Name: 향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 학습하세요 CD11b 자기 분리법을 이용하여 생후 1-2일 생쥐 뇌에서 미세아교세포를 고순도·고수율로 신속하게 분리하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 연구 및 염증 신호 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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NS088206 및 ES026892 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 보조금에 의해 지원되었다. 더블유 유진과 린다 로이드 기증 의자 AGK하고 AK에 학장 교수도 인정된다.

동물 및 프로토콜 절차의 사용 승인과 기관 동물 케어 및 사용 아이오와 주립 대학위원회 (IACUC) (에임스, IA, USA)에 의해 감독되었다 1. 혼합 배양 성장 폐해 <ol><li> 5.5 인치 운영 가위 1 이일 된 새끼 빨리 목을 베다, 얼음에 50 ML의 튜브에 즉시 머리를 놓습니다. 이 잘린 안락사의 모드입니다 있습니다. </li><li> 층류 기류 후드, 두개골 및 4.5 인치의 직선 해부 마이크로 가위를 사용하여 수막에 작은 절개 부위를 만든다. 입쪽 끝 (코)로 꼬리 단부에서 절단 시작한다. 잘린 형성된 개구부를 사용하여 피부 아래에 가져옵니다. <ol><li> 절개 한 후 옆으로 반구 중 하나를 껍질. 그리고 뇌 전체를 제거하는 곡선 또는 후크 핀셋을 사용합니다. </li></ol></li><li> 0.25 % 트립신 - ethylenediaminetetraacet를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브에서 뇌 (들)을 담가37 ° C의 물 중탕에서 15 분 동안 아세트산 (EDTA)를 먹었다. 뇌 당 트립신 EDTA의 2 용액을 사용합니다. </li><li> 추가하고 제거하여 신선한 성장 배지 (10 % FBS, DMEM / F12, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L- 글루타민, 1 % 소듐 피루 베이트 및 1 % 비 필수 아미노산)가 뇌 (들)을 씻어 미디어. 이 배를 반복합니다. </li><li> 각 뇌의 경우, 성장 배지를 함유하는 개의 T-75 플라스크 접시. 따라서, 튜브에 뇌 당 성장 미디어의 2 mL를 넣어. 따라서, T-75 플라스크의 성장 배지 당 8-9 ㎖의 균질화 뇌 1 ㎖의 등가 일 것이다. </li><li> 가장 작은 행하기 위해, 개구 크기가 상이한 피펫으로 뇌 (들)에 의해 분쇄하여 균질. 뇌 조직은 다음 피펫 전환을 작아지고 있지 않은지를 볼 수있는 경우. 분쇄의 끝에서, 서스펜션은 눈에 보이는 덩어리, 명확해야한다. <ol><li> 25 mL의 피펫, 5 ㎖ 피펫 한 다음 10 ㎖ 피펫을 순차적으로 사용한다. </li></ol></li><li> 각 homog 전달70 μm의 세포 여과기를 통해 enous 뇌 현탁액을 단일 세포 배양 물로 만들려면. </li><li> (T-75 플라스크의 성장 배지 당 8-9 mL로 균질화 뇌 1 ㎖) 단계 1.5에 기재된 바와 같이 각각의 뇌 균질 플레이트 개의 T-75 플라스크의 성장 배지를 함유. </li><li> 6 D 후 성장 미디어를 변경하고 16 일 날에 분리 될 때까지 성장한다. </li></ol> 미세 아교 세포의 2. 분리 <ol><li> 십육일 후, 플라스크에서 성장 미디어를 제거하고 신선한 50ml의 튜브에 넣습니다. 각각의 T-75 플라스크에 3 ㎖의 0.25 % 트립신 EDTA를 추가한다. 오비탈 진탕 기에서 실온에서 5 분 동안 진탕 플라스크. <ol><li> 원심 분리 한 성장을 5 분 동안 0.4 XG에 용지 및 후속 단계에서 트립신 EDTA 반응을 정지 사용. </li></ol></li><li> 5 분 동안 진탕 한 후, 트립신 EDTA 반응을 정지 성장 (신선 또는 2.1.1에서 사용되는 매체) 미디어 4mL의 최소 추가. </li><li> 보장하기 위해 씹다 그 모든 CELL 학생이 분리되어있다. </li><li> 분쇄 후, 단일 세포로 배양을 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달 셀 카운트를 수행 한 다음 5 분 동안 0.4 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 각 100 × 106 세포 (약 15 X T-75 플라스크)를 위해, 세포 펠렛을 재현 탁하는 추천 미디어 (2 % FBS, DPBS (칼슘 및 마그네슘 클로라이드 무), 1 mM의 EDTA) 1 ㎖를 사용한다. 참고 : 모든 다음 단계는 1 ML의 분리에 맞게 조정됩니다. </li><li> , 5 ML의 폴리스티렌 튜브를 타고 권장 미디어의 1 mL를 넣어 반월 상 연골을 표시합니다. 2.5 mL의 최대 권장 미디어를 추가하고도이를 표시합니다. 권장 미디어를 폐기하고 5 ㎖ 폴리스틸렌 튜브에 재 현탁 세포를 옮긴다. </li><li> 부유 세포의 매 1 mL를 위해 쥐의 혈청 50 μL를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 성분 (A)의 25 μL와 성분 (B)의 25 μL 이들 컴포넌트 독점을 혼합하여 선택 칵테일을 준비한다. </li><li> 50 추가(1) 상기 셀 선택 칵테일 L. RT에서 5 분 동안 인큐베이션. 참고 : 순수한 문화를 들어, 단계를 반복 2.9 (권장하지만 필수는 아닙니다). </li><li> 45 초 동안 소용돌이 미소. 시료 1 ㎖ 당 미립자의 80 μL를 추가한다. RT에서 3 분 동안 인큐베이션. </li><li> 권장 미디어를 추가하여 폴리스티렌 튜브에 2.5 ㎖의 부피를 준비한다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 자석에 튜브를 넣고. 순도를 높이기 위해 배양을 조정합니다. 천천히 폴리스티렌 튜브에 여전히 자석을 15 mL의 튜브에 권장 미디어를 붓는다. </li><li> 단계를 반복 2.12 세 번 이상. 추가 인큐베이션은 자기 순도를 증가시키기 위해 수행 될 수있다. </li><li> 성장 배지 3 mL를 첨가하고, 세포 계수기를 사용하여 세포의 수를 계산. </li><li> 따라서, 폴리 D 라이신 (PDL) 치료를위한 코팅 된 플레이트에서 세포를 플레이트. inPDL - 코팅 된 플레이트를 세포 파종 후 48 시간 동안 처리한다. 이것은 세포 분리의 스트레스로부터 복구 할 수 있습니다. 참고 : 체앞서 설명한 바와 같이 면역 세포 (15)를 사용하여 배양 물의 순도 CK. </li><li> 대부분 성장 배지의 T-75 플라스크에서 아스트로 사이트를 포함 (15 ㎖의 튜브에 수집 된) 부의 일부를 접시. </li><li> 37 ° C의 배양기에서 배양 중 적어도 6 시간 후, 배지를 변경하고 / N을 O 성장하자. 치료를 위해 다음날 성상 세포를 분할합니다. </li></ol>

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<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

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미세 아교 세포는 C-KIT + / CD45- 차별화 중배엽 기원 MYB 독립적 상주 식세포, 난황 1, 2의 혈액 섬 전구 세포를 erythromyeloid이다. 배아 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)을 식민되면, 그들은 분지 형태 3에 아메바에서 전환. 그들의 역동적 인 파급 효과가 잠재적 인 모욕 4 건강한 뇌 실질을 조사하고 있기 때문 성인 미세 아교 세포는 감시자로 분류됩니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계의 세포 인구의 약 10 %에 기여하지만, 서로의 사이에 타일에 대한 그들의 능력은 실질 4, 5의 최대 스캐닝을 보장합니다. 이러한 α-synuclein의 6, 7, 아밀로이드 β-8, P 등의 위험 - 관련 분자 패턴 (DAMPS)예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (9)와 같은 athogen - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)는 고전 아메바 액티브 상태로 복귀하고 산화 질소의 생산, 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터루킨 1β 특징으로하는 염증 반응을 촉진하는 미세 아교 세포를 활성화 (IL-1β), IL-6, IL-12, 및 CC 케모카인 리간드 모티프 2 내지 9, 10, 11. 병원성 α-synuclein의 축적 가지고있는 파킨슨 병과 같은 신경 염증성 조건에서, 신경 퇴행성주기는 더 미세 아교 세포 (7)의 고전적인 활성화를 추진,보다 통합 된 α-synuclein의 출시 도파민 신경 세포의 죽음에서 생성됩니다. 주변 대 식세포와 마찬가지로, 미세 아교 세포는 대안 항 염증성 사이토 카인 IL-4 및 IL-10의 존재 하에서 활성화하는 능력을 갖고 그들에게 효능을 제공 할 수있다염증이 11 신경 수리를 장려하고 감쇠 IAL. 이외에도 CNS에서의 면역 학적 역할에서, 미세 아교 세포는 개발 과정에서 시냅스 가지 치기를하여 신경 회로의 중요 규제로 기술되었다. 예를 들어, Cx3cr1- KO 마우스는 저밀도 및 미세 아교 세포 돌기 쪽 미성숙 시냅스 및 미개발 CNS (12)의 전기 생리 패턴 넘쳐나 리드 감소 시냅스 치기를 갖는다. 중추 신경계의 항상성에 이러한 생리 학적 복잡성과 미세 아교 세포의 다양한 기능적 역할을 이해하는 것은 신경 퇴행성 질환을 대상으로 치료제에 대한 검색에 매우 중요합니다. neuroimmunology의 영역에서 생체 외 실험 때문에 역학적 연구에 대한 더 큰 가능성의 매우 바람직하며, 낮은 유지 보수 비용과 시간이 적게 걸리고 힘이 덜 드는 것에 대해. Furthermo다시, 세포 집단을 분리하는 능력은 소정의 조건에 따라 그 표적 세포의 기능을 묘사하는 것이 중요하다. 수많은 소교 분리 방법이 존재하지만, 그들은 광범위한 실험 13, 14, 15에 대해 상대적으로 높은 번호 및 순도를 얻을 수있는 능력에 의해 제한된다. 예를 들어, 분화 (11b)의 클러스터 (는 CD11b)는 단핵구, 대 식세포와 미세 아교 세포 (16)의 공통 표면 마커이다. CD11b를 악용하여 자기 분리하는 방법은 제 17 뇌 신생아 당 열 기반 접근법 수득 ~ 99.5 % 순도 및 ~ 1.6 × 106 미세 아교 세포로서 설명 하였다. 본 연구실은 최근 우리가 피코 에리 트린 접합하는 모노클로 날 항체 (PE)와 CD11b를 태깅하여 폴리스티렌 튜브에서 수행되는 열없는 CD11b를 자성 분리 방법 (15)을 개발 하였다. 특이 적 secondaRY 항체 PE 및 PE와 덱스 트란 착물한다. 일단 결합 된 덱스 트란 - 코팅 된 자성 입자는 항체 복합체의 덱스 트란 단부에 결합되는 도입된다. 마지막으로, 폴리스티렌 튜브는 미세 아교 분리를위한 자석에 배치됩니다. 이 방법은에 수율을 두 배로 ~ 신생아 뇌 당 만 ~ 97 %로 순도 감소의 비용으로 3.2 × 10 (6) 미세 아교 세포. 여기서, 우리는 신속하고 세련된 열이없는 CD11b를 자기 분리 프로토콜 (그림 1)를 보여줍니다. CD11b를 자기 분리 키트의 가격이 동일하기 때문에 이러한 개선 된 방법은 오리지널 열없는 방법처럼 가능한 남아있다. 완료 시간은 세포 생존 및 수율을 최대화 결정적 일 수 절반으로 감소된다. 특히,이 최적화 된 방법에서 얻어지는 ~ 순도&gt; 99 %, 15 실험실에서 개발 원래 열없는 방법에서 얻어지는 순도 이상 현저한 개선이다. 가장 중요한 것은, CD11b를-PE빛으로부터 배양의 필요성을 제거하고 형광 현미경에 대한 빨강 채널의 사용을 허용, 사용되지 않습니다. 마지막으로, 원래는 CD11b 방법에서와 같이, 높은 수율 및 순도의 성상 세포 분획이 개선 된 방법으로 얻어진다. 성상은 항상성 기능 병태 생리 (18)과 관련하여 필수 불가결하다는 생각을지도하는 CNS에서 가장 많은 신경 교세포이다. 이 아교 세포는 아교 자신의 조사의 가능성을 예시, 영양 지원을 제공, 혈액 - 뇌 장벽을 형성하는 신경 전달 물질의 항상성을 유지, 손상, 신경에 대한 응답으로 아교 흉터를 형성, 학습 및 메모리 및 신경 염증 등 다양한 생리 기능에 중요한 역할을 생물학 (19). 형태와 미세 아교 세포와 성상 세포의 기능은 공 초점 현미경, 웨스턴 블롯, 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR), G를 통해 확인되었다RIESS 아질산 분석하고, 루미 넥스 다중 사이토 카인 분석. 이 프로토콜에 의해 제공되는 정제는 시험관 실험에 중요한 모두, 미세 아교 또는 성상 세포의 순도, 빨강 채널의 가용성과 형광 현미경의 폭 넓은 응용에 관한 신뢰를 증가하고, 시간을 절약 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>EasySep CD11b 분리 키트 II</td><td>StemCell Technologies</td><td>18970</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 자석</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>시그마</td><td>13H469</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (DPBS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr></tbody></table>

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 cd11b를 자기 절연

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

미세 아교 세포는 중추 신경계에 욕설 차 응답자이다; 그러나, 많은 신경 염증을 조절하는 역할에 대한 알 수없는 남아있다. 미세 아교 세포는 염증 스트레스를 측량에서 대 식세포 유사한 기능을 중배엽 세포이다. 고전 (M1 형) 및 대체 (M2 형) 대 식세포의 활성화는 더 나은 이러한 표현형은 파킨슨 병, 알츠하이머, 헌팅턴의 질병과 같은 신경 염증성 조건이 기본 상호 작용을 이해하기위한 노력의 일환으로 미세 아교 세포로 확장되었습니다. 시험관 실험에서 생체 환경에 확장 될 수있다 신속하고 신뢰할 수있는 결과는 차 미세 아교 세포를 제공 활용. 이것은 도전했다 최적 순도 적당한 수율을 달성하면서 미세 아교 세포를 단리 생체 실험을 통해 명백한 장점 않는다. 현재 사용중인 일반적인 방법 중 하나는 낮은 복구, 낮은 순도, 또는 두 가지 모두에서 고통 받고 있습니다. 여기서, 우리는 민주시간의 절반의 양으로 높은 세포 복구 및 순도 향상을 달성 열없는 CD11b를 자기 분리 방법의 구체화를 onstrate. 우리는 신경 염증과 신경 퇴행을 연구의 목적으로 차 미세 아교 분리의 매우 유용한 모델로이 최적화 방법을 제안한다.

미세 아교 II는 높은 순도는 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여 격리 기본 마우스 미세 아교 세포는 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여 절연 및 절연의 순도를 확인하는 폴리 D 라이신 코팅 커버 슬립에 도금했다. 만 개 세포를 단리 미세 아교 세포의 순도를 확인하기 위해 미세 아교 세포 및 성상 세포의 마커로서 글 리아 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)의 마커로서 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1)를 사용하여 수행 하였다 웰 면역 분석 당 도말 . 단리 배양은 배양 된 미세 아교 세포는 순수했다 절연 것을 시사 GFAP 발현 (도 2A)없는 표현 Iba1. 이 방법을 이용하여 ~ 97 %의 순도를 달성 차 소교 분리 이전에 발행 된 다른 방법과 달리 우리는 시간을 반 ~&gt; 99 % 순도를 획득...

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

CD11b 자기 미세아교세포 분리의 전반적인 목표는 다양한 인 비트로(in vitro) 실험을 위해 비교적 짧은 시간 내에 높은 순도의 출생 후 미세아교세포 최종 수득량을 얻는 것입니다. 이 방법은 신경 염증과 관련된 신호 전달 메커니즘과 같이 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 사용 가능한 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 순도, 수득량 또는 생존율의 손실 없이 분리 과정이 약 30분 정도 소요된다는 점입니다.먼저 1~2일 된 생후 마우스 새끼의 갓 절단된 머리를 층류 정화 작업대(laminar airflow hood)로 옮깁니다. 그 다음, 4.5인치 직선형 미세 해부 가위를 사용하여 절단 부위로 형성된 개구부에 가위 끝을 삽입하고 미측에서 두측 방향으로 절개하여 두개골과 뇌수막에 작은 절개창을 만듭니다. 절개를 마친 후, 한쪽 반구를 옆으로 젖혀 걷어냅니다.그 다음, 곡선형 또는 훅 모양의 핀셋을 사용하여 뇌 전체를 제거합니다. 뇌를 0.25% trypsin EDTA 2 mL가 들어 있는 50 mL 튜브로 옮기고, 37 °C 항온수조에서 15분 동안 배양합니다. 신선한 성장 배지를 넣었다가 제거하는 방식으로 뇌를 세척합니다.세척이 완료되면 뇌 하나당 2 mL의 성장 배지를 추가하고, 뇌를 분쇄하여 균질화합니다. 뇌 조직의 크기가 줄어들지 않으면 더 작은 구경의 피펫으로 교체합니다. 분쇄가 끝나고 덩어리가 보이지 않고 현탁액이 투명해지면, 70-micron 세포 체(cell strainer)에 현탁액을 통과시켜 단일 세포 배양액을 만듭니다.그 다음, 뇌 하나당 두 개의 플라스크를 사용하여 T75 플라스크에 8~9 mL의 배지를 피펫으로 넣고, 각 플라스크에 1 mL의 뇌 균질액을 추가합니다. 16일째에 분리할 때까지 세포를 배양합니다. 16일 후에 플라스크의 배지를 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다.각 T75 플라스크에 0.25% trypsin EDTA 3 mL를 첨가합니다. 그런 다음 오비탈 셰이커를 사용하여 실온에서 5분 동안 플라스크를 흔들어 줍니다. 배양액을 0.4 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.5분 동안 흔들어 섞은 후, 원심분리한 배양액을 최소 4 mL 첨가하여 trypsin EDTA 반응을 중단시키고, 모든 세포가 완전히 떨어져 나왔는지 확인하기 위해 피펫팅(triturate)합니다. 그런 다음 70-µm 세포 스트레이너에 세포를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포 수를 측정하고, 0.4 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.다음으로, 5mL 폴리스티렌 튜브를 준비하여 권장 배지 1mL를 넣고 액면(meniscus)을 표시합니다. 권장 배지를 2.5mL까지 추가하고, 이 액면 또한 표시합니다. 그 후 배지를 제거하고, 펠릿을 권장 배지 500µL에 다시 현탁합니다.이 혼합물을 5mL 폴리스티렌 튜브로 옮긴 후, 1mL 표시선까지 희석합니다. 그다지 현탁된 세포 1mL당 50µL의 쥐 혈청을 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 성분 A 25µL와 성분 B 25µL를 혼합하여 선택 칵테일을 준비합니다. 5분이 경과하면 세포에 선택 칵테일 50µL를 첨가하고 실온에서 5분 더 배양합니다.마이크로비즈를 45초 동안 볼텍싱합니다. 그 다음, 샘플 1 mL당 80 µL의 마이크로비즈를 첨가하고 실온에서 3분 동안 배양합니다. 이어서, 폴리스티렌 튜브의 2.5 mL 표선까지 권장 배지를 첨가합니다.튜브를 자석 홀더에 넣고 상온에서 3분 동안 둡니다. 배양 후, 자석에 거치되어 있는 15-milliliter 폴리스티렌 튜브에 배지를 천천히 따라냅니다. 자성 분리를 3회 더 반복하며, 매회 권장 배지를 2.5 milliliter 표시선까지 추가합니다.마지막 자성 분리 후, 성장 배지 3 mL를 첨가하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 처리를 위해 poly-D-lysine이 코팅된 플레이트에 세포를 분주합니다. 주로 성상교세포를 포함하고 있는 15 mL 튜브의 음성 분획은 T75 플라스크에 분주합니다.37°C 배양기에서 최소 6시간 동안 배양한 후, 음성 분획(negative fraction)이 포함된 플라스크의 모든 성장 배지를 교체하고 다시 배양기에 넣습니다. 이 이미지는 녹색 채널에서 미세아교세포 마커인 IBA를, 적색 채널에서 성상교세포 마커인 GFAP를 탐지하여 분리된 미세아교세포 배양물을 면역세포화학 염색한 결과입니다. Hoechst 염색은 세포핵의 존재를 나타냅니다.GFAP 양성 세포가 관찰되지 않는 것은 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여 분리한 미세아교세포 또한 높은 순도를 가짐을 보여줍니다. 분리된 미세아교세포 배양물에서 얻은 이 면역블롯 단백질들을 GFAP(약 51-kilodalton 밴드로 나타남)와 IBA1(약 15-kilodalton 밴드로 나타남)에 대해 분석하였습니다. Beta-actin은 로딩 컨트롤로 사용되었으며 약 42-kilodaltons에서 나타납니다.기존의 분리 키트의 문제점은 여기에서 보는 바와 같이 적색 채널에서 PE 형광이 관찰될 수 있다는 점이었습니다. 수정된 절차는 여기 적색 채널에서 보이는 것처럼 자성 비드로부터 어떠한 자가 형광도 생성하지 않습니다. 이 절차를 사용하여 분리한 미세아교세포는 신호 전달 연구에 사용할 수 있습니다.Western blot 분석 결과, 새롭게 개선된 방법으로 분리한 미세아교세포에서 Fyn 및 phospho-src tyrosine Y416을 검출할 수 있음을 보여줍니다. 미세아교세포 분리 과정에서 얻은 음성 분획에는 신호 전달 연구에 사용할 수 있는 별아교세포가 포함되어 있습니다. Western blot 분석을 통해 이 음성 분획에 GFAP 양성 세포가 포함되어 있음을 확인하였습니다.Western blot 분석 결과, GFAP 양성 세포에서 Fyn 및 phospho-src tyrosine Y416이 검출될 수 있음을 보여줍니다. 이 절차 이후에 다채널 형광 현미경 검사, western blotting, 정량적 PCR과 같은 다른 방법들을 수행하여 유전자 발현 및 단백질 신호 전달에 관한 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 미세아교세포 실험을 위해 이 신속 분리 기술을 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 쥐 새끼 뇌에서 미세아교세포를 포함한 CD11b 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 뇌 조직을 균질화하여 단세포 현탁액을 얻고, 이 현탁액은 항-CD11b 항체로 코팅된 마이크로비드로 배양된 후 자기 컬럼 기반 분리를 통해 CD11b+ 세포 집단을 정제합니다.

쥐 강아지 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리(Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains)

이 비디오는 자기 세포 분류를 사용하여 마우스 뇌의 탈수초 병변에서 미세아교세포를 추출하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 미세아교세포를 포함하는 병변된 뇌 조직을 절개하고, 특정 효소로 조직을 처리하여 단세포 현탁액을 얻고, 미세아교세포 수용체 특이적 자기 비드를 사용하여 미세아교세포를 분리하는 것이 포함됩니다.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting(자기 활성화 세포 분류를 사용한 마우스 뇌 탈수초 병변에서 미세아교세포 분리)

이 비디오는 신생아 쥐의 뇌에서 세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여주었습니다. 그것은 뇌의 효소적, 기계적 해리를 포함했으며, 그 다음에는 혼합 신경교세포 집단을 얻기 위해 신경 세포 성장 인자가 결핍된 성장 매체에서 배양하는 것이 포함되었습니다.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain(신생아 마우스 뇌에서 혼합 신경교세포 배양 얻기)

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.

탈수초화의 동물 모델에서 자기 활성화 세포 분류에 의한 마우스 일차 미세아교세포의 분리

우리는 상대적으로 짧은 시간에 MACS(magnetically activated cell sorting)를 사용하여 쥐의 시상하부(또는 이에 상응하는 작은 뇌 구조)에서 미세아교세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. MACS 분류된 시상하부 미세아교세포는 체외 분석에 사용할 수 있으며 in vitro 분석을 수행하기 위해 도금할 수 있습니다.

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting  

학습하세요 CD11b 자기 분리법을 이용하여 생후 1-2일 생쥐 뇌에서 미세아교세포를 고순도·고수율로 신속하게 분리하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 연구 및 염증 신호 메커니즘 연구에 활용됩니다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

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