Name: 골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 배우세요 두꺼운 뇌 섹션에서 골지-콕스 염색법을 사용하여 수상돌기가 긴 뉴런을 시각화하는 방법을. 이 기술은 단일 조직 샘플 내에서 뉴런 형태를 연구하고 실험적 처리 효과를 평가하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회, 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 프로젝트 번호 30381)에서 CDCB에 존 R. 에반스 지도자 기금 연구 인프라 보조금, 그리고에 의해에서 CDCB에 발견 그랜트에 의해 지원되었다 NSERC에서 NJM에 발견 그랜트. ELL는 온타리오 대학원 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다. CDS는 NSERC에서 학부 학생 연구 조교에 의해 지원되었다. ALM은 NSERC에서 알렉산더 그레이엄 벨 (Alexander Graham Bell) 장학금에 의해 구 엘프 대학의 온타리오 수의과 대학에서 OVC 장학금에 의해 지원되었다.

성인 여성 CD1 - 변형 마우스는이 연구에 사용되었다. 유사 염색은 다양한 연령층에서 남녀 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험 동물은 원칙과 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침에 따라 마음에 든다고하고, 실험 프로토콜은 구 엘프 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었다. 1. 골지 - 콕스 염색 <ol><li> 두뇌의 골지 - 콕스 함침 <ol><li> 별도로 고품질 물로 칼륨 중크롬산 및 크롬산 칼륨을 용해시켜 1 %의 골지 - 콕스 용액 (w / v)의 중크롬산 칼륨 0.8 % (w / v)의 크롬산 칼륨 1 % (w / v)의 염화 수은 만들기 . 상기 혼합 용액을 염화 수은을 추가 등급 1 여과지를 이용하여 최종 용액을 필터. 최대 1 개월 어둠 속에서 솔루션을 저장합니다. </li><li> 5 %의 이소 플루 란을 사용하여 마우스를 마취. </li><li> 잘린 마우스를 안락사 빠르게 두뇌를 제거합니다. </li><li> 골지 - 콕스 용액 17 mL를 함유하는 20 ML 글래스 섬광 바이알로 뇌를 놓고 25 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다. </li><li> 24 시간 동안 4 ℃의 어두운 곳에서 (0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4 / V) 슈 크로스 W (30 %) 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌 Cryoprotect. 주 : 다음 옵션 세 단계가 장기 저장이 단계에서 뇌를 고정하기 위해, 주요 프로토콜의 대안으로 사용될 수있다. </li><li> 드라이 아이스에 미리 냉각 된 200 ㎖의 이소 펜탄에 침지하여 뇌 전체를 고정. </li><li> -80 ℃에서 어둠 속에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 저장 동결 뇌 놓는다. </li><li> 준비가 진행하면, 24 시간 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 자당 동결 방지제를 40㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배치하여 뇌를 해동. </li></ol></li><li> 뇌 단면 <ol><li> 자당 및 블록에서 뇌를 제거면도날을 사용하여 소뇌를 차단하고, 뇌의 나머지 꼬리 단부에 평탄한 가장자리를 남겨 절편 대 케이. </li><li> 열 한천 (3 % (w / v)의 물)가 용융 그것의 녹는 점보다 약간 때까지 식지 때까지. </li><li> 그 꼬리 끝면이 아래로 작은 일회용 무게 접시에 두뇌를 놓고 두뇌를 포함 용융 한천의 충분한 양을 추가합니다. </li><li> 한천은 고형화되면, 약 2 이탈 초과 한천 트림 - 뇌를 둘러싸고 4mm 및 에틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 사용하여 꼬리 단면 다운 가진에 vibratome의 스테이지 뇌 접착제. </li><li> 400, 슬라이스 두께 뇌 및 단면 뇌 다루 자당 동결 방지제의 충분한 양을 가진에 vibratome의 스테이지 영역 채움 - 86 Hz의 진동 주파수를 사용하여 (피검 뇌 영역에 따라) 500 ㎛ 또는 0.125 mm / s의 블레이드 발전 속도. </li><li> 작은 페인트 브러시를 사용하여상업적으로 이용 가능한 메쉬 바닥 인서트와를 함유하는 6- 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 위치 뇌 부분 미리 작성된 6 % 10 ㎖의 0.1 M 인산 완충액, pH를 7.4 (w / v)의 자당. </li><li> CO 4 ° / N의 어두운 부분을 부화. </li></ol></li><li> 뇌 섹션 개발 <ol><li> 메쉬 바닥 인서트를 사용하여 0.1 M 인산 완충액, pH 7.4의 웰에 2 %의 파라 포름 알데히드 5 ㎖ (/ V w) (PBD)를 포함하는 신규로 뇌 단면을 옮긴다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 저속으로 이동하는 로커 인큐베이션. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다. </li><li> 2.7 % (V / V) 수산화 암모늄을 함유하는 5 ㎖의 새로운 웰로 수수 부. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 느린 속도로 이동 로커에 부화. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 오 세척5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동 NA 로커. </li><li> 또한 정착액 (A)의 5 ㎖을 함유하는 신규로 수수 부 원래 구입 농도에서 물에 10 배 희석 한 것 (재료 표 참조). 25 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 느린 속도로 이동 로커에 부화. </li><li> 5 ㎖의 물을 함유하는 새로운 우물로 전송하여 두 부분을 씻는다. 5 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 중간 속도로 이동하는 로커 씻는다. </li></ol></li><li> 뇌 섹션을 장착 <ol><li> 작은 페인트 브러시를 사용하여, 현미경 슬라이드 위에 섹션을 탑재합니다. 여분의 물을 제거하고 핀셋과 작은 조직을 사용하여 한천. 모든 한천 탈수를 진행하기 전에 제거되었는지 확인합니다. </li><li> 약 45 분 (400 개 ㎛의 부분) 또는 90 분 (500 개 ㎛의 부분)을 실온에서 공기 건조시킨 부분을 허용한다. 주 : 건조시기 적절한 수준은 중요하고, 각 결정해야기관 주위 온도 및 습도 수준에 따라. 너무 짧은 건조 시간 이후 탈수 단계에서 슬라이드 탈락 섹션에 이르게, 너무 긴 건조 시간이 균열 부분에 연결됩니다. 섹션은 여전히 ​​건조의 적절한 수준에서 반짝 것으로 나타납니다. </li><li> 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 크레 실 바이올렛 염색 섹션. 참고 :이 옵션 단계는 크레 실 바이올렛 신경 세포 핵을 염색하기 위해, 동결 된 적이 섹션을 위해 사용될 수있다. 우리는 지우고 크레 실 바이올렛 부화하기 전에 섹션을 재수하는 경우에도 염색 및 섹션에서 저 배경에 이르게 것으로 나타났습니다. <ol><li> 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 물에이어서, 물에 95 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 물에이어서 50 % 에탄올. </li><li> 5 분 동안 물에 놓는다. </li><li> 0.5 %에서 발생 CRE (/ V w)7 분 동안 물 SYL 보라. </li><li> 2 분 동안 물에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li></ol></li><li> 나타낸 바와 같이, 코 플린 염색 단지에 배치하여 슬라이드 부 탈수. <ol><li> 물 다음, 물 50 % 에탄올 75 % 에탄올을 배치하고, 2 분마다 수중 후 95 % 에탄올. </li><li> 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓는다. 한 번 반복합니다. </li><li> 5 분 동안 에이전트를 삭제에 놓는다. 한 번 반복합니다. 참고 :이 탈수 및 청소 시간이 원고에 설명 된대로 마우스의 뇌를 처리하기에 충분합니다. 그러나, 우리는 최종 청산 단계는 15 분 총까지 연장해야 할 수도, 쥐 cowbird을 포함한 다른 종에서 관찰했다. </li></ol></li><li> 무수 장착 매체를 이용하여 커버 슬립 구간. </li><li> 슬라이드는 적어도 5 일 동안 실온에서 어두운 곳에서 수평으로 건조 할 수있다. </li></ol></li></ol> 두꺼운 뇌 섹션 내에서 2 이미징 스테인드 뉴런 <ol><li> 이미지 스택을 캡처 </강한&gt; <ol><li> 현미경 전구, 카메라, 무대 컨트롤러를 켭니다. </li><li> 현미경 소프트웨어 (예를 들어, Neurolucida)를 엽니 다. </li><li> 현미경 무대에 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 예컨대 1.25 0.4 NA PlanAPO 또는 4X 0.16 NA로 저배율 대물 렌즈를 이용하여 뇌 단면의 2D 시야각 이미지를 캡처 <ol><li> 이미지 초점 및 노출 시간 및 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션의 아무 곳이나 왼쪽 버튼으로 클릭하여 기준점 만들기 </li><li> 이미지 획득 창에서 &quot;하나의 이미지를 획득&quot;을 선택하여 이미지를 캡처합니다. </li></ol></li><li> 10 배 NA 0.3 UPlan FL N 목적을 사용하여 관심의 뉴런 (들)를 함유하는 영역의 중간 해상도 이미지를 캡처 스택. <ol><li> 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션 A의 정상에 초점을 맞춤으로써 이미지 스택의 상단 및 하단 경계를 설정ND 선택 화상 획득 창에서 &quot;스택 상단 &#39;옆 다음 섹션의 바닥에 집중하고, 화상 획득 윈도우 내에 다음에&quot;바닥 스택 &quot;,&quot;설정 &quot;을 선택&quot;설정 &quot;. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 사이의 거리를&quot;다음 &quot;5 μm의&quot;을 입력하여 5 ㎛ 인 스텝 거리를 설정한다. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 획득 스택&quot;을 선택하여 이미지 캡처 스택. </li><li> 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 30 배 NA 1.05 실리콘 오일 액침 대물를 사용 관심 뉴런을 포함하는 영역의 높은 해상도 이미지를 캡처 스택. <ol><li> 대물과 OI과 접촉하도록 보장 슬라이드 침지 실리콘 오일 4 방울 슬라이드 위에 대물 배치 - 3 적용엘. </li><li> 이미지를 초점과 노출, 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다. </li><li> 섹션 상단에 포커싱 &quot;설정&quot;을 선택하여 이미지 스택 상위 및 하위 경계를 설정 다음 다음 이미지 획득 창에서, 및 &quot;스택의 상단&quot;부분의 바닥에 집중하고 선택하는 「설정」 이미지 획득 창에서 &quot;스택의 하단에&quot;옆에. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 사이의 거리를&quot;다음에 &quot;1 ㎛&quot;을 입력하여 1 ㎛의 단계의 거리를 설정한다. </li><li> 화상 획득 창에서 &quot;이미지 획득 스택&quot;을 선택하여 이미지 캡처 스택. </li><li> 모든 이미지 스택은 X 축과 Y 축에 10 % 이상 겹치는 것을 확인하고, 관심의 전체 영역을 캡처하려면 위의 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 데이터 파일을 저장하고 외부 처리를 위해 TIFF 형식의 모든 이미지 파일을 저장합니다. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> Z 프로젝션 이미지와 이미지 몽타주 만들기 <ol><li> ImageJ에있는 Z-투사 이미지 만들기 <ol><li> 바이오 형식 플러그인이 설치되어 열기 ImageJ에 소프트웨어. </li><li> &quot;플러그인&quot;을 선택 -&gt; &quot;바이오 형식&quot;-&gt; &quot;바이오 형식 가져 오기&quot;. </li><li> 이미지 스택 파일을 선택 열 수 있습니다. </li><li> &gt; &quot;유형&quot;- -&gt; &quot;RGB 색상&quot;파일이 열리면, &quot;이미지&quot;를 선택하여 RGB의 형식을 변경합니다. </li><li> &quot;이미지&quot;를 선택하여 Z 프로젝션 만들기 -&gt; &quot;스택&quot;-&gt; &quot;Z 프로젝트 ...&quot;. </li><li> TIFF 파일로 두 개의 차원 Z 프로젝션 이미지를 저장합니다. </li></ol></li><li> 관심의 전체 영역의 2 차원 이미지의 몽타주를 작성합니다. <ol><li> (예를 들어, 어도비 포토샵) 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> &quot;파일&quot;을 선택 -&gt; &quot;자동화&quot;-&gt; &quot;진 Photomerge를&quot;. </li><li> 선택 &quot;찾아보기&quot;및 모든 IMAG을 추가ES 파일을 병합 할 수 있습니다. </li><li> &quot;함께 이미지를 혼합&quot;을 선택하고 &quot;확인&quot;을 선택해야합니다. </li><li> TIFF 파일로 관심의 전체 영역의 결과 몽타주 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

우리는 두께 뇌 부분에서 신경을 시각화 여기 골지 - 콕스 염색 프로토콜이 유용한 변종과 함께 설명합니다. 대표 결과에 나타낸 바와 같이, 긴 800 μm의 작동 거리가있는 고해상도 목적의 사용은 500 μm의 절단 뇌 부분의 깊이에 걸쳐 전체 뉴런의 신뢰성 시각화 수 있습니다. 비교적 두꺼운 뇌 섹션의이 연구는 모든 유형의 스테인드 신경 세포가 완전히 길고 복잡한 꼭대기 수지상 나무와 피라미드 뉴런에 특히 중요하다 슬라이스에 포함되는 확률을 증가시킨다. 예를 들어, 설치류 뇌의 관상 부에, 이는 입쪽 또는 꼬리 방향으로 멀리 연장 뉴런의 포함을 가능하게하고, 절편 단계 정면 뇌 차단시에도 오차 자유도를 증가시킨다. 우리는,이 프로토콜은 다른 PL에 절편을 위해 적용 할 수있는 관상면에서 절편의 뇌를 설명하지만필요에 따라 anes 완전히 하나의 섹션 내에서 신경 세포를 표지 포함합니다. 고용 단면의 평면은 조사중인 신경 세포 인구의 형태 학적 특성에 따라 달라집니다. 돌기 쪽이 시각과 높은 배율의 대물 렌즈가 척추 입력 / <...

조직 샘플 내의 개별 뉴런의 시각화는 뇌에 대한 우리의 이해를 전진 크게하고이 내인성 질환이나 외생 적 환경 적 요인에 의해 영향을받을 수있는 방법 신경 세포의 형태 학적 특성의 현장에서 분석이 가능합니다. 골지 - 콕스 염색법은 뇌에서 뉴런의 무작위 샘플을 염색하는 비용 효율적인 상대적으로 단순한 방법이다. 먼저 1800 년대에 골지 (1)에 의해 개발 콕스 2에 의해 수정, 연구자들은 또한, 시각화 및 수지상 트리 형태와 척추 밀도 3, 4 모두 정량화하는 데 사용할 수있는 명확하고 잘 스테인드 뉴런을 생산하기 위해 수년에 걸쳐이 기술을 세련했다 5, 6, 7, 8, 9,. 뇌 섹션 내에서 스테인드 뉴런의 시각화를위한 주요 기술적 인 고려 사항은 가능한 고배율 / 고해상도 현미경 목표의 작동 거리에 의해 제한되는 최대 슬라이스 두께입니다. 60 공통 오일 침지 목표 - 100X는 뛰어난 해상도를 제공 범위하지만, 일반적으로 200 μm의보다 크지 않습니다 자신의 작업 거리에 의해 제한됩니다. 200 ㎛의 범위로 잘라 뇌 절편 대뇌 피질 (10),의 CA1 영역 11, 12, 피라미드 신경의 얕은 층에서의 예시적인 피라미드 신경이 슬라이스 두께 내에 포함될 수있는 소정의 신경 세포 유형을 시각화하기 적합 할 수 해마 (15)의 치아 이랑에서 해마 13, 14, 및 과립 세포. 상대적으로 이상과 뉴런이러한 뇌 전체 수지상 트리를 포함하는 완벽한 각도로 구분 될 필요가 있기 때문에 셀 본체 (16)에서 800 μm의를 확장 할 수 있습니다 마우스, 더 큰 도전을 제공하는 대뇌 피질의 깊은 층에서 피라미드 신경 세포로 수지상 나무, 200 개 μm의 슬라이스 내의. 수지상 또는 분기 중 입쪽 또는 꼬리 방향으로 연장되는 경우에도 실현 될 수 없다. 그것은 다수의 뇌에 인접 섹션에 걸쳐 신경을 추적하여 이러한 제약을 해결하는 것이 가능하지만,이 방식은 17 정확하게 추적하는 섹션을 정렬하는 데 중요한 기술적 도전을 소개한다. 더 실용적인 접근 방식은 더 큰 두께로 잘라 뇌 섹션에 포함 된 전체 뉴런을 시각화하는 것입니다. 골지 - 콕스 방법을 사용하여 마우스의 500 μm의 두께 뇌 부분, 그들의 개월을 시각화 - 우리는 여기에 (400) 내에서 신경 세포를 염색하는 기술을보고rphology 800 μm의 작동 거리를 갖는 고해상도 실리콘 오일 침지 목적을 사용. 우리가 설명하는 골지 - 콕스 함침 처리 프로토콜은 문헌 (6)에 가장 많이 인용 된 현대 프로토콜 중 하나에서 수정됩니다. 두꺼운 뇌 섹션 우리의 접근 방식은 완전히 섹션에 포함 된 모든 유형의 뉴런을 식별의 가능성을 증가시키는 장점을 제공한다. 기본 프로토콜뿐만 아니라, 또한 독특한 장점 제공 본 개의 변형 : 위해 장착 섹션의 표면 상 크레 실 바이올렛 Counterstain과 함께 (1) 골지 - 콕스 염색 뇌 영역의 경계를 정의하고, 레이어를 식별 할 단면 처리 및 최종 처리 이전에 함침 전체 뇌의 장기 저장을위한 중간 제빙 단계와 대뇌 피질, (2) - 골지 콕스 염색.

<table><tbody><tr><td>중크롬산 칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>P188-100</td><td>유해</td></tr><tr><td>크롬산 칼륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>P220-100</td><td>유해</td></tr><tr><td>염화수은</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25423</td><td>유해</td></tr><tr><td>Whatman 등급 1 여과지</td><td>Fisher Scientific</td><td>1001-185</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>캐나다 제약 파트너</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>20mL 섬광 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Bioshop Canada</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>시그마 Aldrich</td><td>S5011-500G</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기</td><td>성 시그마 Aldrich</td><td>S9390-500G</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원추형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>이소 펜탄</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC126470010</td><td>2- 메틸 부탄으로도 알려져 있습니다. 위험</td></tr><tr><td>한천</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-100G</td><td></td></tr><tr><td>소형 중량 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>6-well tissue culture plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1b</td><td></td></tr><tr><td>메쉬 바닥 조직 배양 인서트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-214</td><td></td></tr><tr><td>파라포마델히드(PFA), 16%</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710-S</td><td>유해</td></tr><tr><td>수산화암모</td>늄 <td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>유해</td></tr><tr><td>코닥 고정제 A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7542</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼프로스트 플러스 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>CitroSolv 투명화제</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>무수 에틸 알코올</td><td>상업용 알코올</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>크레실 바이올렛</td><td>시그마 알드리치</td><td>C1791</td><td></td></tr><tr><td>퍼마운트</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>정립 현미경</td><td>올림푸스</td><td>BX53 모델</td><td></td></tr><tr><td>컬러 카메라, 12</td>비트 <td>MBF Biosciences</td><td>DV-47d</td><td>QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td></tr><tr><td>3D 전동 현미경 스테이지, 컨트롤러 및 에노더</td><td>MBF Biosciences</td><td>N/A</td><td>MBF Biosciences</td></tr><tr><td>4X 현미경 대물</td>렌즈 <td>Olympus</td><td>4x 0.16 N.A. UplanSApo</td><td></td></tr><tr><td>10X 현미경 대물</td><td>렌즈 Olympus</td><td>10x 0.3 N.A. UPlan FL N&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30X 현미경 대물</td>렌즈 <td>Olympus</td><td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60X 현미경 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 이멀젼 오일</td><td>Olympus</td><td>Z-81114</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 소프트웨어</td><td>MBF Biosciences</td><td>버전 10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>미국 국립보건원(U.S. National Institutes of Health)</td><td>현재 버전</td><td>OME Bio-Formats 플러그인 설치</td></tr><tr><td>포토샵 소프트웨어</td><td>Adobe</td><td>버전 CS6</td><td></td></tr></tbody></table>

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

신경 세포 염색의 골지 - 콕스 방법은 조직 학적 뇌 샘플 내에서 신경 세포의 형태에 대한 우리의 이해를 사전에 200 개 이상의 년 동안 사용되어왔다. 완전히 단일 구역 내에 포함 된 스테인드 뉴런을 식별하는 가능성을 증가시키기 위해, 가능한 한 최대 두께 뇌 부분을 제조 실용적인 관점에서 바람직하지만,이 방법은 높은 작업 거리만큼 기술적 인 관점에서 제한 -magnification 현미경 목표. 우리는 여기에 500 개 μm의 두께로 절단 마우스 뇌 섹션의 골지 - 콕스 방법을 사용하여 신경 세포를 염색하고, 고해상도 30 배 1.05 NA 실리콘 장착 직립 현미경을 사용하여이 부분의 깊이를 통해 뉴런을 시각화하기 위해 프로토콜을보고 800 μm의 작동 거리를 갖는 오일 액침 대물. 우리는 또한의 표면을 Counterstain과에 이용 될 수있다이 프로토콜의 두 가지 유용한 변종을보고크레 실 바이올렛 니슬 뇌 부분을 장착하기 전이나 절편 및 최종 처리에 장기 저장을위한 전체 뇌 동결. 주요 프로토콜과의 두 가지 변종은 전체 신경 세포의 수지상 나무와 수상 돌기 가시가 안정적으로 시각화 및 정량화 할 수있는 전체에 스테인드 두께 뇌 부분을 생산하고 있습니다.

500 μm의 두께 뇌 구역 -이 골지체 콕스 - 염색 프로토콜과 두 바와 선택적 변이체 (400) 내의 개별 뉴런을 시각화하는데 이용 될 수있다. 10 배의 대물 렌즈와 Z 축에서 5 ㎛의 단계를 사용하여 캡처 이차원 Z-돌기 대표 화상 몽타주는도 1에 도시된다 : A1 - 전방 피질 영역 (1)과를 포함하는 코로나 뇌 부분의 넓은 영역에 대한 C1 이차 운동 피질 (18). 섹션 500 μm의 절단했다. 도 1B1의 부분의 표면을 따라 피질 pial 레이어 1 본 크레 실 바이올렛 염색 프로토콜을 포함하는 변형, 예를 들어 피질 세포층의 식별이 가능합니다. 모든 신선한 조직 (그림 1A1)과 프로토콜의 변형을 사용하여 주요 프로토콜을 사용하는 경우도 스테인드 섹션의 유사한 ...

우리는 하나의 조직 샘플에 포함 된 긴 수지상 나무와 뉴런을 시각화하기 위해, 두께 뇌 부분에 골지 - 콕스 염색 방법을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 두 가지 변종은 크레 실 바이올렛으로 대조, 장기 저장을위한 처리되지 않은 뇌의 동결을 포함 그되게됩니다.

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

본 절차의 전반적인 목표는 설치류 뇌 내 뉴런의 형태에 미치는 효과적인 처리를 결정하는 것입니다. 이 방법은 설치류 뇌의 다양한 영역 내 뉴런의 정상적인 형태 및 실험적으로 조작된 형태와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 조직학적 샘플 내에 완전히 포함된 표지 뉴런을 식별하고 시각화할 확률을 높인다는 점입니다.신선한 마우스 뇌를 17 mL의 Golgi-Cox 용액이 들어 있는 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에 넣어 Golgi-Cox 염색을 시작합니다. 빛을 차단하고 상온에서 25일 동안 배양합니다. 배양 기간이 지나면, 뇌를 40 mL의 sucrose 동결보호제에 넣어 동결 보호 처리하고, 4 °C의 암소에서 24시간 동안 배양합니다.sucrose에서 배양한 후, 뇌는 장기 보관을 위해 냉동하거나 비디오의 다음 섹션에서 보여주는 것과 같이 섹셔닝을 위해 즉시 블로킹할 수 있습니다. 냉동하는 경우, 드라이아이스로 예냉시킨 isopentane 200 milliliters에 뇌 전체를 담급니다. 그런 다음 냉동된 뇌를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)에 넣고 -80 °C의 암소에 보관하십시오.먼저, 자당 용액에서 뇌를 꺼냅니다. 그 다음 면도날을 사용하여 소뇌 부분을 절단함으로써 뇌의 남은 미측 끝단에 평평한 모서리를 만들어 섹셔닝을 위한 블로킹을 수행합니다. 관심 뉴런이 결과 섹션 내에 완전히 포함되도록 하려면 뇌를 정확한 각도로 블로킹해야 합니다.예를 들어, 대뇌 피질 피라미드 뉴런의 경우 주둥이-꼬리 축(rostral caudal axis)에 완전히 수직인 관상면을 사용합니다. 다음으로, 한천(agar)을 녹을 때까지 가열합니다. 그리고 융점보다 약간 높은 온도까지 식힙니다.그 다음, 뇌의 꼬리쪽 끝이 아래로 향하게 하여 작은 일회용 무게 측정 접시에 넣습니다. 뇌가 덮이도록 녹인 한천을 추가합니다. 한천이 굳으면, 뇌 주변에 약 2~4 mL가 남도록 여분을 잘라냅니다.그 다음, 소량의 ethyl cyanoacrylate를 사용하여 뇌의 미측(caudal end)이 아래로 향하게 하여 바이브라톰(vibratome) 스테이지에 고정합니다. 바이브라톰 스테이지 영역에 뇌가 충분히 잠길 정도로 sucrose 동결방지제를 채웁니다. 그 후, 검사하려는 뇌 영역에 따라 400에서 500 microns 두께로 뇌를 절편화합니다.작은 붓을 사용하여, mesh 바닥 인서트가 포함되고 sucrose M phosphate buffer가 미리 채워진 6-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 뇌 절편을 넣습니다. 절편 제작 과정 동안 빛으로부터 보호하십시오. 절편 제작이 완료되면, 절편을 4 °C의 암소에서 하룻밤 동안 배양합니다.메쉬 바닥 인서트를 사용하여 뇌 절편을 인산염 완충액에 희석된 파라포름알데히드 5 mL가 들어 있는 새 웰로 옮깁니다. 실온의 암소에서 저속으로 작동하는 로커 위에서 15분 동안 배양합니다. 절편을 증류수 5 mL가 들어 있는 새 웰로 옮겨 두 번 세척합니다.빛을 차단한 상태에서 실온에서 5분 동안 중간 속도로 세척합니다. 다음으로, 절편을 5 mL의 수산화암모늄이 담긴 새 웰로 옮깁니다. 암실 상태의 실온에서 15분 동안 천천히 흔들어 줍니다.절편을 5mL의 물이 담긴 새 웰로 옮겨 두 번 세척합니다. 실온의 암실에서 중간 속도로 작동하는 로커(rocker)를 사용하여 5분 동안 세척합니다. 절편을 5mL의 희석된 고정액 A가 담긴 새 웰로 옮깁니다. 실온의 암실에서 느린 속도로 작동하는 로커를 사용하여 25분 동안 인큐베이트합니다.이전과 동일하게 섹션을 물로 두 번 세척합니다. 작은 붓을 사용하여 섹션을 현미경 슬라이드 위에 올린 다음, 핀셋과 작은 티슈를 사용하여 과잉의 물과 아가르를 제거합니다. 탈수 단계를 진행하기 전에 모든 아가르가 제거되었는지 확인하십시오.차광 상태의 실온에서 절편을 자연 건조합니다. 적절한 건조 시간을 설정하는 것이 매우 중요하며, 이는 각 실험실 상황에 맞게 결정해야 합니다. 건조 시간이 너무 짧으면 탈수 단계에서 절편이 슬라이드에서 떨어질 수 있으며, 너무 길면 절편에 균열이 생길 수 있습니다.건조 후, 먼저 슬라이드를 투명제에 5분 동안 담급니다. 슬라이드를 100% ethanol에 5분 동안 담급니다. 그 후, 농도가 점차 낮아지는 일련의 ethanol 용액에 각각 2분씩 옮겨 담습니다.알코올 계열 처리가 끝난 후, 슬라이드를 물에 5분 동안 둡니다. 그 후 0.5% cresyl violet 수용액으로 7분 동안 염색합니다. cresyl violet 염색 후, 슬라이드를 물에 2분 동안 둡니다.그런 다음 농도가 점차 증가하는 알코올 시리즈로 각 2분씩 절편을 탈수시킵니다. 이어서 100% ethanol로 5분 동안 두 번 세척합니다. 투명화제에 5분 동안 담가둡니다.마지막으로 무수 봉입제를 첨가하고 절편 위에 커버 슬립을 덮습니다. 슬라이드를 실온의 암소에서 수평으로 눕힌 상태로 최소 5일 동안 건조시킵니다. 관심 뉴런이 포함된 영역의 고해상도 이미지 스택을 캡처하려면, 먼저 현미경에서 30X 1.05 NA 실리콘 오일 침강 렌즈를 선택하십시오.그런 다음 슬라이드에 실리콘 침전유를 3~4방울 떨어뜨립니다. 대물렌즈와 오일이 접촉하도록 하여 대물렌즈를 슬라이드 위에 배치합니다. 이미지를 초점 맞추고, 이미징 소프트웨어에서 노출과 화이트 밸런스를 포함한 카메라 설정을 조정합니다.다음으로 섹션의 상단에 초점을 맞춘 후, 이미지 획득 창 내의 stack 상단 옆에 있는 set을 선택하여 이미지 스택의 상한선을 설정합니다. 그런 다음 섹션의 하단에 초점을 맞추고, stack 하단 옆의 set을 선택합니다. 이미지 획득 창 내의 이미지 간 거리 옆에 1 µm를 입력하여 스텝 거리를 1 µm로 설정합니다.마지막으로 이미지 획득 창에서 'acquire image stack'을 선택하여 이미지 스택을 캡처합니다. 이전 단계들을 반복하여 관심 영역 전체를 캡처하되, 모든 이미지 스택이 X축과 Y축에서 최소 10% 이상 겹치도록 합니다. 이 대뇌 피질 이미지는 10X 대물렌즈를 사용하여 500 micron 두께의 절편에서 획득한 이미지 스택의 병합된 Z-projection 이미지입니다.이 이미지의 조직은 기본 신선 조직 프로토콜을 사용하여 처리되었습니다. 빨간색 사각형으로 표시된 영역은 30X 실리콘 오일 침수 렌즈를 사용하여 촬영되었으며, 고해상도 병합 Z-투영 이미지 스택을 획득하였습니다. 빨간색 화살표는 고해상도 30X 이미지 스택에서 추적한 뉴런의 2차원 Z-투영을 보여줍니다.여기서는 크레실 바이올렛(cresyl violet) 염색을 이용한 새로운 프로토콜 변형법이 사용되었습니다. 이 고해상도 이미지는 크레실 바이올렛으로 염색된 절편을 보여줍니다. 그리고 이것이 얻어진 뉴런 추적 결과입니다.마지막으로, Golgi-Cox 염색 후 뇌를 냉동하는 변형 프로토콜을 사용하여 이 조직을 처리하였습니다. 여기에서 이전에 냉동 처리한 조직이 더 높은 해상도로 관찰됩니다. 그리고 뉴런 추적의 고품질 2차원 Z-projection 이미지를 다시 한번 얻었습니다.이 기술은 한 달 이내에 완료할 수 있으며, 처리 및 이미징 단계는 마지막 주에 마무리됩니다. 또는 Golgi-Cox 염색 후 뇌를 냉동 보관하여 처리 및 이미징을 나중에 수행할 수도 있습니다. 이 절차를 통해 신경과학자들은 획득한 이미지를 사용하여 수지상 돌기 복잡성이나 가시 밀도와 같은 세부적인 형태학적 분석을 수행함으로써, 실험적 조작이 뇌 내 뉴런의 구조를 어떻게 변화시키는지 확인할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐 해마 절편에서 바이오사이틴으로 채워진 인터뉴런을 시각화하는 과정을 보여주며, 특정 항체 및 형광 현미경을 사용하여 신경화학적 정체성을 강조합니다.

쥐 해마 절편에서 중간뉴런의 면역염색

출처: Louth, E. L., et al. Golgi-Cox 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 절편 내의 뉴런을 이미징합니다. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 Golgi-Cox로 염색된 두꺼운 뇌 절편에서 상부 및 하부 초점 경계를 설정하고 겹치는 이미지를 캡처하여 뉴런을 이미징하는 방법을 보여줍니다. 상세한 뉴런 투영을 보장하기 위해 여러 위치를 이미지화하고, 이를 결합하여 3D 표현을 생성합니다.

Golgi-Cox 금속 염색을 사용한 마우스 뇌 절편의 뉴런 현미경 이미징

이 논문은 쥐의 새끼의 촉각 자극과 신경 세포의 형태의 후속 골지 - 콕스 염색에 대한 절차를 설명합니다. 촉각 자극은 가정용 먼지 떨이로 새끼를 쓰다듬어하여 주 산기 투여되는 긍정적 인 경험이다. 골지 - 콕스 염색은 전체 신경 세포의 시각화를 허용하는 신뢰할 수있는 절차입니다.

골지 콕스 염색과 돌기​​ 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

이 프로토콜은 biocytin 충전 및 후속 면역 후 처리를 사용하여 전기 생리 녹음하는 동안 패치 신경 세포의 형태 학적 복구를위한 방법을 제시한다. 우리는 염색 coverslipped 된 두꺼운 biocytin 채워진 부분은 나중에 두 번째 차 항체 일 개월 restained 될 수 있음을 보여줍니다.

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다.

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

여기서 우리는 Golgi-Cox 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 신뢰할 수있는 조직 얼룩 방법은 최소한의 문제 해결과 함께 해마 및 전체 뇌에 걸쳐 cytoarchitecture의 높은 품질 평가를 허용합니다.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

배우세요 두꺼운 뇌 섹션에서 골지-콕스 염색법을 사용하여 수상돌기가 긴 뉴런을 시각화하는 방법을. 이 기술은 단일 조직 샘플 내에서 뉴런 형태를 연구하고 실험적 처리 효과를 평가하는 데 활용됩니다.

골지 - 콕스 방법을 사용하여 두꺼운 뇌 섹션 내에서 이미징 뉴런

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