Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

진동 절편기(vibratome)를 이용한 준비 및 절편 제작. 절편 제작 과정 중 뇌를 고정하기 위해 3개의 아가르 블록이 필요합니다. 오염을 방지하기 위해 멸균 처리된(Autoclave) 기구 세트를 사용하십시오.

한천(agar)을 제거합니다. 금속판에 의료용 시아노아크릴레이트 접착제로 접착하기 전, 거름종이 위에서 건조시켜야 합니다. 스패튤라를 사용하여 뇌를 제거한 후, 준비 배지가 채워진 페트리 접시에 조심스럽게 놓습니다.

다음으로, 필터 페이퍼 위에서 뇌를 짧게 건조시킵니다. 금속 플레이트를 의료용 Cyanoacrylate 접착제로 덮습니다. 핀셋과 스패튤라를 사용하여 뇌를 시료 홀더 위에 배치합니다.

이전에 준비한 두 조각의 한천(agar)을 사용하여 양측에서 기계적 안정성을 확보하십시오. 이때, 절편 제작 중 조직이 손상되는 것을 방지하기 위해 뇌를 한천 블록 옆에 배치하고 추가로 두 개의 블록으로 고정해야 합니다. 금속 플레이트를 바이브라톰(vibratome)에 넣고 조직을 차가운 전처리 배지로 덮으십시오.

그 후, 슬라이딩 바이브라톰을 사용하여 조직을 350 micrometers 두께의 OHSC로 수평 절편합니다. 부러진 파스퇴르 피펫의 뒷부분을 사용하여 절편을 수집하고 페트리 접시로 옮깁니다. 뇌 절편은 냉각된 준비 배지에 보관합니다.

쌍안 현미경으로 절편을 광학적으로 평가합니다. 15번 원형 칼날이 장착된 메스로 해마 부위를 분리하고 내측 피질로 진입합니다. 등쪽 해마와 배쪽 해마 사이의 해마 중간 부분에서 분리된, 세포구조가 온전한 절편만을 취하는 것이 중요합니다.

품질이 낮은 OHSC는 즉시 폐기해야 합니다. 얻은 절편 중 2~3개를 공극 크기가 0.4 µm인 세포 배양 인서트로 옮깁니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 배양 인서트 상단의 준비 배지를 흡입하여 제거합니다.

웰당 1 mL의 배지가 들어 있는 6-웰 배양 접시에 인서트를 넣습니다. 6-웰 접시를 5% CO2가 포함된 완전 가습 분위기의 35 °C에서 배양하고 이틀마다 세포 배양 배지를 교체합니다. 랫드 조직의 경우 6일, 마우스 조직의 경우 14일 동안 배양하면 슬라이싱 절차 자체와 관련된 염증 반응이 사라집니다.

이제 실험을 수행할 수 있습니다. 신경 보호 연구의 대표적인 결과입니다. 이미지 A 부분은 아무런 처리 없이 9일 동안 시험관 내 배양액에 유지하여 대조군 슬라이스로 사용한 병변이 없는 OHSC를 보여줍니다.

공초점 레이저 주사 현미경으로 확인한 결과, 대조군 OHSC는 양호한 신경세포 보존 상태를 보였습니다. Isolectin B4 양성 미세아교세포는 주로 분자층과 망상층에 위치하며 분지형 표현형을 나타냈습니다. 치상회의 과립세포층에서는 Isolectin B4 양성 미세아교세포가 매우 적게 발견되었으며, Propidium Iodide 양성 핵은 거의 발견되지 않았습니다.

이미지 B 부분에 나타난 또 다른 OHSC 세트는 6일 동안 배양액에서 유지되었으며, 50 µM NMDA로 4시간 동안 손상을 유도했습니다. 그 후 3일 동안 다시 배양액에서 유지했습니다. NMDA 손상 후, 활성화된 Isolectin B4 양성 미세아교세포가 치상회(dentate gyrus)의 모든 층에 걸쳐 신경 손상 부위에 대량으로 축적되어 부착되었습니다.

정량 분석 결과, 치상회 과립세포층에서 Isolectin B4 양성 미세아교세포의 수가 대조군 조건에 비해 손상된 OHSC에서 더 높게 나타났습니다. 이와 유사하게, NMDA로 손상된 절편의 과립세포층에서는 Propidium Iodide 양성 퇴행성 뉴런의 수가 크게 증가했습니다. 종양 침습 연구의 샘플 결과입니다.

모든 이미지는 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 OHSC를 이용한 종양 침습 SS의 결과를 나타냅니다. 빨간색은 OHSC의 세포 구조를, 녹색은 종양 세포를 표시합니다. 이미지 A는 4일 동안 침습시킨 U138 교모세포종 세포의 전형적인 침습 패턴을 보여줍니다.

뚜렷하고 구형이며 구분이 가능한 종양들이 관찰되며, 치상회(dentate gyrus)와 암몬각(Cornu Ammonis)이 명확하게 보여 OHSC 구조가 온전한 것으로 보입니다. 이미지 B는 4일 후 LN229 교모세포종 세포에 의해 생성된 다른 침습 패턴을 보여줍니다. 이 경우, 세포 구조는 변형되지 않은 치상회와 암몬각을 유지하며 온전하게 남아 있음에도 불구하고, OHSC의 대부분을 덮고 있는 네트워크가 형성되어 개별 종양을 명확하게 구분할 수 없습니다.

또한 LN229 세포가 U138 세포보다 더 침습적이라는 결론을 내릴 수 있습니다. 이미지 C와 D는 4일간의 침습 후 LN229 세포의 동일한 종양 침습 결과를 보여줍니다. 왼쪽에서는 종양 덩어리가 거의 전체 시야를 덮고 있는 것을 관찰할 수 있습니다.

이미지 D는 이에 상응하는 Propidium Iodide 염색 결과를 보여줍니다. 이 슬라이드에서는 Cornu Ammonis가 더 이상 보이지 않고 dentate gyrus 또한 왜곡되어 있어 세포 구조가 더 이상 온전하지 않습니다. 이러한 결과의 가능한 원인으로는 실험 시작 당시 OHSC가 완전히 온전하지 않았거나, 너무 많은 수의 종양 세포를 적용했거나, 또는 침습 시간이 너무 길어 관찰된 구조적 손실이 발생했을 수 있습니다.

따라서 이러한 종류의 침범 결과는 폐기해야 합니다. 기관형 해마 슬라이스 배양은 온전한 신경 연결을 통해 뇌의 생리를 반영하는 매우 우수한 in vitro 모델입니다. 하나의 모델로서 여러 개의 슬라이스 배양물을 얻을 수 있으므로, 한 마리의 동물 조직에서 여러 조건을 테스트할 수 있으며 결과의 재현성이 매우 높습니다.

접근성이 매우 높기 때문에, 유기체형 해마 슬라이스 배양은 다양한 유형의 실험에 매우 적합합니다. 여기에는 전기생리학 및 신경발생 연구뿐만 아니라, 신경 보호, 종양 침습, 그리고 종양 세포와 건강한 뇌 조직 간의 상호작용에 관한 실험들이 포함됩니다.