단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 셀 무료 분석 실험에 활동을 자극 하는 재조합 α-β-및 γ-Synucleins
2017년 8월 13일
이 게시 재조합 α-synuclein, β-synuclein, 또는 간단한 색도계 분석 결과 사용 하 여 γ-synuclein 단백질 재조합 단백질 인산 가수분해 효소 2A 촉매 소 단위 (PP2Ac)의 활동을 측정 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 쥐의 뇌에서 PP2Ac로 α-synuclein 특이성에 관한 연구 결과 보여줍니다.
재조합 alpha, beta 및 gamma synuclein은 무세포 분석(cell free assay)에서 단백질 인산화효소 2A(protein phosphatase 2A) 촉매 서브유닛의 활성을 자극합니다. 안녕하세요, 제 이름은 Sovanarak Lek입니다. 저는 Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L.Foster School of Medicine의 의대생입니다.
본 영상에서는 재조합 시뉴클레인 단백질을 이용한 단백질 인산화효소 2방향 발색 분석법을 시연하겠습니다. 완충액 및 시약 준비. p-니트로페놀 인산 완충액 준비.
50 mL의 pNPP 완충액을 준비하려면, 비커에 25 mL의 초순수 탈이온수에 Trizma base를 녹입니다. 깨끗한 마그네틱 바를 넣고 자력 교반기에 올립니다. Trizma가 모두 녹으면 계속 교반하면서 calcium chloride를 첨가합니다.
pH를 7.0으로 조정합니다. 용액을 메스실린더로 옮깁니다. 초순수 탈이온수를 사용하여 최종 총 부피를 50 mils로 맞춥니다.
말라카이트 그린 용액 준비하기. 말라카이트 그린 용액은 A, B, C의 세 가지 용액이 필요합니다. 용액 A는 4 M 염산입니다. 용액 B는 몰리브덴산 암모늄과 용액 A의 혼합물입니다. 용액 C는 0.045% 말라카이트 그린 옥살산염입니다.
용액 D를 준비하려면, B 한 부분과 C 세 부분을 1:3 비율로 혼합합니다. 실온에서 1시간 동안 교반합니다. 마지막으로, 용액 D를 22 µm 멤브레인으로 여과하여 4 °C에서 보관합니다.
빛으로부터 보호하십시오. 활성제 준비 과정입니다. 활성제는 1% Tween 20 용액입니다.
초순수 탈이온수 990 µL에 Tween 20 10 µL를 피펫으로 분주합니다. Tween 20이 완전히 용해될 때까지 볼텍싱합니다. 말라카이트 그린 및 Tween 20 작업 용액을 준비합니다.
활성제(activator)를 용액 D에 1:100 비율로 첨가합니다. threonine phosphopeptide를 준비합니다. 2 mM pT 스톡 용액을 준비하려면, 1 mg pT에 550 µL의 초순수 탈이온수를 첨가하십시오.
인산화 펩타이드가 완전히 용해될 때까지 볼텍싱합니다. 즉시 사용하기 위해 얼음에 둡니다. 남은 pT 분주액은 -20 °C에서 보관하십시오.
시뉴클레인 준비. 1 mg의 시뉴클레인을 초순수 탈이온수에 재현탁하여 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 합니다. 부드럽게 볼텍싱하여 용해시킵니다.
즉시 사용하고, 사용하지 않은 분주액은 -80°C에서 보관하십시오. 인산염 표준물질 준비. 인산염 표준물질 단계 1.
1 mM 인산염 스톡 용액을 준비하려면, 비커에 교반자를 넣고 초순수 탈이온수에 인산칼륨을 녹입니다. 이를 메스실린더로 옮겨 최종 부피를 100 mL로 맞춥니다. 이것은 10 mM 용액입니다.
대형 주사기를 사용하여 전체 용액을 22 µm 필터로 여과하십시오. 이를 1:100로 희석하여 분석 표준물질로 사용할 1 mM 인산염 용액을 만드십시오. 인산염 표준물질 2단계.
표에 따라 적절한 양의 인산염과 초순수 탈이온수를 1.5 ml 튜브에 넣습니다. 이렇게 하면 150, 300, 600, 1,200, 2,400 pmol 인산염이 포함된 튜브가 만들어집니다. 분주한 시료는 -20 °C에서 보관하십시오.
PP2A 활성 분석. 얼음 위에서 1.5 ml 튜브에 PP2A 분석액을 준비합니다. pNPP 완충액 43 µL를 첨가합니다.
인간 재조합 PP2Ac 1 µL를 첨가합니다. synuclein을 추가하고 PP2A와 synuclein 혼합물을 4 °C의 Nutator에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 2 mM pT 16 µL를 첨가합니다.
항온 수조에서 30°C로 10분 동안 배양합니다. 바닥이 평평한 96-웰 플레이트에 각 인산 표준 물질 25µL를 저농도에서 고농도 순으로 중복 분주합니다. 동일한 96-웰 플레이트의 표준 물질 옆에 각 PP2A 분석 시료 24µL를 중복 분주합니다.
Tween 20이 포함된 용액 D 75 µL를 각 샘플과 표준물질에 피펫팅합니다. MGT를 첨가하면 유리 인산염이 존재할 때 웰의 색상이 변하는 것을 확인할 수 있습니다. 광도 분석.
630 nanometers로 설정된 분광광도계에서 분석하십시오. 대표적인 결과입니다. 여기 PP2A 분석의 대표적인 결과와 표준 곡선을 보여주는 그래프가 있습니다.
왼쪽은 인산염 표준물질입니다. 웰에 포함된 인산염의 양이 많을수록 녹색의 색조가 더 진해집니다. 오른쪽에는 서로 다른 몰 농도의 alpha, beta 또는 gamma synuclein과 함께 배양한 PP2A가 있습니다.
농도가 높을수록 PP2A 촉매 서브유닛 활성을 자극하는 데 더 효과적이었습니다. 여기서는 alpha synuclein, beta synuclein 및 gamma synuclein의 다양한 농도 변화에 따른 PP2A 활성의 그래프 표현을 확인할 수 있습니다. 1~2 µM 농도에서 alpha synuclein, beta synuclein 및 gamma synuclein 모두 PP2A 활성을 유의미하게 자극했습니다.
0.5 µM 농도에서 alpha synuclein과 beta synuclein만이 PP2A 활성을 유의미하게 자극했습니다. 그림 3은 마우스 뇌 내의 내인성 synuclein과 PP2Ac의 상호작용을 보여줍니다. A에서는 재조합 alpha, beta 및 gamma synuclein이 양성 대조군으로 제시되었습니다.
B에서, PP2Ac 특이적 항체 1D6를 사용하여 공동 면역침강을 수행한 결과, PP2Ac와 함께 상당량의 상호작용하는 alpha synuclein이 침강되었으나 beta synuclein은 거의 침강되지 않았습니다. 공동 면역침강에서 PP2Ac와 함께 침강된 gamma synuclein은 없었습니다. 이러한 공동 면역침강 데이터는 alpha synuclein이 in vivo에서 PP2Ac의 내인성 조절자임을 시사합니다.
이 영상을 제작하는 데 도움을 주신 모든 분께 감사드립니다. 마지막으로, Ruth Perez와 Sonavarak Lek였습니다.
Javier Vargas. 당신의 큰 성공을 기원합니다. 안녕히 계십시오, 행운을 빕니다.
개요
본 논문은 발색 분석법을 이용하여 재조합 α-synuclein, β-synuclein 또는 γ-synuclein 단백질에 반응하는 재조합 protein phosphatase 2A catalytic subunit (PP2Ac)의 활성을 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 연구 결과, 마우스 뇌에서 PP2Ac에 대한 α-synuclein의 특이성이 확인되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 세포생물학
배경
- 단백질 인산화효소 2A (PP2A)는 다양한 세포 과정에 관여하는 핵심 효소입니다.
- 시뉴클레인은 신경퇴행성 질환과 연관된 단백질 가족입니다.
- 시뉴클레인과 PP2A 사이의 상호작용을 이해하면 신경세포 기능에서의 역할에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.
- 비색 분석법은 인 비트로(in vitro)에서 효소 활성을 측정하는 데 효과적입니다.
연구 목적
- synuclein 존재 하에서 PP2Ac 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 개발합니다.
- PP2Ac에 대한 α-synuclein의 특이성을 평가합니다.
- 해당 분야의 연구자들에게 상세한 방법론을 제공합니다.
사용된 방법
- 비색 분석을 위한 완충액 및 시약 준비.
- 다양한 농도의 synuclein과 PP2Ac의 반응.
- 분광광도계를 이용한 효소 활성 측정.
- 마우스 뇌 샘플 내 상호작용 평가를 위한 공동 면역침전.
주요 결과
- 세 가지 시뉴클레인(α, β, γ) 모두 특정 농도에서 PP2Ac 활성을 촉진했습니다.
- α-synuclein이 PP2Ac에 대해 가장 높은 특이성과 상호작용을 보였습니다.
- 공침강법(Co-immunoprecipitation) 결과, α-synuclein이 PP2Ac의 주요 내인성 조절인자로 나타났습니다.
- 비색 변화는 분석 내의 인산염 수준과 상관관계가 있었습니다.
결론
- 개발된 프로토콜은 PP2Ac 활성을 연구하는 데 효과적입니다.
- α-synuclein은 in vivo에서 PP2Ac의 중요한 조절 인자입니다.
- 본 연구는 신경생물학 내 synuclein 상호작용에 대한 이해를 높여줍니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 연구는 synuclein에 의한 PP2Ac 활성 조절을 평가하기 위한 무세포 분석법(cell-free assay)을 확립하여, 신경퇴행성 질환 연구의 표적 검증을 위한 기전적 도구를 제공합니다. 세 가지 synuclein 동형 단백질(isoform) 모두가 in vitro에서 PP2Ac를 자극할 수 있음을 입증함으로써, 본 방법은 보존된 기능적 상동성과 그것이 경로 위험 감소(pathway de-risking)에 미치는 영향에 관한 가설 검증을 지원합니다. 공동 면역침전(co-immunoprecipitation) 데이터는 표적 특이성을 더욱 정밀하게 정의하며, α-synuclein이 in vivo에서의 내인성 조절자임을 강조함으로써 치료 가설의 우선순위 설정과 초기 발견 단계의 기전적 모호성 해소에 도움을 줍니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 신경퇴행성 질환에서 시누클레인-PP2Ac 상호작용에 관한 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 과학적 가치: 관찰된 효과가 직접적인 효소 조절에서 기인하는지 아니면 간접적인 경로에서 기인하는지를 명확히 함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 과학적 가치: 통제되고 재현 가능한 시스템에서 아이소폼 특이적 활성을 비교함으로써 타겟 신뢰도 평가를 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 화합물이 PP2Ac 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해 표준화된 정량적 판독 값(malachite green 분석을 통한 인산염 방출)을 제공합니다.
- 운영적 가치: 재조합 단백질과 정의된 완충액을 사용하여 실험실 간 및 스크리닝 캠페인 전반에서 분석의 재현성을 보장합니다.
- 운영적 가치: 후속 화합물 평가 및 히트 확인을 위해 검증된 생물학적 도구(예: 용량-반응 곡선)의 준비를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: in vitro 연구 결과를 마우스 뇌에서 관찰된 내인성 상호작용과 연결함으로써, 발견 단계부터 전임상 검증까지의 중개적 연속성을 뒷받침합니다.
- 과학적 가치: 비특이적인 in vitro 활성과 선택적인 in vivo 조절을 구분함으로써 타겟 결합 전략의 리스크를 줄이는 데 도움을 줍니다.
- 운영적 가치: 생리학적 환경에서 어떤 시누클레인 동형 단백질(isoform)이 PP2Ac와 결합할 가능성이 높은지 제시하여 전임상 모델 선택의 근거를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 분석법은 초기 발굴 단계의 연속 과정에 적합하며, 화합물 최적화에 상당한 투자가 이루어지기 전 go/no-go 결정을 내리는 데 필요한 정량적이고 메커니즘 기반의 리드아웃을 제공함으로써 표적 검증 및 리드 물질 발굴을 지원합니다.
- 발견 생물학: synuclein isoform에 의한 PP2Ac 활성화를 용량 의존적으로 측정함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 시약 준비와 플레이트 기반 형식과 호환되는 비색 출력을 통해 분석 준비 상태를 제공합니다.
- 분석: 실험 조건 전반에 걸쳐 조절제의 효력 및 효능을 비교할 수 있는 정량적 인산염 측정값을 생성합니다.
- 중개 연구: 관찰된 in vitro 효과가 뇌 조직의 내인성 상호작용과 일치함을 검증함으로써 전임상 연구와 연결합니다.
- 기업 내 재사용: synuclein 외에도 다른 조절 단백질이나 저분자 화합물에 적용 가능한, PP2Ac에 대한 조절제 효과를 평가하기 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 직접적이고 정량적인 효소 활성 데이터를 제공함으로써 표적 조절 주장에 대한 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 상세한 시약 준비 및 정의된 배양 조건을 통해 표준화와 재현성을 증진합니다.
- 전략적 가치: 간접적이거나 상관관계가 있는 바이오마커에 대한 의존도를 낮추어 go/no-go 결정 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 경로 관여의 기전적 근거를 바탕으로 표적의 위험 조정 우선순위 설정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 재조합 단백질 취급 및 인산화 검출을 포함하여 단백질 생화학과 효소 분석법에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 630 nm 흡광도 측정이 가능한 분광 광도계 및 온도 제어 배양 시스템의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 분석의 일관성을 보장하기 위해 시약 조제(예: malachite green 용액, pNPP 완충액)의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 분석 범위를 비신경세포 모델 시스템이나 다른 PP2Ac 공급원으로 확장할 때 적응 고려 사항이 수반됩니다.
- 신선한 인산화 펩타이드 기질의 필요성과 배양 단계 중의 엄격한 온도 제어와 같은 실질적인 제한 사항이 포함됩니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Title
0:33
Preparation of Buffers and Reagents
0:38
Preparing p-Nitrophenol Phosphate (pNPP) Buffer
1:21
Preparing Malachite Green Solution
2:21
Preparation of Activator
2:42
Preparing Malachite Green + Tween 20 (MGT) Working Solution
2:58
Preparing Threonine Phosphopeptide (pT)
3:31
Synuclein Preparation
3:59
Preparing Phosphate Standards
4:45
Phosphate Standards Step 2
5:17
PP2A Activity Assay
6:42
Photometric Analysis
6:53
Representative Results
9:01
Conclusion
