Name: 단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 셀 무료 분석 실험에 활동을 자극 하는 재조합 α-β-및 γ-Synucleins (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 배우세요 단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 활성 측정 방법을 재조합 α-β-γ-synuclein을 사용하여 색도법으로 분석하는 실험입니다. 이 기법은 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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저자 켄 드 라 Mackett, 산드라 Slusher와 Jie 첸 메서드를 최적화 하기 위해 일 이전 실험실 구성원의 노력을 주셔서 감사 합니다. 저자는 또한 건강의 국가 학회, 마이클 제이 폭스 재단, 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터 엘 파소 학술 활동 연구 프로젝트 (SARP), Lizanell 및 콜버트 Coldwell 재단, 여러 시스템 위축 연합, 감사 합니다. 오늘 가족 연구, 그리고이 연구의 재정 지원에 대 한 안 나 매도 일 선물 자금.

1입니다. 버퍼 및 시 약의 준비
<ol><li>
P-nitrophenyl 인산 (pNPP) 버퍼의 준비
	<ol>
<li>PNPP 버퍼의 50 mL를 다음과 같이 준비 합니다.</li>
		<li>무게는 0.30285 g 트리 기반 ( 재료의 표참조) 초순 이온된 물 25 mL에 용 해 하 고.<ol>
<li>120mm CaCl2의 41.6 µ L를 추가 합니다. 1 M HCl로 pH 7.0 조정 하 고 최종 솔루션 볼륨 초순 이온 물 50 mL를가지고.</li>
			<li>최종 농도 50 mM Tris HCl, 100 mM CaCl2, pH 7.0 인지 확인 합니다.</li>
			<li>4 oc.에 pNPP 버퍼 저장</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
말라 카이트 그린 솔루션에 대 한 다음을 준비 합니다.
	<ol>
<li>4 M HCl 솔루션을 만드는 이온된 초순의 67.2 mL에 집중 된 HCl의 32.8 mL를 추가 하 여 솔루션 을 준비 합니다. 참고: 말라 카이트 솔루션 일회용 장갑, 얼굴 마스크, 안전 고글을 사용 하 여 증기 두건에서 준비가 되어 있습니다.</li>
		<li>암모늄 몰 리브 덴의 4.2 g으로 무게 95.8 mL 해결책 a.의에 추가 하 여 솔루션 B를 준비</li>
		<li>0.045 g 말라 카이트 그린 수 산 염 소금으로 무게 100 mL을 최종 총 볼륨을가지고 초순 이온된 수를 추가 하 여 솔루션 C를 준비 합니다.</li>
		<li>솔루션 D B와 C 같은 솔루션 들을 1:3 (v/v) 비율로 실 온에서 1 h에 대 한 저 어 혼합 하 여 준비 합니다.</li>
		<li>장치를 통해 0.22 μ m 기 공 크기 니트로 멤브레인 필터 50 mL 주사기를 사용 하 여 솔루션 D 를 필터링 합니다.</li>
		<li>4 oC 빛에서 보호에서 준비 공작 석 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
활성기의 준비
	<ol>
<li>1%를 준비 하려면 트윈 20 솔루션, 피 펫 10 µ L의 초순 990 µ L에 트윈 20의 저온 (v/v) 트윈 20까지 소용돌이 완전히 녹이 고 다음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
말라 카이트 그린 트윈 20 (MGT) 작업 솔루션의 준비.
	<ol>
<li>1: 100 (99 µ L 공작 석 녹색 솔루션을예: 1 µ L 활성 제)의 비율에서 공작 석 녹색 솔루션 (솔루션 D, 단계 1.2.5) 활성기 (1.3 단계)를 혼합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트레오닌 phosphopeptide (KRpTIRR) (pT)의 준비 기판.
	<ol>
<li>얼음에 1 mg phosphopeptide 유리병 2 m m 재고, 장소 준비, 초순 이온된 물, 그리고 부드럽게 분해 하는 소용돌이의 550 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>~ 10 aliquots를 만들고 pT-20oc.에 저장</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synuclein 준비
	<ol>
<li>일회용 장갑, 얼굴 마스크, 안전 고글을 사용 하 여 증기 두건에서 synucleins을 준비 합니다.</li>
		<li>1 초순 이온된 물 1 mg/mL의 최종 농도 대 한 재조합 synuclein의 1 밀리 그램 resuspend</li>
		<li>부드럽게 해산 하 고 얼음에 소용돌이입니다.</li>
		<li>50 µ L aliquots를 준비 하 고-80 oc.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인산 염 표준의 준비
	<ol>
<li>다음과 같이 0.1 m m 인산 재고 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>그리고 0.1361 g KH2포4 개 무게 초순 이온된 물 80 mL를 비 커에. 저 어 바와 해산 믹스를 추가 합니다. 전송 솔루션의 모든 졸업된 실린더와 최종 총 볼륨 초순 이온 물 100 mL.</li>
			<li>필터링 장치를 통해 0.22 μ m 기 공 크기 니트로 멤브레인 필터; 50 mL 주사기를 사용 하 여 전체 솔루션 최종 농도 10 m m 이다입니다.</li>
			<li>희석 솔루션 (10mm) 1: 100; 최종 농도 0.1 m m 인산 염 (PO4) 분석 결과 표준 사용할 수 있을 것입니다.</li>
			<li>4 oc.에 인산 염 재고 솔루션 저장</li>
		</ol>
</li>
		<li>포4 기준 1250 µ L의 최종 전체 볼륨을 만드는 데 사용 하는 희석을 제한 하는 표 1를 참조 하십시오. 표 1에 의하여 1.5 mL 튜브에 인산 염 이온된 초순의 적절 한 금액을 추가 합니다.<ol>
<li>스토어 준비-20 oc.에 포4 표준</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="7">인산 염 표준</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 m m 포4 솔루션 (mL)</td>
			<td>0</td>
			<td>75</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1200</td>
		</tr>
<tr>
<td>이온된 초순 (mL)</td>
			<td>1250</td>
			<td>1,175</td>
			<td>1100</td>
			<td>950</td>
			<td>650</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>PO4 [pmol]의 최종 농도</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td>
			<td>300</td>
			<td>600</td>
			<td>1200</td>
			<td>2400</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 인산 염 표준입니다.
2. PP2A 분석 결과 재조합 Synucleins에 대응
참고: 각 반응에 대 한 총 최종 볼륨 것 60 µ L, 그래서는 실험 synucleins 사용 하는 각 샘플의 볼륨에 맞게 적절 하 게 pNPP 버퍼의 초기 볼륨을 조정 해야 합니다. 대부분의 경우, pNPP 버퍼의 볼륨 40 및 44 µ L 사이 있을 것입니다.
<ol><li>
다음과 같이 각 PP2Ac 반응 준비.
	<ol>
<li>1.5 mL 튜브에 얼음에 pNPP 버퍼 및 장소 39 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1 µ L (105 ng / µ L 또는 0.0007 U / µ L) 인간의 재조합 PP2Ac의 추가 (rPP2Ac).</li>
		<li>0, 1.5, 7.5, 15 또는 30 µ M synucleins rPP2Ac pNPP 0, 0.1, 0.5의 최종 농도 대 한 버퍼에서를 4 µ L, 1.0 및 2.0 µ M를 추가 하 고 회전 단위;에 30 분 동안 4 ° C에서 품 어 마지막 볼륨 60 µ L를 될 것입니다.</li>
		<li>30 분 후 얼음 2mm pT 기판의 16 µ L을 추가 하는 샘플을 이동 합니다.</li>
		<li>간헐적으로 떨고와 물 욕조에 30 ° C에서 10 분 동안 각 PP2A 분석 결과 혼합물을 품 어.</li>
		<li>플랫 바닥 96 잘 접시에 추가 각 포4 표준 설명은 25 µ L (0, 150, 300, 600, 1200, 및 2400 pmol) 높은 낮은에서 중복 스.</li>
		<li>다음 각 실험 샘플 (PP2A 분석 결과 ± synuclein), 웰 스 같은 96 잘 접시에 중복 단계 2.1.1 2.1.6, 준비의 25 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>다음, 각 잘 표준 및 샘플을 MGT 작업 솔루션의 75 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>10 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 남겨 주세요.</li>
		<li>인산 염 수준에서 측정 가능한 차이 데 샘플에서 변경 색상을 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 광도 분석
<ol><li>표준 및 샘플 630 nm29설정 파장 spectrophotometric 플레이트 리더를 사용 하 여 포함 된 96 잘 접시를 분석 합니다.</li>
	<li>생산 흡 광도 곡선을 플롯 (샘플 읽기 630 nm) 포4의 2400 pmol 농도까지 선형 유지 및.</li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+alpha-%2C+beta-+and+gamma-synucleins+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS.</a> Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).</li>
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</ol>

박사 페레즈 1999-2011 년에서 피츠버그 대학 의과대학에서 신경과 학과 교수진의 일원이 되었다.

PT이 공작 석 녹색 분석 결과 32P 표시 기판 사용 하는 고전적인 방법 보다 수행 하기가 때문에 PP2Ac 활동을 측정 하기 위해 사용 되었다. 방사능 분석 실험을 통해이 분석 결과의 또 다른 장점은 radioisotopes 일부 위험을 제기 하 고 비쌀 수 있다, 특히 32P 이라는 분자를가지고 짧은 반감기, 분석 실험 시 약 만료 전에 수행할 수 있는 한의 수를 제한 하는. 방사능도 하지 않아도 32의 처리 보다는 공작 석 녹색을 사용 하 여 P 낭비. 공작 석 녹색 분석은 또한 매우 민감한 기판 p-nitrophenylphosphate (pNPP)로 수 비 선택은 사용 하는 다른 색도계 분석 결과에 비해 떠들고/트레오닌 인산 가수분해 효소의 활동을 측정 하는 경우 효소32의 광범위 한 수로 dephosphorylated.
상업 공작 석 녹색 키트 PP2A 활동을 측정 하기 위해 몇 시간 동안 사용할 수 그리고 이전 실험실에서 사용 되었다. 그러나, 많은 녹색 공작 석 분석 하 고, 이러한 키트 prohibitively 비싼 되었다. 또한, PP2A 활동에 대 한 상업 키트 1 년 동안만 안정적인 형태 분말 시 약에서 사용할 수 있는 하는 동안 이며 적절 한 스토리지, 오랜 시간에 대 한 구조적으로 안정는 쉽게 사용할 수 분석 결과 구성 요소를 제공.
BSyn 및 gSyn을 테스트 하기 전에 aSyn로 사용 되었다 긍정적인 컨트롤 PP2Ac 활동을 자극 하 고 PP2Ac는 분석 실험에 필요한 양을 결정 하 고 또한 결과 데이터 표준 곡선 (150-2400 pmol 포4 의 규모에 남아 확인 하 ). 그것은 aSyn PP2Ac 자극 하는 경우 너무 강하게 반응이 일반적으로 선형 하지만 데이터 오프 규모 갈 것 이다을 관리 솔루션에 화학 침전, 그건 불가능 한 접시와 함께 출시 된 무료 포4 의 정확한 금액을 측정 하 독자입니다.
기여 하는 aSyn는 PP2Ac 활동 vivo에서 그리고 생체 외에서12,19,21,,2325, 그리고 그 모든 synucleins 상당한 homology, 그것은 있었다 가설 그 모든 synuclein 가족 셀 무료 분석 실험에서 PP2Ac를 자극 수 있습니다. 여기 설명 된 색도계 분석 결과 사용 하 여, 실제로, 모든 3 개의 재조합 synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) PP2Ac 활동, 모든 3 개의 synucleins 신 경계에 비슷한 기능을 수행할 수 있습니다 가능성 제기를 자극 발견 했다. 그러나, 파 킨 슨 병에서 뇌 또는 경우 매우 포함 하는 조직에 있는 더 적은 PP2Ac 활동 Lewy 몸을 가진 치 매 집계 aSyn23. 은닉 Lewy 몸 같은 병 리 또한 전시 마우스 조직 PP2Ac 활동25감소. 이, bSyn도 gSyn 녹는 aSyn의 손실에 대 한 보상 일반적으로 수 좋습니다 그림 3에서 새로운 데이터 뿐만 아니라 aSyn 녹아웃 쥐12, 이전 데이터 및 두뇌, 또는 양자 택일로 그 synuclein homologs 하지 않을 수 있습니다 강하게 표시 (그림 3) aSyn PP2Ac와 연결. 알 렌 두뇌 지도 책 많은 뇌 분야에서는 모든 3 개의 synuclein mRNAs의 colocalization 그리고 비록 트리플 synuclein 녹아웃 쥐 생성 된9,33, PP2Ac 활동은 그 모델에 평가 하지 되었습니다. 흥미롭게도, 폴로-같은 키 2에 의해 Ser129에 phosphorylated aSyn PP2Ac12, 활성화 수 하지만 증거 bSyn에 대 한 여기에 표시 된 아주 작은 bSyn와 함께 온 그 bSyn 인 산화 PP2Ac 활동에 영향을 것입니다 제안 쥐의 뇌 (그림 3)에서 PP2Ac. 함께 찍은, 데이터 aSyn, 가능성이 같은 내 인 성 PP2Ac 활동 변조기 증진과 질병 기여할 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 다양 한 치료에 대 한 응답에서 phosphopeptide 기판 dephosphorylate PP2Ac의 용량을 결정 하는 간단 하면서도 강력한 기술입니다. 예를 들어,이 같은 방법론 ceramides로 잠재적인 새로운 치료 학34, 다른 PP2Ac 활성 테스트 또는 PP2Ac 억제제에서 체 외에서의 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 유사한 분석 1D 6 고립 되었다 PP2Ac의 활동을 측정할 수 다는 것을 지적 하는 것이 중요 셀 추출 물 또는 신체 조직, 앞에서 설명한 저자12,19, immunoprecipitation 25. ATP 활동 또한 확인할 수 있습니다 이러한 분석 결과 사용 하 여 공작 석 녹색 분석 결과 대 한 미래 응용 프로그램 PP2Ac 활동, 측정 넘어 존재.
Note 표준 곡선 모든 독립적인 PP2Ac 분석 결과 대 한 각 시간을 생성 해야 합니다. 그것은 자유로운 인산 염 인위적 배경 신호를 증가 하 고 잘못 된 결과가 사용 하는 모든 시 약을 인산 염 무료, 필수입니다. 분석 결과의 날에 모든 샘플 수 분석을 위한 충분 한 신선한 MGT 솔루션 준비 하 필수적 이다. 또한, MGT만 좋은 일입니다 하 그것은 몇 시간 후에 침전 하는 경향이 있다. 공급 업체에서 구입한 PP2Ac aliquotted 이어야 하 고 저장 된 그것은 그것의 활동을 감소 시키는 냉동 해 동 주기를 방지 하기 위해 받은 직후 냉동. 로 다른 가수분해 pT 기판 (예: PP1, PP535), dephosphorylate 수 없는 PP2Ac가 아닌 immunoprecipitation에 의해 고립 되었다 세포 또는 조직 추출, 분석할 때 샘플 무료 인산 염을 제거 하려면 열을 통해 전달 되어야 합니다 그리고 가수분해의 특정 억제제 앞에서 설명한18로 인산 가수분해 효소 특이성을 확인 하는 데 사용 해야 합니다.

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Erratum: Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

다양 한 패턴의 지역화 되어 있지만에 뇌 척수 신경 조직, 모든 3 개의 synucleins 농축은 synucleins의 배포를 정의 하는 연구 보고1. 예를 들어, aSyn은 대뇌 피 질 및 기초 중추2,3연 접 사이트에서 가장 풍부한, bSyn는 더 균일 한 분포 두뇌와 척수4,5, 이며 gSyn 척수에 더 풍부한 그리고 주변 신경6. 모든 synucleins의 배아 식 일부 발생할 수 있습니다, 비록 3 homologs는 신생아 기간4,5,6,,78동안 더 풍부한 되. 놀랍게도, synuclein 트리플 녹아웃 쥐에서 데이터 손실의 모든 3 개의 synucleins 나이 발병 신경 부전9, 중앙 신경 시스템 (CNS)10, 에서 중요 한 synuclein 기능을 지 원하는 원인 표시 11. 그것은 아직 알려져 있지 synuclein 트리플 녹아웃 쥐 PP2Ac 배포 또는 활동에 변화를 표시 하는 경우. 단일 synuclein 녹아웃 쥐에서 데이터 공개 aSyn 혼자의 손실 뇌12에 PP2Ac 활동을 크게 줄일 수 있다. CNS, 뿐만 아니라 모든 synucleins 본문13,,1415에 걸쳐 다른 조직에 지역화합니다.
그것의 기초가 튼튼한 유전 링크를 neurodegeneration16,17, 때문에 aSyn는 최고의 공부 3 synucleins의. 페레즈 실험실 특히 CNS11,12,,1819,20,21, aSyn의 정상 기능 활동을 정의 하 긴 했습니다. 22,23 주변 조직24,25에서 최근에. 이러한 가운데, 그 aSyn 발견 했다 자극 PP2Ac 활동19에서 핵심 규제 역할을 한다. PP2A 활동 도파민 생산26의 규정을 포함 하 여 정상적인 뇌 기능에 널리 기여 한다. PP2A holoenzyme 구성 3 개의 독립적인 소 단위, 촉매 C 소 단위, PP2Ac, 스 캐 폴딩 A 소 단위, 및 여러 다른 규제/타겟팅 B 소 단위 PP2A를 제공 하는 특정 subcellular microdomains에 PP2A를 지역화 하는 데 도움이 중 하나 기능의 다양성27 증거를 보여주는 PP2Ac와 aSyn의 상호 작용의 인산 가수분해 효소 활동 생체 외에서 그리고 vivo에서12,,1921,23에 크게 기여 25. 집계 aSyn 조직 PP2Ac 활동23,25감소는 aSyn 단백질 집계, Lewy Lewy 몸 (DLB)와 파 킨 슨 병 및 치 매 신경 내부 형태의 시체 때와 마찬가지로 축적 때 때 녹는 aSyn의 수준을 감소. 모든 3 개의 synucleins는 상당한 상 동28 을 (aSyn bSyn와 gSyn 56% 66% 정체성을 공유) 및 PP2Ac의 활성화에 기여 하는 그 aSyn, synuclein 단백질 가족의 모든 구성원 수는 가설 이었다 증가 PP2Ac 활동, 적어도 생체 외에서. 이 평가, PP2Ac 활동 재조합 aSyn, bSyn, 및 gSyn Fathi 외 의 방법 후 간단한 색도계 분석 결과 사용 하 여 측정 되었다 29.이 메서드와 소설 발견 여기 상세한.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T15003</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (calcium chloride)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated HCl&nbsp; &nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>9535-33</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 몰리브덴산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1343</td><td></td></tr><tr><td>공작석 녹색 옥살레이트 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6880</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Threonine phosphopeptide (KRpTIRR)</td><td>New England peptide LLC</td><td>BP12-011</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 ( 인산칼륨)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 PP2A C 서브유닛</td><td>케이맨 화학&nbsp;</td><td></td><td></td>10011237</tr><tr><td>재조합 인간 &알파;-시누클레인</td><td>r펩타이드</td><td>S-1001-2</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 &베타;-시누클레인</td><td>r펩타이드</td><td>S-1003-2</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 &감마;-시누클레인</td><td>r펩타이드</td><td>S-1007-2</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 1D6 항체</td><td>Millipore</td><td>05-421</td><td></td></tr><tr><td>PP2Ac 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-92217</td><td></td></tr><tr><td>aSyn 항체 C-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>bSyn 항체</td><td>EP1537Y Novus Biologicals</td><td>NB100-79903</td><td></td></tr><tr><td>gSyn 항체 E-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10698</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼, 7K MWCO, 0.5mL</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Equipment/Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiskan Spectrum Plate Reader</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>51118650</tr><tr><td>pH 측정기&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>13-636-AB15P</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 인산 가수분해 효소 2a 촉매 소 단위 셀 무료 분석 실험에 활동을 자극 하는 재조합 α-β-및 γ-synucleins

Recombinant &#945;- &#946;- and &#947;-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn), 및 γ-Synuclein (gSyn) 높은 척추 신경 조직에 표현 되는 보호자와 같은 단백질의 보존된 가족의 구성원입니다. 3 synucleins의만 aSyn가 파 킨 슨 병, 치 매 Lewy 몸, 그리고 여러 시스템 위축 등 신경 장애에서 강하게 연루 되었습니다. 일반 aSyn 함수를 공부 하 고, 데이터를 풍부 하 게 표현된 dephosphorylating 효소 PP2Ac 체 외 , vivo에서의 촉매 소 단위의 활동을 자극 하는 그 aSyn 나타냅니다. 사전 데이터는 인간 두뇌에 있는 aSyn 집계 Lewy 몸 병 리, 수용 성 aSyn 불용 성 되고있다 영역에서 PP2Ac 활동 감소 보여준다. 그러나, 모든 3 개의 synucleins 아미노산 시퀀스에서 상당한 homology를가지고 있기 때문에 실험 모든 PP2Ac 활동을 조절할 수 있는지 테스트 하도록 설계 되었습니다. 재조합 synucleins 및 PP2Ac 재조합 형 단백질을 사용 하 여, 활동 공작 석 녹색 색도계 분석 결과 의해 평가 되었다. 데이터는 모든 3 개의 재조합 synucleins 셀 무료 분석 실험, synucleins 사이 보존된 homology 바인딩할 하는 PP2Ac 활성화 능력을 가진 모든 3 개의 homologs를 부여 수 있습니다 가능성 제기에 PP2Ac 활동 자극 밝혔다. 그러나 Co immunoprecipitation 데이터,, PP2Ac 변조 가능성이 aSyn와 PP2Ac에서 vivo에서간의 내 생 적인 상호 작용을 통해 발생 하는 것이 좋습니다.

단백질 기능 및 활동은 인 산화와 같은 포스트 번역 상 수정 하 여 변경할 수 있습니다. 많은 단백질 키 니 아 제에 의해 phosphorylated 하거나는 인산 가수분해 효소에 의해 dephosphorylated 될 수 있습니다. 단백질 인산 가수분해 효소 2A의 경우 (PP2A)이 multisubunit 인산 가수분해 효소는 phosphoproteins의 광범위 한 번호에 떠들고, 트레오닌 잔류물의 dephosphorylation을 용이 하 게. 비정상적인 PP2A 활동 단백질 기능 타우 단백질 hyperphosphorylated를 될 수 있는 많은 질병, aSyn hyperphosphorylated, 될 수 있는 파 킨 슨 병을 포함 하 여 그리고 Alzheimer의 질병 발생의 dysregulation 발생할 수 있습니다. 이 빠르게 PP2Ac 활동을 평가 하 고 비정상적인 PP2Ac 활동 세포 역 기능으로 이어질 수 있습니다 경우 결정 하는 내부 절차를 최적화에 대 한 정당성을 제공 합니다.
PT 기판 (그림 1A)에서 죽 습이 셀 무료 색도계 분석 결과, 활동 무료 포4 의 양을 측정 하 여 측정 되었다 PP2Ac를 사용 하 고 표준 곡선 (그림 1B에서에서 포4 의 알려진된 picomolar 금액에 비해 ). PP2Ac 활동 또한 ( 그림 1A에 큰 화살표)에서 추가 synuclein의 부재에서 기준선 PP2Ac 활동에 비해 응답 0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 및 2.0 µ M synucleins (그림 1A)에서 측정 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig1.jpg"> 그림 1 : 재조합 synucleins 정품 인증 PP2A 표준에서 인산 염의 알려진된 수준 관련 측정. (A) aSyn, bSyn, 및 gSyn에서 0-2 µ M 단백질 농도, 0을 비교-범위에서 평가 했다 2400 pmol 포4 표준. 공작 석 녹색 PP2Ac 분석 결과 대 한 표준 곡선 (B) A 알려진된 양의 한 실험 조건에서 가져온 값을 계산할 수 있다 인산 염을 제공 하기 위해 생성 되었습니다. 모든 경우에 때 PP2Ac 활동 증가, 무료 포4 pT 기판에서 죽 습의 양을 증가 하 고 어두운 녹색 색상을 생산. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
결과 초기 창업 단계에서 PP2Ac에 synucleins의 추가 무료 포4 측정, 그로 인하여 증가 PP2Ac 활동을 보여주는의 양을 증가 수 보여줍니다. 모든 3 개의 재조합 synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) PP2Ac 활동 (그림 2)을 크게 증가 시킬 많은 반복 표시 후 통계 분석. 이 결과 제안 수용 성 세포 synucleins의 변경 PP2Ac 활동을 변경할 수 있습니다. 따라서 세포 항상성 영향을 수 있습니다. 그러나 그것은 알 수 없습니다,, 모든 3 개의 synucleins PP2Ac에서 vivo에서,의 활성화에 기여 하는 경우 그림 3에서 데이터 제안 PP2Ac 활동에서 에 비보에기여 하는 그 aSyn 가능성이 있지만.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig2.jpg"> 그림 2 : PP2Ac 활동은 모든 3 개의 synucleins에 의해 자극 됩니다. 재조합 aSyn, bSyn 또는 gSyn의 다양 한 농도에 대 한 응답 PP2Ac 활성화의 그래픽 표현을 표시 됩니다. 모든 3 개의 재조합 synucleins PP2Ac 활동을 자극. 대부분 실험에서 aSyn ANOVAs 통계 소프트웨어를 사용 하 여 수행 했다 비슷해 전반적으로 조금 더 강력한 것으로 나타났다. 데이터는 4-9 독립적인 실험의 평균 ±를 SEM을 나타냅니다. ns, 중요 하지; p < 0.05; p < 0.01; p < 0.0001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
평가 synuclein(s) 두뇌에서 PP2Ac와 상호 작용할 수, 공동-immunoprecipitation (공동-IP) 분석 실험은 야생 타입 마우스 두뇌와 PP2Ac-관련-항 체, 1D 6을 사용 하 여 수행 했다. 단백질은 다음 SDS 페이지를 구분 하 고도 말 PP2Ac, aSyn, bSyn, 및 gSyn 설립된 방법19를 사용 하 여 조사 했다. 재조합 synuclein 컨트롤 aSyn, bSyn 및 gSyn 항 체 특이성 (그림 3A)를 보여 줍니다. 공동 IP 데이터 공개는 두뇌에 있는 PP2Ac와 관련 된 주요 synuclein 했다 aSyn, 훨씬 bSyn (그림 3B), 공동 IP에서 내려와 아무 gSyn 공동 IP (데이터 표시 되지 않음)에 내려 왔어요. 이 내 인 성 aSyn 뇌에 PP2Ac의 규정에 대 한 독특한 역할을 제안합니다. 그것은 또한 bSyn nonamyloidogenic로 알려져 있다으로 bSyn 기반 요법 PP2Ac 변조 그 synucleinopathy에 PP2A 활동을 복원 하는 잠재력을가지고 수 가능성 제기와 같이 아직 여기 자극 PP2Ac30, 31.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2.jpg"> 그림 3: 쥐의 뇌에서 내 인 성 synucleins와 PP2Ac의 상호 작용. (A) 재조합 aSyn, bSyn 및 gSyn synuclein 특정 항 체와 함께 아래와 같이 조사 했다. (B) 사용 하 여 마우스 뇌 homogenate 공동 IP 항 1D 6 체로 수행한 다음 샘플 immunoblots에서 분석 했다. 데이터는 PP2Ac, aSyn, 및 bSyn, 하지만 PP2Ac와 공동-IP 하지 않았다 gSyn 표시 됩니다. 시작 샘플 보여 줍니다 PP2Ac의 상대 수준 (1 레인), aSyn (4 차선), 그리고 초기 homogenates에서 bSyn (레인 7). 최종 샘플 보여 줍니다 PP2Ac의 나머지 레벨 (2 레인), aSyn (5 레인), 및 homogenates 1D 6 후에 bSyn (8 레인) PP2Ac 공동-IP. PP2Ac의 중요 한 수준의 했다 1D 6을 사용 하 여 immunoprecipitated 항 체 (3 차선), 또한 아주 작은 bSyn (레인 9, 화살표에 희미 한 bSyn 신호 표시를 강력 하 게 설쳐) 하지만 aSyn (레인 6, 화살표에)의 충분 한 양을 아래로 가져. * 별표 하 고 마크는 일반적인 신호도 말에 괄호. 사용 하는 항 체에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55361/55361fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 게시 재조합 α-synuclein, β-synuclein, 또는 간단한 색도계 분석 결과 사용 하 여 γ-synuclein 단백질 재조합 단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 (PP2Ac)의 활동을 측정 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 쥐의 뇌에서 PP2Ac로 α-synuclein 특이성에 관한 연구 결과 보여줍니다.

단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 셀 무료 분석 실험에 활동을 자극 하는 재조합 α-β-및 γ-Synucleins

&#945;-Synuclein (aSyn), &#946;-Synuclein (bSyn), and &#947;-Synuclein (gSyn) are members of a conserved family of chaperone-like proteins that are highly ...

재조합 alpha, beta 및 gamma synuclein은 무세포 분석(cell free assay)에서 단백질 인산화효소 2A(protein phosphatase 2A) 촉매 서브유닛의 활성을 자극합니다. 안녕하세요, 제 이름은 Sovanarak Lek입니다. 저는 Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L.Foster School of Medicine의 의대생입니다.본 영상에서는 재조합 시뉴클레인 단백질을 이용한 단백질 인산화효소 2방향 발색 분석법을 시연하겠습니다. 완충액 및 시약 준비. p-니트로페놀 인산 완충액 준비.50 mL의 pNPP 완충액을 준비하려면, 비커에 25 mL의 초순수 탈이온수에 Trizma base를 녹입니다. 깨끗한 마그네틱 바를 넣고 자력 교반기에 올립니다. Trizma가 모두 녹으면 계속 교반하면서 calcium chloride를 첨가합니다.pH를 7.0으로 조정합니다. 용액을 메스실린더로 옮깁니다. 초순수 탈이온수를 사용하여 최종 총 부피를 50 mils로 맞춥니다.말라카이트 그린 용액 준비하기. 말라카이트 그린 용액은 A, B, C의 세 가지 용액이 필요합니다. 용액 A는 4 M 염산입니다. 용액 B는 몰리브덴산 암모늄과 용액 A의 혼합물입니다. 용액 C는 0.045% 말라카이트 그린 옥살산염입니다.용액 D를 준비하려면, B 한 부분과 C 세 부분을 1:3 비율로 혼합합니다. 실온에서 1시간 동안 교반합니다. 마지막으로, 용액 D를 22 µm 멤브레인으로 여과하여 4 °C에서 보관합니다.빛으로부터 보호하십시오. 활성제 준비 과정입니다. 활성제는 1% Tween 20 용액입니다.초순수 탈이온수 990 µL에 Tween 20 10 µL를 피펫으로 분주합니다. Tween 20이 완전히 용해될 때까지 볼텍싱합니다. 말라카이트 그린 및 Tween 20 작업 용액을 준비합니다.활성제(activator)를 용액 D에 1:100 비율로 첨가합니다. threonine phosphopeptide를 준비합니다. 2 mM pT 스톡 용액을 준비하려면, 1 mg pT에 550 µL의 초순수 탈이온수를 첨가하십시오.인산화 펩타이드가 완전히 용해될 때까지 볼텍싱합니다. 즉시 사용하기 위해 얼음에 둡니다. 남은 pT 분주액은 -20 °C에서 보관하십시오.시뉴클레인 준비. 1 mg의 시뉴클레인을 초순수 탈이온수에 재현탁하여 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 합니다. 부드럽게 볼텍싱하여 용해시킵니다.즉시 사용하고, 사용하지 않은 분주액은 -80°C에서 보관하십시오. 인산염 표준물질 준비. 인산염 표준물질 단계 1.1 mM 인산염 스톡 용액을 준비하려면, 비커에 교반자를 넣고 초순수 탈이온수에 인산칼륨을 녹입니다. 이를 메스실린더로 옮겨 최종 부피를 100 mL로 맞춥니다. 이것은 10 mM 용액입니다.대형 주사기를 사용하여 전체 용액을 22 µm 필터로 여과하십시오. 이를 1:100로 희석하여 분석 표준물질로 사용할 1 mM 인산염 용액을 만드십시오. 인산염 표준물질 2단계.표에 따라 적절한 양의 인산염과 초순수 탈이온수를 1.5 ml 튜브에 넣습니다. 이렇게 하면 150, 300, 600, 1,200, 2,400 pmol 인산염이 포함된 튜브가 만들어집니다. 분주한 시료는 -20 °C에서 보관하십시오.PP2A 활성 분석. 얼음 위에서 1.5 ml 튜브에 PP2A 분석액을 준비합니다. pNPP 완충액 43 µL를 첨가합니다.인간 재조합 PP2Ac 1 µL를 첨가합니다. synuclein을 추가하고 PP2A와 synuclein 혼합물을 4 °C의 Nutator에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 2 mM pT 16 µL를 첨가합니다.항온 수조에서 30°C로 10분 동안 배양합니다. 바닥이 평평한 96-웰 플레이트에 각 인산 표준 물질 25µL를 저농도에서 고농도 순으로 중복 분주합니다. 동일한 96-웰 플레이트의 표준 물질 옆에 각 PP2A 분석 시료 24µL를 중복 분주합니다.Tween 20이 포함된 용액 D 75 µL를 각 샘플과 표준물질에 피펫팅합니다. MGT를 첨가하면 유리 인산염이 존재할 때 웰의 색상이 변하는 것을 확인할 수 있습니다. 광도 분석.630 nanometers로 설정된 분광광도계에서 분석하십시오. 대표적인 결과입니다. 여기 PP2A 분석의 대표적인 결과와 표준 곡선을 보여주는 그래프가 있습니다.왼쪽은 인산염 표준물질입니다. 웰에 포함된 인산염의 양이 많을수록 녹색의 색조가 더 진해집니다. 오른쪽에는 서로 다른 몰 농도의 alpha, beta 또는 gamma synuclein과 함께 배양한 PP2A가 있습니다.농도가 높을수록 PP2A 촉매 서브유닛 활성을 자극하는 데 더 효과적이었습니다. 여기서는 alpha synuclein, beta synuclein 및 gamma synuclein의 다양한 농도 변화에 따른 PP2A 활성의 그래프 표현을 확인할 수 있습니다. 1~2 µM 농도에서 alpha synuclein, beta synuclein 및 gamma synuclein 모두 PP2A 활성을 유의미하게 자극했습니다.0.5 µM 농도에서 alpha synuclein과 beta synuclein만이 PP2A 활성을 유의미하게 자극했습니다. 그림 3은 마우스 뇌 내의 내인성 synuclein과 PP2Ac의 상호작용을 보여줍니다. A에서는 재조합 alpha, beta 및 gamma synuclein이 양성 대조군으로 제시되었습니다.B에서, PP2Ac 특이적 항체 1D6를 사용하여 공동 면역침강을 수행한 결과, PP2Ac와 함께 상당량의 상호작용하는 alpha synuclein이 침강되었으나 beta synuclein은 거의 침강되지 않았습니다. 공동 면역침강에서 PP2Ac와 함께 침강된 gamma synuclein은 없었습니다. 이러한 공동 면역침강 데이터는 alpha synuclein이 in vivo에서 PP2Ac의 내인성 조절자임을 시사합니다.이 영상을 제작하는 데 도움을 주신 모든 분께 감사드립니다. 마지막으로, Ruth Perez와 Sonavarak Lek였습니다.Javier Vargas. 당신의 큰 성공을 기원합니다. 안녕히 계십시오, 행운을 빕니다.

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류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αSD)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

여기에서는 사후 인간 뇌 조직에서 점점 더 불용성/응집된 알파-시누클레인(α-syn)을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세제 강도가 증가하는 완충액과 고속 초원심분리 기술을 통해 병든 조직과 그렇지 않은 조직에서 α-syn 응집의 다양한 특성을 검사할 수 있습니다.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

이 프로토콜은 설치류 뇌의 다른 세포 구획에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS) 활성을 효율적으로 정량화하도록 설계되었습니다. 사용자는 동일한 동물의 핵, 세포질 및 시냅스 분획에서 작동하는 UPS를 검사하여 이러한 복잡한 분석을 수행하는 데 필요한 동물의 수와 시간을 줄일 수 있습니다.

설치류 뇌의 세포외 유비퀴틴-프로테아솜 활동 정량화

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

Leishmania Translational Extract(LTE)는 단세포 기생충인 Leishmania tarentolae에서 유래한 진핵 세포 없는 단백질 발현 시스템입니다. 이 최적화된 프로토콜은 LTE를 간단하고 비용 효율적으로 제조할 수 있도록 합니다. 복잡한 진핵생물 단백질의 다병렬 발현 및 연구와 그 상호 작용에 초점을 맞춘 다양한 응용 분야에 적합합니다.

재조합 단백질 생산을 위한 Leishmania tarentolae 유래 Cell-Free 단백질 발현 시스템인 LTE의 생산 및 최적화

여기에서는 인간 γ-세크레타아제를 재구성하는 효모 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 식별 및 연구하고 γ-secretase 억제제(GSI)를 스크리닝할 수 있습니다. 가족성 알츠하이머병 돌연변이의 기능 상실 특성을 활용하여 γ-secretase 조절제(GSM)를 스크리닝할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae γ-Secretase에 의한 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미치는 유전자, 돌연변이 및 화학 물질을 스크리닝하는 알츠하이머병 모델

배우세요 단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 활성 측정 방법을 재조합 α-β-γ-synuclein을 사용하여 색도법으로 분석하는 실험입니다. 이 기법은 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 셀 무료 분석 실험에 활동을 자극 하는 재조합 α-β-및 γ-Synucleins

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