대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

이 미세수술 기술의 전반적인 목표는 대장직장 종양 세포를 두골 벽에 주입하여 생쥐에서 재현 가능하고 전이된 결장직장 종양을 유도하는 것입니다. 이 방법은 순환 종양 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있으며, 주요 장점은 재현성이 높고 균일한 종양으로 신뢰할 수 있는 병기 예측 및 순환 종양 세포 예측이 가능하다는 것입니다. 먼저 외상성 겸자를 사용하여 6-8주 된 면역력이 저하된 쥐의 맹장을 조심스럽게 외부로 제거합니다.

맹장의 막힌 끝을 복부에 올려 주머니가 두개골을 가리키도록 합니다. 두근 내 주사의 경우 30게이지 카넬라가 장착된 표준 1ml 주사기를 장착하고 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 마이크로 주입 펌프에 종양 세포와 함께 로드합니다. 다음으로, 외상성 겸자를 사용하여 맹장 끝을 조심스럽게 잡고 따뜻한 식염수를 적신 두 번째 집게를 사용하여 맹장을 아래쪽으로 부드럽게 펴십시오.

이제 동물을 양안 수술 현미경으로 옮기고 카넬라가 맹장과 바로 평행하고 위에 있게 하고 두 개의 외상성 집게를 사용하여 맹장의 바깥쪽 끝 양쪽 끝에 있는 조직을 조심스럽게 늘립니다. 초기 침투 지점을 넘어 벽의 전체 벨트 또는 장막에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하면서 수액을 수액 위로 천천히 당기고 혈관 위와 벽 벨트 내부의 얇은 반투명 막 아래에 수사를 놓습니다. 카넬라가 제자리에 있으면 풋스위치를 사용하여 20초 동안 20마이크로리터의 세포를 주입합니다.

얇은 반투명 혈청 내벽 사이, 벽내 혈관과 근육 위. 모든 세포가 주입되면 조심스럽게 카넬라를 제거하고 맹장 아래에 드라이 스왑을 놓습니다. 인공 복막 전파를 방지하기 위해 누출된 세포를 철저한 증류수 헹굼으로 용해하고 맹장을 복강으로 부드럽게 되돌려 놓습니다.

빠르게 흡수되는 흐르는 봉합사로 복벽을 닫고, 수술 상처 클립으로 피부의 복벽을 닫습니다. 그런 다음 마우스를 섭씨 38도로 설정된 가열 매트에 놓고 완전히 누울 때까지 모니터링합니다. 순환하는 종양 세포를 분리하기 위해 적절한 실험 종료 지점에서 15ml 원뿔형 튜브를 튜브당 5ml의 밀도 구배 매체로 채우고 종양 보유 동물에서 수집한 전혈 샘플을 밀도 구배층으로 조심스럽게 옮깁니다.

원심분리로 세포를 분리하고 단핵 세포를 포함하는 계면을 조심스럽게 회수합니다. 두 번째 원심분리를 위해 단핵 세포를 새로운 15ml 튜브에 피펫으로 넣습니다. 그 후 PBS에서 튜브 세척

두 번째 세척 후 EDTA를 보충한 200마이크로리터의 PBS에 펠릿을 다시 현탁시키고 각 샘플에 4마이크로리터의 안티 앰프 캠프 항체를 추가하여 어둠 속에서 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 소수성 배리어 펜을 사용하여 샘플당 하나의 멸균 6cm 페트리 접시에 약 1cm의 원을 그리고 각 원에 700마이크로리터의 피킹 버퍼를 추가한 다음 50마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 현미경을 사용하여 세포의 밀도를 확인하고 샘플이 약 5분 동안 가라앉도록 합니다.

그런 다음 세포 방울에서 amp camp 양성을 스크리닝하고 micromanipulator를 사용하여 관심 세포를 의도된 후속 다운스트림 분석을 위해 적절한 완충액의 15마이크로리터로 이동합니다. 이 모델에서 결장 직장 세포를 사용하면 종양 세포 주입 후 35일 이내에 원발성 종양이 약 10mm 크기로 측정되고 간, 폐 전이, 순환 종양 세포가 거의 예외 없이 존재하는 더 많은 풍부한 마우스를 안정적으로 얻을 수 있습니다. 또한, 순환하는 종양 세포는 다운스트림 분석을 위해 쉽게 분리할 수 있습니다.

일단 숙달되고 적절하게 수행되면 이 기술은 10분 이내에 수행할 수 있으며, 치료 및 분자 연구에 모두 사용할 수 있는 균일한 종양 및 전이성 종양의 형성을 촉진합니다. 이 모델의 한계에는 자체 한계가 있는 세포 용해효소에 대한 의존성과 마우스의 면역 결핍이 포함되며, 둘 다 돌연변이 결장직장암 세포를 사용하여 극복할 수 있습니다. 단순성으로 인해 이 모델은 현재 사용 가능한 대장암 모델에 대한 귀중한 부록이 될 수 있습니다.