체를 저어. 시험 고기 (야생 동물의 고기 등)의 종류에 따라, 60 분의 최대까지 소화 시간을 증가시킨다. </li></ol></li><li> 여과 및 소화 유체의 침강 <ol><li> 소화 조직의 양을 결정하기 위해 0으로 스케일을 조정 사용 전에 자체 무게 및 중량을 참고. 체는 깨끗하고 침강 깔때기에 도달하는 선모충의 유충을 방해 할 수있는 조직 입자의 결여해야한다. 분리 깔때기 수직 수평되어 있는지 확인합니다. </li><li> 소화 후, 조심스럽게 분리 된 유리 깔때기에 180 ㎛의 체를 분해 액을 붓는다. 분리 된 유리 깔때기의 폭 ㄴ 안된다전자 길이보다 큰 55 %는 좋은 유충 침강을 허용합니다. 어떤 오버 플로우를 방지하기 위해주의하십시오. </li><li> 감도의 손실을 방지하기 위해 철저하게 유리 비커와 스퀴즈 세척 병 수돗물의 약 200 mL를 체를 씻어 침강 유리 깔때기로 헹굼 물을 전송합니다. 조심스럽게 3 L 비커의 가장자리를 씻어주의하십시오. 체를 들어 올리고 철저하게 자체에서 영역을 씻어. </li></ol></li><li> 소화 조직 량의 결정 주 : 상기 방법의 실행에서의 오류로 인해, 근육 조직이 잘 근막과 소화되어 결합 조직으로, 체 상에 남아있을 수있다. 소화 조직의 양은 제 10 분간 침강 단계 (250 참조) 동안 결정된다. 잔류 물이 소화되지 않은 조직의 결정 무게에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이것은 자체 건조하는 약 30 분을 할 수 있습니다. <ol><li> 규모에 종이 타월을 배치하고, undiges으로 자체 무게테드 조직. </li><li> 소화되지 않은 조직으로 자체 중량에서 여과하기 전에 자체 무게를 뺍니다. 시작 샘플 중량의 5 % 이하가 자체 (즉, 5g / 100g 원료)에 남아있는 경우, 분해 과정은 양호한 것으로 간주된다. </li><li> 소화 조직의 양이 5 %를 초과하는 경우, 새로운 근육 시료를 사용하여 시험을 반복한다. 나머지 조직은 주로 소화 근조직 이루어지는 신선한 샘플을 사용할 수없는 경우, 다시 소화 남아 다이제스트 원래 샘플에 부가 조사한다. </li></ol></li><li> 소화 유체의 침전 <ol><li> 30 분 동안 분별 깔대기에서 여과 소화 유체를 유지한다. 그대로두면 선모충의 유충은 깔때기의 바닥에 정착됩니다. </li><li> 냉동 된 샘플을 사용하는 경우, 60 분간 최대 침강 시간을 증가시킨다. </li><li> 침전이 완료되면 완전히 콕을 열고분액 깔때기의 신속 적어도 40 mL를 소화 유체의리스 (근육 샘플 이전에 냉동 있었다면 80 mL)을 메스 실린더로 도망. </li><li> 먼저, 실린더에 유체의 절반을 허용하고 완전히 통과 분해 액 10 ㎖를 허용하도록 반대 방향 스톱 콕을 열어. 마지막으로, 또 다른 10 ㎖에 대한 반대 방향 스톱 콕을 열어. 이 절차는 선모충의 유충이 꼭지에 갇혀되지 않도록합니다. 주 : 충분한 속도 감도를 감소 분액 깔대기에 남아있는 유충을 피하기 위해 필요하다. </li></ol></li><li> 실린더 내 소화 유체 침강 <ol><li> 유충은 침전 수 있도록 10 분 동안 실린더 내의 퇴적물을 남겨주세요. 10 ML의 침전물을 방해하지 않고 피펫으로 흡입하여 30 mL의 상층 액을 제거합니다. </li><li> 시료의 조직 섬유의 양을 줄이기 위해, 침전물을 30 mL의 수돗물을 추가하고 다른 10m 떠날액체가 분명하다 때까지. 반복합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 10 ㎖가 그리드 화 페트리 접시 또는 애벌레 계산 유역에 침전물을 세척 전송합니다. 10 ML의 수돗물 실린더를 씻어 후 시료에 물을 추가합니다. 주 : 필요한 경우 시료 파편으로 다량의 선모충 유충 (도 1)의 식별을 방지 할 수 있으며, 상기 세척 단계가 수행되어야한다. </li></ol></li><li> 현미경 검사 <ol><li> 즉시 세척 단계 후 샘플을 검사 15 20 배 배율에서 trichinoscope 또는 조정 강도의 하위 단계 전송 광원과 스테레오 현미경을 사용합니다. </li><li> 격자 페트리 접시에 샘플을 주입 한 후 그리드에 의해 요리 / 체계적으로 분지 그리드를 검사합니다. 아무 의심 구조가 발견되지 않으면, 부드럽게 모든 선모충 라 할 수 있도록 원형 방식으로 격자 페트리 접시 또는 애벌레 계산 분지에서 유체를 이동잠재적으로 간과했다 rvae은 페트리 접시의 중심에 축적합니다. 검사를 반복합니다. </li><li> 용의자 구조가있는 경우, 40 배율을 증가 - 100X한다. 피펫으로 접시 / 분지에서 선모충의 유충을 제거하고 90 % 에탄올로 튜브에 수집합니다. </li><li> 완전한 접시가 검사 된 후에는 접시 / 지의 부드러운 흔들림부터의 절차를 반복한다. 적어도 3 회 더 이상 애벌레 때까지 절차를 반복하는 것이 발견된다. </li><li> 유충의 수를 계산합니다. 근육 조직의 양과 상관 관계는 테스트 g (LPG) 당 유생으로 존재. </li><li> 너무 많은 유충이 안정적으로 애벌레 수를 결정하기 위해 소화 유체에 존재하는 경우, 측정 실린더에 유충을 포함하는 유체를 돌려 스퀴즈 세척 병 수돗물로 씻어,하고 아래로 정착 애벌레를 둡니다. </li><li> 10 분 침강 시간 후, 정의 된 볼륨에 뜨는을 감소 (예 :10 ㎖). 정확한 양을 확인하려면, 피펫으로 새 실린더에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 격렬한 흔들림에 의해 유체에 균일하게 애벌레를 일시 중단합니다. 요동 동안 배양 접시에 20 μL 애벌레 정지 12 방울을 추가합니다. </li><li> 현미경으로 각 드롭을 검사합니다. 240 μL의 유충의 수를 결정하고 최고 및 최저 카운트를 삭제합니다. 상등액의 총량 (예를 들어 10 ㎖)에 유충의 수를 추정. 참고 : 스테레오 현미경의 품질은 선모충의 유충의 식별을 위해 가장 중요하다. </li><li> 유충은 피펫으로 튜브에 수집 할 때, 애벌레는 피펫 벽에 부착하지 않았지만 튜브로 전송되어 있는지주의 깊게 확인합니다. 참고 : 풀링 된 샘플에서 긍정적 인 선모충 결과는 기원의 시체에 다시 풀에서 추적해야합니다. 양 도체가 아이덴 때까지 여기서, 풀 크기는 점진적으로 감소되어야tified. 샘플 크기는 감도를 증가시키는 과정이 증가 될 수있다. 집단 시료의 검사는 양수 또는 불확실한 결과를 생성하는 경우, 추가 20g 샘플은 각각의 돼지에서 가져온 것입니다. 다섯 돼지에서 20g 샘플을 모으고 기재된 방법을 사용하여 검사된다. 이런 식으로 다섯 돼지의 20 그룹의 샘플을 검사한다. 선모충 5 개의 돼지에서 풀링 된 샘플에서 검출 될 때, 20g의 시료를 그룹의 각각의 돼지로부터 수집되고 원래 양 도체가 검출 될 때까지 각각 별도로 검사된다. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

교반기 방법을 용이하게 수행 할 수 있지만, 엄격 기술적 세부 사항을 준수하지 않는 것은, 따라서 소비자의 건강을 위태롭게 충분한 감도로 이끈다. 임계 제어 지점은 위의 텍스트에서 강조되고있다. 또한, 해당 장치의 사용은 시험의 성공적인 결과에 매우 중요하다. 모든 선박들은 표면 애벌레의 부착을 감소시키는 실리콘 코팅 유리 피펫 팁 만들어 져야한다. 소화 방법의 민감도는 근육의 유충 밀도 시험 근육 시료의 양에 따라 달라진다. (3)의 유충 밀도 - 근육 조직 5 LPG, 100 %의 민감도가보고 되었으나 한 LPG보다 감도가 40 % (13)에 떨어 뜨렸다. 테스트 된 숙주 동물의 종에 따라 시험의 민감도가 사용 시료의 양을 증가시킴으로써 향상시킬 수있다. 제 i야생 동물 nfection 부담 때문에 더 큰 샘플 크기는 14을 사용, 일반적으로 낮다. 취향 사이트는 또한 호스트 동물마다 다릅니다. 여기서, 또한 큰 샘플을 초래할 수 혀 고려할 필요 같은 일부 근육 조직의 하부 소화율은 15 크기. 또한, 자석 교반기 방법은 내부 제어를 포함하지 않는다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 따라서, 문서에 대한 샘플링에서 품질 보증 관리는 정확하고 정밀한 결과를 얻기 위해 필수적이다. 근육 샘플 선모충 유충을 검출하는 기관 성능의 품질 능력 시험에서 각 분석 정기적 참여에 의해 모니터링한다. 방법의 또 다른 한계는 현미경으로 근육 애벌레의 최종 식별 단계는 매우 주관적 및 난방입니다입니다심사 분석에 의해 애벌레 형태의 지식에 vily 의존. 이 문제를 회피하는 흥미로운 또 다른 방법은 라텍스 응집 시험으로 애벌레 검출 다음 필터 분리에 자석 교반기 방법 /입니다. 그러나 EU 법규에 따라이 방법은 같은 멧돼지 4로 국내 돼지하지만 감염의 위험이 높은 동물 고기의 테스트에 해당하는 것으로 간주됩니다. 모노클로 날 항체와 항원 유생의 식별은 시험보다 대물 수 있지만, 기관 고기를 16 그램 당 유충의 수를 결정하는 가능성을 부정한다. 자석 교반기 방법의 또 다른 변화는 기계적으로 지원 풀링 된 샘플 소화 방법 / 침전 기술, 기계적으로 지원 풀링 된 샘플 발굴 포함필터 분리 기술에 estion 방법 / 최대 35g 기술의 풀링 된 샘플에 대한 자동 소화 방법. 이들 기술은 모두 고기 선모충 유충의 시각화 및 계산의 인공 소화에 기초하지만, 여과 및 침전 단계에 사용되는 기기 상이된다. 분리 된 유충은 또한 분자 시험 (예를 들어, 다중 PCR) (17)에 의해 종 레벨에서 식별 될 수있다. EU 법률에 따르면, 모든 긍정적 인 샘플은 선모충 종 판별을 위해 국가 참조 실험실 또는 EURLP에 전달해야합니다.

속 선모충의 선충은 전 세계적으로 육식 동물과 잡식 동물 포유류, 조류, 파충류의 가로 무늬 근육에서 검출 될 수있다. 이러한 동물 매개 선충 돼지, 말에서 인간 원료 또는 반 원시 고기와 고기 파생 된 제품을 도달 할 수 있습니다, 게임 동물은 섭취한다. 이 인수 공통 전염병은 pathognomonic 징후와 증상, 예를 들어, 설사, 발열, 눈 주위 부종과 근육통 및 심근염, 혈전 색 전성 질환과 뇌염 1 가능한 합병증을 특징으로 인체에 심각한 질병이 될 수 있습니다. 선모충은 야생 및 국내 동물 선모충 감염의 가장 광범위 병인 에이전트이며, 전 세계적으로 인간 감염의 대부분을 발생합니다. 유럽, 북미 및 서부 아프리카, 서아시아에서 선모충의 britovi 인간 감염의 또 다른 근원이다. 또한 10 개의 다른 분류군 덜 일반적 원인으로보고있다<html> 인간 질병의 에이전트는 일반적으로 야생 동물 2, 세계의 다른 지역에서 발견된다. 이러한 멧돼지, 곰, 바다 코끼리와 오소리 등 야생 동물뿐만 아니라, 돼지 고기는 전 세계적으로 인간 감염의 가장 중요한 소스를 나타냅니다. trichinellosis을 방지하는 가장 좋은 방법은 원시 육류 제품을 먹는 자제하고 고기, 안전 온도 (특히 게임 고기를 요리하다&gt; 65 ° C 1 분 동안, 즉의 핵심에 갈색에 핑크에서 고기 색상을 변경하려면 고기 제품) 3. 유럽 연합 (EU)과 USDA은 고기 4, 5 T.의 spiralis 유충을 죽이는 데 사용 할 수 있습니다 돼지 고기 제품에 대한 동결 및 조리 시간과 온도를 지정했습니다. 또한, 육류 및 육류 제품에 선모충의 비활성화에 대한 권장 사항은 Trichinellosis에 관한 국제위원회가 발표되었다&quot;외부 참조&quot;&gt; 6. 유럽에서는, 선모충 감염의 위험성을 무시할 상업용 돼지 무리의 제어 하우징 조건의 도입에 더하여, 인간 trichinellosis 예방은 감염 동물 사에서 근육 샘플의 실험실 시험에 기초한다. 식품 안전을 위해 소화 분석 고기 3, 7 선모충 유충의 직접 검출을위한 신뢰할 수있는 유일한 방법이다. 소화 분석의 여러 가지 변형이 있더라도 교반기 방법은 국제적으로 인정 된 기준 방법 3, 4, 7이다. 이 분석은 가로 무늬 근육 조직에서 선모충의 유충의 검출을 기반으로합니다. 근육 샘플의 효소 분해 및 후속 여과 및 침전 단계 후 트라이chinella 유충은 현미경으로 식별됩니다. 무역 의무와 국내법에 따라, 자석 교반기 메소드의 범용 프로토콜에서 작은 변화의 다수가 있습니다. 여기에, 기술적 인 세부 사항은 유럽 연합 (EU)의 요구 사항 4, ISO 규격 8, ICT 가이드 라인 (6) 및 기생충 (EURLP)에 대한 유럽 연합 (EU) 참조 연구소의 경험과 선모충에 대한 독일의 참조 연구소를 기반으로합니다.

<table><tbody><tr><td>칼, 가위, 핀셋</td><td></td><td></td><td>샘플 절단 및 소화되지 않는 조직 제거</td></tr><tr><td>블렌더&nbsp;</td><td></td><td></td><td>날카로운 도마</td></tr> 포함 <tr><td>자석 교반기</td><td></td><td></td><td>온도 조절 장치로 제어되는 가열판 포함</td></tr><tr><td>교반 막대</td><td></td><td></td><td>테프론 코팅, 약 5cm 길이의</td></tr><tr><td>원추형 유리 분리 깔때기</td><td></td><td></td><td>최소 2L의 용량, 바람직하게는 테프론 안전 플러그가 장착되어 있습니다. 너비는 유충이 잘 침전될 수 있도록 길이의 55%보다 크지 않아야 합니다.</td></tr><tr><td>스탠드, 링 및 클램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>체</td><td></td><td></td><td>메쉬 크기 180 미크론, 외부 직경 11 cm, 스테인레스 스틸 메쉬</td></tr><tr><td>퍼넬</td><td></td><td></td><td>내부 직경 12&nbsp; cm, 체를 지원하기 위해</td></tr><tr><td>유리 비커</td><td></td><td></td><td>용량 3 L</td></tr><tr><td>유리 측정 실린더</td><td></td><td></td><td>용량 50-100 mL 또는 원심 분리기</td></tr><tr><td>튜브 실체 현미경</td><td></td><td></td><td>밝기 조절 가능한 투과 광원 또는 수평 테이블이있는 trichinoscope 페</td></tr><tr><td>트리 접시</td><td></td><td></td><td>9cm 직경, 밑면에 10 &times로 표시; 뾰족한 기구 또는 유충 계수 수조를 사용하는 10mm 정사각형 검사 영역 트리시노스코프</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td>또는 비커를 덮는 뚜껑</td></tr><tr><td>25% 염산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>펩신</td><td></td><td></td><td>강도: 1:10,000 NF(US National Formulary) 1:12,500 BP(영국 약전) 및 2,000 FIP(F&eacute; D&EACUTE; ration internationale de pharmacie) 또는 최소 660 유럽 약전 단위/mL</td></tr><tr><td>에탄올</td><td></td><td></td><td>70-90% 에틸 알코올</td></tr><tr><td>수돗물을</td><td></td><td></td> 가진 안정화된 액체 펩신 <td>46-48 &deg로 가열; C 사용 전</td></tr><tr><td>최소</td><td>0.1g까지 정확한</td>균형 <td></td><td></td></tr><tr><td>금속 트레이</td><td></td><td></td><td>용량 10-15 L, 남은 소화액을 수집하기 위해</td></tr><tr><td>피펫 및 피펫 홀더</td><td></td><td></td><td>다양한 크기 (1, 10 및 25 mL)</td></tr> <tr><td>온도계</td><td></td><td></td><td>0.5 °C까지 정확합니다. C, 온도 범위는 최소 20 &deg; C에서 70&nbsp; &데그; C</td></tr><tr><td>사이펀</td><td></td><td></td><td>수돗물용</td></tr></tbody></table>

의 검출을위한 자석 교반기 방법<em&gt; 선모충</em근육 샘플에서&gt; 애벌레

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis 인간의 쇠약 질환과 속 선모충의 선충 유충에 감염된 동물의 원시 또는 덜 익힌 고기의 소비로 인해 발생합니다. 인간 감염의 가장 중요한 소스는 전 세계 게임 고기와 돼지 고기 나 돼지 고기 제품입니다. 많은 나라에서, 인간 trichinellosis 예방은 감염 동물 사체로부터 근육 시료의 인공 소화에 의해 감염된 동물의 식별에 기초한다. 고기의 소화하지만, 자석 교반기 방법이 황금 표준으로 간주됩니다에 따라 여러 가지 방법이 있습니다. 이 방법은 근육 샘플 및 후속 여과 및 침전 단계의 효소 분해 후 현미경으로 선모충의 유충의 검출을 할 수 있습니다. 이 방법은 특별한 고가의 장비를 필요로하지 않지만, 내부의 제어 장치는 사용할 수 없다. 따라서, 엄격한 품질 관리는있는 수정되어야한다테스트를 통해 거라고. 본 연구의 목적은 세부 처리 지침 및 기생충에 대한 유럽 연합 (EU) 참조 약국 및 선모충 독일의 국립 참조 연구소의 경험을 바탕으로 애널리스트의 방법의 중요 관리 점을 제공하는 것입니다.

<html> 소화 후, 감염성 근육 유충의 형상 인식을 더 어렵게 변할 수있다. 일반적인 형태는 단단히 코일 유충, 가볍게 코일 유충 또는 C 형 또는 완전히 uncoiled 유충 (- 2C도 2B)를 포함한다. 그램 당 발견 된 유충의 수는 상당히 다를 수 있으며, 몇 백 애벌레 한 유충에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 감염성 근육 유충의 형태는도 2a에 도시된다. 길이 0.7 ~ 1.5 mm, 폭 약 0.3 mm는 선모충의 유충입니다. 식도는 좁고 약간 둥근 끝이있다. 표피는 부드러운이다. 체강 상기 stichosome의 앞쪽 절반에서, 구조 (45) (55)에 큰 셀 (stichocytes)의 행에 의해 둘러싸인 긴 세관 이루어지는 관찰 할 수있다. 직장 11 어떤 예측하지 않고 또한 둥근 또는 10 부속되어. t &quot;&gt; 기타 구조, 선모충의 유충 외에, 근육 소화 후 발견 될 수있는 몇 가지 예는도 3a에 도시되어있다 -.. 3 층을 야생 동물이 자주 애니메이션으로 내장 적출 과정에서 오염 된 다른 기생충이나 테스트에 사용할 수있는 근육 샘플에 감염되어 또는 무생물 구조 / 생물. 유충의 길이는 전방 및 후방 끝의 모양과 stichosome 도움의 발생은 다른 선충 장군 (12)를 구별한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> 그림 1 : (A) 부족 및 (B) 충분한 헹굼 단계 후 선모충 유충의 현미경 검사. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">더 큰이 적이 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 rsion. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> 그림 2 : 유충 (A)의 직장, Stichosome과 식도 표시 형태론 감염성의 선모충 애벌레. 소화 표시 (B) 후 근육 애벌레의 가능한 모양 단단히 감아 가볍게 애벌레와 (C)를 이동하는 유충을 uncoiled 코일. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> 그림 3 : 자석 교반기 방법으로 소화 근육의 샘플 후 부대 조사 결과의 예. (A)의 모 형 머리멧돼지에있는 지구 벌레; (B) 멧돼지에서 Alaria의 alata는; (C) 멧돼지에서 근육 섬유; (D) Metastrongylus SP. 멧돼지에서; Toxocara 특검팀 : (E) 식물 섬유는 멧돼지 (F)에서 발견. 멧돼지에서 애벌레. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

많은 나라에서 인간 trichinellosis 방지 전세계 교반기 방법 금 표준 간주되는 소화의 방법에 의해 감염 동물의 근육 샘플의 실험실 시험에 기초한다.

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

이 진단법의 전반적인 목표는 식중독성 인수공통 기생충인 Trichinella에 감염된 육류 또는 육가공품을 식별하는 것입니다. 이 방법은 육류 내 Trichinella 유충을 직접 검출하는 골드 표준법입니다. 이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고 전문적인 장비가 필요하지 않다는 점입니다.일반적으로 이 방법이 생소한 개인은 내부 대조군을 사용할 수 없고 테스트 전반에 걸쳐 엄격한 품질 관리가 적용되어야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 절차 시연은 저희 실험실의 기술자인 Nora Thaben이 진행하겠습니다. 안녕하세요! 소화를 위해 근육 시료를 준비하려면, 시료 100 grams를 블렌더나 분쇄기에 넣으십시오.혼합을 돕기 위해 미리 데운 물 2 mL를 추가합니다. 최대 속도로 2~3초 동안 혼합합니다. 두 번째 혼합 전, 블렌더를 열어 혼합 용기 가장자리에 붙어 있는 근육 시료를 바닥으로 옮깁니다.혼합 과정을 반복하고, 고기 조각이 더 이상 보이지 않을 때까지 2~3초 간격으로 짧게 끊어서 계속 혼합합니다. 이 절차를 시작하기 전, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 3L 비커에 소화액을 준비하십시오. 예열된 소화액 1L를 플라스크에 옮깁니다.분쇄된 고기를 비커에 옮깁니다. 그리고 숟가락이나 포크를 사용하여 소화액 속의 고기를 골고루 퍼뜨립니다. 블렌더 용기, 뚜껑, 칼날 및 포크를 남은 소화액으로 깨끗이 헹굽니다.비커를 핫플레이트 위에 올려놓고 온도계를 사용하여 44~46°C의 일정한 온도를 유지합니다. 그런 다음 비커를 알루미늄 호일로 덮습니다. 고기 입자가 사라질 때까지 액이 튀지 않도록 주의하며 30분 동안 소화액을 교반하여 깊은 와류를 형성합니다.근육 시료의 소화 후, 소화액을 여과하고 소화되지 않은 조직의 양을 결정해야 합니다. 저울의 영점을 조절하고, 깨끗한 180µm 체의 무게를 측정하여 기록합니다. 분별 깔때기가 수직으로 평형을 이루고 있는지 확인합니다.유충이 잘 침전되도록 분리용 유리 깔때기의 너비는 길이의 55%보다 크지 않아야 합니다. 소화액을 체에 걸러 분리용 유리 깔때기에 조심스럽게 붓되, 내용물이 넘치지 않도록 주의하십시오. 민감도 저하를 방지하기 위해 유리 비커와 체를 약 200 milliliters의 수돗물로 철저히 헹구십시오.그리고 세척수를 분별 깔때기에 옮깁니다. 체를 들어 올리고, 세척병을 사용하여 체 아래쪽 영역을 철저히 세척합니다. 이때 세척수 또한 분별 깔때기에 수집해야 합니다.침전 과정이 진행되는 동안 건조를 위해 체를 분별 깔때기 위에 올려두십시오. 침전 과정을 시작하려면 여과된 소화액을 분별 깔때기에 30분 동안 유지하여 Trichinella 유충이 깔때기 바닥에 가라앉도록 합니다. 침전이 완료되면 분별 깔때기의 콕을 완전히 열어 소화액을 최소 20밀리리터가 메스실린더로 빠르게 흘러나오게 합니다.그런 다음, 스톱콕을 반대 방향으로 완전히 열어 소화액 10 milliliters가 통과하도록 합니다. 마지막으로, 스톱콕을 다시 반대 방향으로 열어 소화액 10 milliliters가 더 메스실린더로 들어가게 합니다. 유충이 가라앉을 수 있도록 실린더에 담긴 40 milliliters의 소화액을 10분 동안 그대로 둡니다.소화되지 않은 조직의 양을 측정합니다. 침전 깔때기에서 체를 들어 올리고 페이퍼 타월로 체를 건조시킵니다. 소화되지 않은 조직이 포함된 체의 무게에서 여과 전 체의 무게를 뺍니다.시작 시료 무게의 5% 이하가 체에 남아 있는 경우 소화 과정이 만족스러운 것으로 간주합니다. 소화되지 않은 조직의 양이 5%를 초과하면 새로운 근육 시료를 사용하여 소화를 반복하십시오. 새로운 시료를 사용할 수 없는 경우, 남은 물질을 다시 소화시키십시오.소화액이 실린더 내에 10분 동안 머문 후, 10mL의 침전물을 건드리지 않은 상태에서 피펫으로 상층액 30mL를 흡입하여 제거합니다. 시료 내 조직 섬유의 양을 줄이기 위해 침전물에 수돗물 30mL를 추가하고 10분 동안 더 둡니다. 액체가 투명해질 때까지 이 세척 과정을 반복합니다.액체가 투명해지면 상층액을 제거하고, 세척된 침전물 10 milliliters를 격자 petri dish로 옮깁니다. 실린더를 수돗물 10 milliliters로 헹구고 그 물을 세척된 침전물에 추가합니다. 세척 단계 직후, 강도 조절이 가능한 하부 투과광 광원을 갖춘 trichinoscope 또는 실체 현미경을 사용하여 시료를 검사합니다.15~20배율의 확대경을 사용하여 페트리 접시를 격자 단위로 체계적으로 검사하십시오. 의심되는 구조물이 발견되지 않으면, 접시 내의 액체를 원형으로 부드럽게 움직여 잠재적으로 간과되었을 수 있는 Trichinella 유충이 접시 중앙에 모이도록 합니다. 그 후 검사를 반복하십시오.의심되는 구조물이 발견되면 배율을 40배에서 100배로 높입니다. 피펫을 사용하여 접시에서 Trichinella 유충을 제거하고 용기에 수집합니다. 접시 전체의 검사가 완료되면, 접시를 가볍게 흔드는 단계부터 시작하여 현미경 검사 절차를 반복합니다.이 절차를 최소 3회 반복하거나, 더 이상 유충이 발견되지 않을 때까지 반복하십시오. 근육 조직 g당 유충 수를 결정하십시오.소화액 내에 유충이 너무 많아 유충 수를 정확하게 판별할 수 없는 경우, 유충이 포함된 액체를 다시 메스실린더로 옮깁니다. 세척병의 수돗물로 접시를 헹구고, 유충이 바닥에 가라앉을 때까지 둡니다. 10분간 침전시킨 후, 메스실린더 바닥의 유충을 1 mL씩 새 실린더로 옮겨 소화액을 정해진 부피로 줄입니다.강하게 흔들어 유충을 10 mL 내에 균일하게 현탁합니다. 흔드는 동안, 유충 현탁액 20 µL를 12방울 피펫으로 취해 페트리 접시에 떨어뜨립니다. 현미경으로 각 20 µL 방울을 관찰하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유충의 총 수를 계산합니다.Trichinella 유충의 현미경 검사 전에, 유충 식별을 방해할 수 있는 부유물을 제거하기 위해 각 시료를 충분히 세척하는 것이 중요합니다. Trichinella 유충의 길이는 0.7에서 1.5 mm이며, 너비는 약 0.3 mm입니다. 식도는 좁으며 끝부분은 약간 둥근 형태입니다.스티코솜(stichosome)은 체강의 전반부에 위치한 구조물로, 45~55개의 커다란 세포열로 둘러싸인 길고 가느다란 관으로 구성되어 있습니다. 직장 또한 돌출부나 부속기관 없이 둥근 형태입니다. 소화 후에는 감염성 근육 유충의 모양이 다양해질 수 있어 식별이 더 어려워질 수 있습니다.전형적인 형태로는 촘촘하게 말려 있거나 느슨하게 말려 이동하는 유충, C자형 유충, 또는 완전히 펴진 유충 등이 있습니다. 근육 소화 후에는 Trichinella 유충 외의 다른 구조물들이 발견될 수 있습니다. 멧돼지에서 발견된 우연한 사례로는 지렁이의 강모와 유사한 털, 흡충인 Alaria alata, 근섬유, Metastrongylus 속의 선충, 식물 섬유, 그리고 Toxocara 회충의 유충 등이 있습니다.기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 약 2시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 가장 중요한 중요관리점(critical control points)을 고려하여 마그네틱 스터러법으로 육류 내 Trichinella 유충을 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

이 프로토콜은 기계적 분리, 효소 해리, 여과 및 차등 초원심분리를 통해 설치류 근육 조직에서 골격근 간질성 세포외 소포체(SkM-EV)를 분리하고 정제하는 것을 목표로 합니다. 일관성과 신뢰성을 보여줍니다. 분리된 SkM-EV는 근육 항상성 및 질병에 대한 통찰력을 제공하며, 진단 바이오마커 또는 치료 수단으로 응용될 수 있습니다.

골격근 간질성 세포외 소포체의 효소 분리

배우세요 고기 샘플에서 Trichinella 유충을 검출하는 자석 교반기 방법을. 이 기술은 식품 안전과 기생충학 연구에 필수적인 진단 도구로, 정확한 품질 관리가 필요합니다.

의 검출을위한 자석 교반기 방법

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