향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

CD11b 자기 미세아교세포 분리의 전반적인 목표는 다목적 체외 실험을 위해 비교적 짧은 기간에 출생 후 미세아교세포의 고순도 말단 수율을 달성하는 것입니다. 이 방법은 신경 염증과 관련된 신호 전달 메커니즘과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 사용 가능한 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 순도, 수율 또는 생존력에 대한 희생 없이 분리에 약 30분이 걸린다는 것입니다.

생후 1일에서 이틀 된 새끼 쥐의 갓 목이 잘린 머리를 층류 후드로 옮기는 것으로 시작합니다. 그런 다음 4.5인치 직선 미세 해부 가위를 사용하여 참수로 형성된 구멍에 팁을 삽입하고 꼬리에서 배까지 절단하여 두개골과 수막을 작게 절개합니다. 절개 후 반구 중 하나를 옆으로 떼어냅니다.

그런 다음 구부러지거나 구부러진 핀셋을 사용하여 뇌 전체를 제거합니다. 2밀리리터의 0.25%트립신 EDTA가 들어 있는 50밀리리터 튜브로 뇌를 옮기고 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 배양합니다. 배지를 추가하거나 제거하여 신선한 성장 배지로 뇌를 씻으십시오.

세척이 완료된 후 뇌당 2ml의 성장 배지를 추가하고 뇌를 분쇄하여 균질화합니다. 뇌 조직이 작아지지 않으면 조리개가 더 작은 피펫으로 전환하십시오. 분쇄가 끝나면 현탁액이 투명하고 눈에 띄는 덩어리가 없으면 현탁액을 70미크론 세포 여과기에 통과시켜 단일 세포 배양을 만듭니다.

그런 다음 8-9 밀리리터의 성장 배지를 뇌당 2개의 플라스크인 T75 플라스크에 피펫으로 넣고 각 플라스크에 균질성 밀리리터를 추가합니다. 16일째 되는 날 격리될 때까지 세포를 성장시킵니다. 16일 후, 플라스크에서 성장 배지를 새 50ml 튜브로 옮깁니다.

각 T75 플라스크에 3ml의 0.25%트립신 EDTA를 추가합니다. 그런 다음 플라스크를 오비탈 셰이커에서 실온에서 5분 동안 흔듭니다. 성장 배지를 0.4 곱 g에서 5 분 동안 원심 분리하십시오.

5분 동안 흔든 후 최소 4ml의 원심분리 배양 배지를 첨가하여 트립신 EDTA 반응을 멈추고 모든 세포가 분리되었는지 확인하기 위해 분쇄합니다. 그런 다음 세포를 70마이크로몰 세포 스트레이너에 통과시켜 단일 세포 배양을 만듭니다. 세포 수를 세는 다음 5분 동안 g의 0.4배로 스핀 다운합니다.

다음으로, 5밀리리터 폴리스티렌 튜브를 가져다가 권장 배지 1밀리리터를 첨가한 다음 반월판을 표시합니다. 권장 매체를 최대 2.5ml까지 추가하고 이 반월판도 표시하십시오. 그런 다음 매체를 제거하고 펠릿을 권장 매체 500마이크로리터에 다시 현탁시킵니다.

이 혼합물을 5 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 옮긴 다음 1 밀리리터 표시까지 희석합니다. 그런 다음 부유 세포 1ml당 50마이크로리터의 랫드 세럼을 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 중에 25 마이크로 리터의 성분 A와 25 마이크로 리터의 성분 B를 혼합하여 선택 칵테일을 준비합니다.5 분이 경과하면 50 마이크로 리터의 선택 칵테일을 세포에 첨가하고 실온에서 5 분 더 배양합니다.

45초 동안 미세구를 소용돌이칩니다. 그런 다음 샘플 1ml당 80마이크로리터의 마이크로스피어를 추가하고 실온에서 3분 동안 배양합니다. 다음으로, 폴리스티렌 튜브에 최대 2.5ml 표시까지 권장 매체를 추가합니다.

튜브를 실온에서 3분 동안 마그네틱 홀더에 넣습니다. 배양 후 자석에 있는 15밀리리터 폴리스티렌 튜브에 배지를 천천히 붓습니다. 자기 분리를 세 번 더 반복하고 매번 권장 매체를 2.5ml 표시까지 추가합니다.

마지막 자기 분리 후 3 밀리리터의 성장 배지를 추가하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 치료를 위해 poly-D-lysine 코팅된 플레이트에 세포를 플레이트합니다. 대부분 성상세포를 포함하고 있는 15ml 튜브의 음극 분획을 T75 플라스크에 플레이트화합니다.

섭씨 37도의 인큐베이터에서 최소 6시간 동안 배양한 후, 인큐베이터로 돌아가기 전에 음의 분획을 함유한 플라스크의 모든 성장 배지를 교체하십시오. 이 이미지는 녹색 채널에서 미세아교세포의 마커인 IBA와 빨간색 채널에서 성상교세포의 마커인 GFAP에 대해 프로브된 분리된 미세아교세포 배양의 면역세포화학을 보여줍니다. Hoechst 염색은 세포핵의 존재를 나타냅니다.

GFAP 양성 세포가 없다는 것은 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여 분리된 미세아교세포도 순도가 높다는 것을 보여줍니다. 분리된 미세아교세포 배양물에서 추출한 이러한 면역 블로티드 단백질은 약 51킬로달톤 띠로 나타나는 GFAP와 약 15킬로달톤 띠로 나타나는 IBA1에 대해 조사되었습니다. 베타 액틴은 로딩 제어로 사용되었으며 약 42킬로달톤에서 나타납니다.

기존 분리 키트의 문제점은 여기에서 볼 수 있듯이 빨간색 채널에서 PE 형광을 관찰할 수 있다는 것이었습니다. 수정된 절차는 여기 빨간색 채널에서 볼 수 있듯이 마그네틱 비드에서 자동 형광을 생성하지 않습니다. 이 절차를 사용하여 분리된 미세아교세포는 신호 연구에 사용할 수 있습니다.

웨스턴 블롯 분석은 Fyn 및 phospho-src tyrosine Y416이 새로 정제된 방법으로 분리된 미세아교세포에서 검출될 수 있음을 보여줍니다. 미세아교세포 분리의 음성 분획에는 신호 연구에 사용할 수 있는 성상세포가 포함되어 있습니다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)은 음의 분획에 GFAP 양성 세포가 포함되어 있음을 보여줍니다.

웨스턴 블롯 분석은 Fyn 및 phospho-src 티로신 Y416이 GFAP 양성 세포에서 검출될 수 있음을 보여줍니다. 이 절차에 따라 다중 채널 형광 현미경 검사, 웨스턴 블로팅 및 정량적 PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 유전자 발현 및 단백질 신호에 관한 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세아교세포 실험 목적으로 이 신속한 분리 기술을 활용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.