Name: IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 iPSC 유래 인간 뇌 오가노이드 생성 방법을 통해 초기 신경 발달 장애를 모델링하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 미세두증 연구에 활용될 수 있습니다.

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이 작품은 프리츠 티센 재단 (Az.10.14.2.152)에 의해 지원되었다. 우리는 조직 삽입 시설 및 CMMC의 현미경의 핵심 시설에 감사하고 있습니다. 우리는 중심체와 세포 뼈대 생물학 연구소의 회원들에 의해 제공되는 토론 및 기술 지원에 대한 감사합니다. 우리는 원고를 교정하기위한 이명 Gooi 감사합니다.

뇌 Organoids의 1 세대 (이십삼일) <ol><li> neuroectoderm의 개시 (5 일) 주 : 다음 사항이 분화를 시작하기 전에 고려되어야한다. 인간 iPSCs를 얻기 위해 프로그래밍 방법 (lentiviral- 센다이 바이러스에 episomal-, 또는 마이크로 RNA 기반 등)을 이상적으로 모든 환자에게 동일 및 IPSC 라인을 제어한다. 다양한 프로그래밍 키트 및 출판 프로토콜에 따라 지침은 15, 16, 17, 18 사용할 수 있습니다. 인간의 IPSC 라인의 품질은 최적의 차별화를 달성하는 열쇠입니다. 현미경 콜로니 및 세포 형태를 모니터링하고 Oct3 / 4, Nanog를하거나, TRA-1-60으로 마커의 발현을 검사하여 분화능을 확인. <ol><li> Engelbreth-홀름 - 떼 코팅 접시에 매체 A의 공급이없는 조건에서 배양 인간 iPSCs(EHS) 행렬. 참고 : 인간 iPSCs 성장 피더 무료 무 혈청 정의 된 문화 상태를 유지하는 것이 차별화의 시작하기 전에 마우스 배아 피더 세포 (MEFs에)의 제거를위한 추가 단계를 피하기 위해. 인간 iPSCs위한 최적 경로 번호는 전체에 통로 (70)에 프로그래밍에 통로 (15)로부터 분화 범위를 시작한다. 계대 때 새로운 접시 응집체를 전송할 낮은 기계적 응력 적합한 세포 분리 용액 및 2 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 셀로 골재 hiPSC 콜로니를 분리. 이것은 대부분의 IPSC 라인의 분화와 세포 사멸을 유도 수로, 단일 세포로 분리하지 마십시오. 그것은 장기 단일 세포 계대 인간 iPSCs 19, 20 게놈 변경을 증가시킬 수 있다고보고되었다. 이 iPSCs의 전체 생존 능력을 감소시키기 때문에, 박리 액을 제거하기 위해 원심 분리 단계를 필요로 세포 분리 과정을 피한다. 테스트미생물 오염, 정기적으로, 특히 마이코 플라스마, 모든 문화는이하여 iPSCs의 품질과 분화 능력을 변경할 수 있기 때문이다. <ol><li> 코트 제조업체의 지침에 따라 EHS 매트릭스와 60mm 조직 배양 접시. </li><li> 1 × 106의 인간 iPSCs 분취 량을 해동. EHS 매트릭스에 코팅 매체 A 5 ㎖를 (재료 표 참조)를 함유하는 60-mm 조직 배양 접시에 iPSCs 종자. 세포 ~ 80 % 포화 상태에 도달했을 때 5 ~ 7 일 후 일상 매체와 경로를 변경합니다. 참고 : 통로 분화를 시작하기 전에 적어도 한 번 같은 식민지 (21)의 효소가없는 분리와 같은 표준 방법을 사용하여 80 %의 포화 상태에서 해동 iPSCs를. 제조자의 다음 iPSCs를 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 및 배양 : 요약하면, 상기 IPSC 매체를 제거 예열 37 ° C 둘 베코 변형 이글 배지로 한번 세척 세포시약 A를 이용하여 설명은 (재료 표 참조). 단일 세포 분리를 방지하기 위해 권장되는 배양 시간을 초과하지 마십시오. 인간 iPSCs은 분리 및 응집과 같은 단일 세포로하지 부동한다. 그들은 다음 새 EHS 매트릭스 코팅 요리로 전송할 수 있습니다; 예를 들어, IPSC 한 60-mm 요리는 4 개의 새로운 60 mm 요리에 배포 할 수에서 집계합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 마이코 플라즈마 검출 키트와 함께 마이코 플라스마를 확인합니다. 마이코 플라스마가 iPSCs의 분화 능력을 변경할 수 만 마이코 플라스마없는 iPSCs를 사용합니다. </li></ol></li><li> iPSCs (80 % 융합)를 해리 B. 시약을 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조 <ol><li> 예열 (37 ° C) DMEM / F12와 iPSCs 번 씻는다. </li><li> 37 ° C에서 5 분, 5 % CO 2의 iPSCs를 (a 60mm 접시에 예를 들면, 1 mL)을 예열 시약 B를 첨가하고 배양한다. </li><li> 측면과 하단에 손가락으로 톡 20 배요리는 iPSCs를 분리합니다. 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다. </li><li> 1 mL를 마이크로 피펫으로 접시에 상하 5 회 세포 현탁액 피펫. </li><li> 시약 B 1 mL로 희석하고 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집 매체 A의 3 mL를 넣고. </li><li> 천천히 실온에서 4 분 동안 iPSCs (500 XG)를 스핀 다운. </li><li> B 매질 1 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 혈구 세포 수를 계산. 참고 : 부유에만 매체 B를 사용하여 알고 있어야합니다. 이 분화를 억제 할 수의 bFGF의 너무 높은 농도를 포함으로, 매체 A를 사용하지 마십시오. </li></ol></li><li> 10 μM (ρ) - 관련 키나제 억제제 (Y-27632)로 보충 된 배지 B의 용액 당 4.5 × 105 세포에 세포 현탁액을 희석. </li><li> 비 부착, V 바닥 96 웰 플레이트에 잘 당 100 μL를 추가합니다. 참고 : 확인 세포를 동등하게 SUS에 분포되어100 μL 부분을 인출하기 전에 튜브 매번 진탕 연금. 각각의 웰은 크기 및 형상 (원형, 정의 된 표면)에 neurosphere를 균일를 얻기 위하여 동등한 세포 수를 포함하는 것이 중요하다. </li><li> 부드럽게 3 분 동안 500 XG하고 실온에서 세포를 플레이트의 회전 속도, 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. </li><li> 50 μL를 제거하고 다음 5 일 동안 각 우물에 신선한 매체 B의 50 μL를 추가하여 매일 매체를 변경합니다. </li></ol></li></ol> EHS 매트릭스 2. 임베딩 neurosphere를 (4 일) <ol><li> / W (않고 100 (v / v)로 보충 2 : 200 (v / v)로 보충 1, 1 : 1 : DMEM / F12 매체 C (V / V) 1 1 혼합물은 다음을 혼합하여 neurosphere 매체를 준비 O) 비타민 A, 1 : 100 L 글루타민, 0.05 mM 비 필수 아미노산 (MEM), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 1.6 g / L 인슐린, 0.05 밀리미터 β 머 캅토 에탄올. </li><li> neurosphere를 재치를 수집HA ~ 2mm 팁을 사용하여 200 μL 마이크로 피펫 미리 멸균 가위로 잘랐다. </li><li> 빈 100mm 접시에 약 5mm 떨어진 파라핀 필름 (3 × 3cm 2)에 서로 neurosphere를 놓고 조심 가능한 남은 배지만큼 제거한다. </li><li> 각 단일 neurosphere 상 EHS 행렬의 드롭 (7 μL)을 추가한다. </li><li> EHS 매트릭스 인큐베이터에서 15 분 동안 인큐베이션 neurosphere를 가진 방울. </li><li> neurosphere 매체를 세척하여 파라핀 필름에서 조심스럽게 neurosphere를 씻으십시오. 플러시, 1 mL의 마이크로 피펫과 neurosphere 배지 10 ㎖를 함유하는 새로운 100mm 페트리 접시를 사용한다. </li><li> 다음 4 일 동안 neurosphere를 품어 하루 2 신선한 neurosphere 매체의 2 mL를 넣어. 주 : EHS 매트릭스 내장 neurosphere를가 접시 한쪽에 함께 응집되지 않도록 인큐베이터에있는 선반이 평평한 지 확인합니다. </li></ol> 로타리 정지 3. Organoids문화 (14 일) <ol><li> 200 (v / v)로 보충 1, 1 : 100 (v / v)로 보충 2 / O w 1 : DMEM / F12 매체 C (V / V) 1 1 혼합물은 다음을 혼합하여 뇌 유사 장기 매체를 준비 비타민 A, 1 : 100 L 글루타민, 0.05 mM의 MEM, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 1.6 g / L 인슐린, 0.5 μM dorsomorphin 5 μM SB431542, 0.05 밀리미터 β 머 캅토 에탄올. </li><li> 측면 아암을 각각 스피너 플라스크 뇌 유사 장기 배지 100 ㎖를 첨가하고, 적어도 20 분 동안 사전 - 온난화 인큐베이터에 배치. </li><li> 제조업체의 지침에 따라, 25 rpm에서 교반 프로그램을 설정합니다. 참고 : 스피너 플라스크에 EHS 매트릭스 내장 neurosphere를 전송하기 전에, 그들은 모두 분리되어 있는지 확인합니다. 두 개 이상이 EHS 매트릭스를 통해 연결된 경우, 메스 접속 행렬 절단으로 분리. </li><li> 조심 유사 장기 배지 100 ㎖을 함유하는 스피너 플라스크에 EHS 행렬 매립 neurosphere를 전송할 우리2 ㎖의 혈청 피펫을 보내고. 플라스크에 neurosphere를 전송하는 스피너 플라스크의 측면 팔을 사용합니다. </li><li> 37 ℃ 및 5 % CO 2 인큐베이터에서 자기 교반 플랫폼 스피너 플라스크로; 이것은 유사 장기 문화의 날 0입니다. </li><li> (또는 더 자주 색상의 변화가있을 때) 매체의 절반을 제거하고 신선한 매체의 동일한 금액을 추가하여 일주일에 한 번 매체를 변경합니다. 참고 : 인큐베이터에서 스피너 플라스크를 복용하는 경우, organoids는 플라스크의 아래로 가라 앉을 수 있도록 3-5 분을 기다립니다. 액체의 표면 (펌프에 연결된) 유리 피펫 팁을 배치하여 매체를 제거; 신중 일측 개구부 / 플라스크 아암 통해 매체 대기음. 이러한 조작은 층류 후드에서 수행해야합니다. </li></ol> 뇌 Organoids 4. 분석 <ol><li> organoids의 고정 <ol><li> 스피너 플라스크 문화 위스콘신의 14 일에 organoids를 수집절단 한 ML 마이크로 피펫 (컷 ~ 5mm)를 토륨. 60 밀리 접시에 이들 모두를 넣고 3 분 동안 따뜻한 DMEM / F12 5 ㎖로 한번 씻어. </li><li> 따뜻한 4 % 파라 포름 알데하이드 500 μL (PFA)와 함께 1.5 ㎖의 튜브를 준비한다. 주의 : PFA의 정착액을 처리 할 때 안전 후드 아래에 피부와 눈 보호 작업을 착용 할 것. </li><li> 각각 개별적으로 각각의 관을 실온에서 적어도 30 분 동안이를 해결 유사 장기 놓는다. 이상 60 분 동안 organoids를 수정하지 마십시오. organoids를 이동하려면 접종 루프 또는 편리 다른 궁리를 사용합니다. </li><li> PFA를 제거하고 PBS 1 ml로 10 분마다 두 고정 organoids 씻는다. </li><li> 추가로 사용할 때까지, 최대 7 일 동안 4 ℃에서 PBS 1 ㎖에 organoids 보관. </li></ol></li><li> 냉동 절편의 organoids를 포함하기 <ol><li> PBS를 제거하고이를 cryofreezing 전에 organoids을 탈수 튜브 당 증류수 용액에 30 % 수크로오스 1 mL를 넣고; sucro를 추가 한 후SE 용액은 organoids 표면에 부유한다. 4 ℃에서 자당 용액에 하룻밤 보관 organoids; 다음날함으로써 organoids는 튜브의 아래쪽으로 침몰한다. 주 : 필요한 경우 Organoids는 자당 용액에 4 ℃에서 최대 3 ~ 5 일 동안 저장 될 수있다. </li><li> 최적 절단 온도 촬영기 화합물 400 μL와 비닐 시편 금형을 채우고 몰드의 중앙에 배치 유사 장기를 접종 루프를 사용한다. 샘플 이름 몰드 림 라벨. </li><li> 냉동 절편까지 -80 ° C에서 유사 장기 함유 주형 동결. </li><li> 코트 된 유리 실온에서 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 폴리 -L- 라이신 용액 (PLL)와 cryoslides하게 슬라이드하고 3 시간 동안 건조. 4 ° C에서 슬라이드를 저장하고 사용하기 전에 실내 온대로 따뜻하게. 참고 : 멀리 떠에서 유사 장기 조각을 차단하므로 PLL - 코팅, 중요한 단계입니다. 수집 최대 3 4 ℃에서 보관 PLL 용액달. 재사용 전에, 0.22 μm의 주사기 필터로 실온까지 따뜻해하자. </li><li> PLL 코팅 유리 20 내지 50 ㎛의 두께로 슬라이스 단면의 cryofrozen organoids는 22 cryoslides. 섹션과 슬라이드는 실온에서 1 시간 동안 건조 시키십시오. 추가 처리 될 때까지 -80 ℃에서 보관 섹션. </li></ol></li></ol> 유사 장기 섹션 5. 면역 형광 염색법 참고 : 네 스틴, 신경 전구 마커 및 TUJ1, 범 신경 세포 마커 염색 organoids의 일반적인 특성, 내용은 좋습니다. 추가 예, 정단 분열 반경 교세포 라벨 포스 멘틴 (p-빔) 및 Arl13b과 면역 염색법으로, 섬모를 들어 설명한다. 세포 사멸을 테스트하려면, 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 (TDT) 된 dUTP 닉 엔드 라벨 (TUNEL) 분석을 사용합니다. 먼지로부터 보호하기 위해 배양시 플라스틱 박스에 슬라이드를 놓고 빛및 건조. <ol><li> 실온에서 30 분간 슬라이드를 해동. </li><li> PFA 유도자가 형광을 켄칭 3 분간 PBS 글리신 200 μL (PBS에서 글리신 0.225 g)로 두 번 슬라이드를 세척한다. </li><li> 0.5 % 트리톤 X100 200 μL / 실온에서 10 분 동안 PBS 용액 중 0.1 % 트윈으로 섹션 Permeabilize 하시려면. </li><li> 3 분 동안 PBS-글리신 액 200 μL로 두 번을 씻으십시오. </li><li> 비특이적 항원 결합을 차단 실온 또는 밤새 4 ℃에서 1 시간 동안 PBS에서 0.5 % 어류 젤라틴 200 μL / 0.1 % 트리톤 (Triton) X100로 부화. 참고 : TUNEL 분석이 필요한 경우, 제조사의 프로토콜에 따라 분석을 수행합니다. 이 이차 항체를 방해하고 나중에 사용할 때 형광을 해소 하듯, 면역 염색을 수행하기 전에 TUNEL 분석을 시작합니다. </li><li> 네 스틴, 1 : 다음의 농도로 용액으로 차단 항체를 희석 (200); P-빔, 1 : 500; TUJ1, 1 : 200;Arl13b 1:20; 및 이차 항체, 1 : 1,000. </li><li> 실온 또는 밤새 4 ℃에서 1-2 시간 동안 제 차 항체 200 μL (예를 들어, 네 스틴)로 인큐베이션. </li><li> 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다. </li><li> 차단 용액 1,000 실온에서 1-2 시간 동안 200 μL의 슬라이드를 배양 : 제 (항 - 마우스 488) 1 차 항체를 희석. 이제부터 항상 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다. </li><li> 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다. </li><li> 실온에서 1-2 시간 또는 밤새 39 ° C에 대해 (예 TUJ1) 다음에 일차 항체 200 μL와 인큐베이션. </li><li> 차단 용액 200 μL로 3 × 3 분 동안 세척 하였다. </li><li> 실온에서 1-2 시간 동안 다음 이차 항체 (항 - 토끼 647) 200 μL를 추가합니다. </li><li> 3 × 3 분 동안 세척 하였다. 차단 용액 200 μL와. </li><li> 30nm의 진한 4에 200 μL &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 추가핵 염색을 실온에서 15 분 동안 PBS에서 entration. </li><li> 차단 용액 200 μL 2 × 3 분 동안 세척 하였다. </li><li> 증류수 200 μL로 1 × 1 분 동안 세척하고 명백한 물방울이 더 이상 보이지 않을 때까지 섹션, 10-20 분 동안 건조하자. </li><li> 매체를 내장으로 섹션을 탑재합니다. 그 몇 주까지 4 ° C에서 빛으로부터 보호 저장합니다. </li><li> 이미지에 대한 현미경 분석 유사 장기 심실 영역 프리미티브 피질골 플레이트, 및 다른 관심 영역에 대한 개요를 진행. </li><li> 1, 10을 사용하는 형광 색소 표지 된 이차 항체에 따라 선택된 오일 63X 대물 형광 필터와 공 촛점 현미경을 사용한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

MCPH는 생체 내에서 또는 단순 인간의 세포 배양 시험관에 접근에서 동물 모델에서 효과적으로 요약 할 수없는 복잡한 인간의 신경 발달 장애이다. MCPH의 임상 양상은 초기 신경이 시작될 때 첫 번째 임신 동안 표시하기 시작합니다. 따라서, 3D 뇌 organoids는 MCPH 개발을 모델링하는 신뢰할 수있는 실험 시스템을 나타냅니다. 또한, 3D 인간 뇌 organoids는 중요한, ⅲ) 다양한 분화 I)들은 다양한 유전 적 배경을 가진 환자의 샘플들의 스펙트럼의 적응을 허용는 1, 2)가 다른 신경 세포 유형을 포함하는 편성 조직을 표시 때문에 이상적인 방법이며 이 체외 방법에서 신경 발달의 단계는 생체 대응 25, 26, 27에 연결되어 있습니다. 예를 들어, 신경 장미는 현...

같은 소두증과 같은 인간의 신경 발달 장애는 단지 가난으로 인해 인간의 두뇌가 확장 된 대뇌 피질의 표면, 인간이 아닌 동물과는 다른 독특한 기능을 가지고 있다는 사실을 동물 모델에서 공부하실 수 있습니다. 이 측면은 인간의 두뇌 발달을 충분히 체외 세포 배양 시스템에서, 2 차원에서 연구 할 수없는 복잡한 과정을 수 있습니다. 신흥 3D 배양 기술은 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 조직 형 organoids의 생성을 허용한다. 차원 현탁 배양에서 다 능성 줄기 세포의 체외 분화 조직, 층상 조직의 1, 2, 3를 야기한, 적시 영역 특정 수단으로 각종 종류의 세포를 형성 할 수있다. 3D 문화 기술을 개척하고 줄기 세포에서 시작, 기관 형성의 복잡성을 신화화 실험실 덕분에,우리는 인간의 두뇌 발달의 초기 이벤트를 묘사하고 시험관 1, 2, 3 소두증을 모델링 뇌 organoids를 생성하는 강력한 방법을 개발했다. 우리가 랭카스터 동부 등에 의해 개발 된 일본어 방법을 채택하는 것이 주목된다. 대뇌 organoids 1을 생성한다. 이 방법은 우리의 실험 요구 사항에 따라 수정되었습니다. 가브리엘 등의 알에서 연구의 목적. 두뇌 개발하는 동안 신경 줄기 세포의 유지 보수의 세포 및 분자 메커니즘을 분석했다. 이를 위해, 기계 론적 연구는 소두증 환자 4에서 파생 된 3D 뇌 organoids에서 신경 전구 세포 (NPC들)을 분석하여 수행되었다. 이 환자는 CPAP, 중심체 생합성 5에 필요한 보존 centrosomal 단백질에 돌연변이를 실시했다. 널리 인정 저자논문 소두증는 NPC 풀의 고갈의 결과 인 것으로하고,이 중 세포 사멸 또는 분화 조기 1, 6, 7, 8, 9에 기인 할 수있다. 소두증 뇌 organoids의 심실 영역 (VZs)를 분석함으로써, NPC의 상당수는 건강한 공여체 (4)로부터 유도 뇌 organoids 달리 비대칭 세포 분열을 겪는 것으로 나타났다. 소두의 뇌 organoids의 광범위한 현미경 및 생화학 분석은 적절 섬모의 분해 4 CPAP에 대한 예기치 않은 역할을 한 것으로 밝혀졌습니다. 구체적으로는, 돌연변이가 CPAP NPC의 조기 (4)의 분화를 초래 지연 섬모 분해 지연 세포주기 재진입와 연관된다. 이러한 결과는 소두증과 일에 섬모의 역할을 제안신경과 뇌의 크기 제어 10시 EIR 참여. 이 프로토콜의 첫 번째 부분은 뇌 균질 organoids를 생성하는 세 단계 방법의 설명이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 원래 랭커스터 프로토콜은 적응하고 우리의 목적 (1)에 맞게 수정되었습니다. 첫째, 인간 iPSCs는 Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS) 행렬에 정의 된 장치가없는 상태에서 배양했다. 이 단계는 공급에 의존하는 만능 줄기 세포 배양의 변화를 방지 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 신경 분화 유도 신경 상피 iPSCs로부터 시작 형성한다. 배아 체 (EB)의 형성 공정, 및보다 제어 지시하게 신경 분화의 진행을 스킵함으로써. 이 방법은 중배엽 및 내배엽 다른 생식 세포 층의 자발적 무향 형성을 제한한다. 이 프로토콜을 적용하여, 신경 근엽을 포함 neurosphere를가 EH을 위해 5 일에 수확 할 수있다S 행렬 삽입 및 고정 현탁 배양. 우리 프로토콜의 세 번째 단계에 사용 된 배지는 유사 장기 dorsomorphin 및 SB431542로 보충된다. Dorsomorphin 뼈 형태 형성 단백질 (BMP)의 소분자 억제제 및 SB431542은 TGFβ / 티빈 / 절점 신호 전달 체계를 억제한다. 이러한 요인들의 조합은 신경 분화를 더 효율적으로 단독보다 11, 12, 13, 14, 레티노 산을 촉진 할 수있다. 요컨대, 이러한 수정은 organoids에서 최소한의 변화로, 뇌 organoids의 재현 세대 수 있습니다. 중요한 것은,이 방법은 견고 중심체와 세포주기 역학에 영향을 미치는 유전자 변이를 가지고 환자 iPSCs에서 소두의 뇌 organoids를 생성하기 위해 적용되었다. 이 프로토콜의 두 번째 부분은 BR을 준비하는 지침을 제공합니다아인은 분석 및 소두증의 세포 결함의 해석 organoids. 이것은 고정, 저온 절편, 면역 형광 염색법, 및 공 촛점 현미경 분석을 포함한다. 이 프로토콜은 예상 된 결과에 대한 자세한 설명과 해석에 대한 안내와 함께 독자를 제공 할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B rabbit polyclonal 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN 시스템</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; 여러 공급업체</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco의 Modified Eagle Medium: 영양소 혼합물 F-12&nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>화합물 C; 여러 공급업체</td></tr><tr><td>포함 매체</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; 포함 매체; 여러 공급업체</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 매트릭스</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스; 중요: hESC 인증</td></tr><tr><td>생선 젤라틴&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>G7765-250ML</td><td>젤라틴은 냉수 물고기 피부에서 추출합니다; 여러 공급업체; PBS에 첨가하여 용해 및 살균한 후 오토클레이브, 4°에서 보관; C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>분자생물학용 글리신; 여러 공급업체&nbsp;</td></tr><tr><td>일회용(1 &micro; L)</td> <td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>여러 공급업체&nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>복수 공급업체</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco, 미국</td><td></td><td>25030081 L-글루타민(200 mM)</td></tr><tr><td>매체 A</td><td>줄기세포 기술</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC 매체)</td></tr><tr><td>매체 B</td><td>줄기세포 기술</td><td>#05835</td><td>신경 유도 매체(NIM); 신경 분화 매체</td></tr><tr><td>매체 C</td><td>Gibco, 미국</td><td>21103049</td><td>신경 기저 매체</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert 마이코플라즈마 검출 키트</td><td>Lonza, 스위스</td><td>#LT07-218</td><td>마이코플라스마 검출 키트; 복수 공급업체</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin 마우스 단클론 항체 (4D11)</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>PBS에서 4%, -20°C에서 용액 저장; C; 주의: 피부와 눈 보호구를 착용하고 후드 아래에서 작업하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>제조업체&acute를 참조하십시오. s 지침; 여러 공급업체</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10.000 U/mL)</td><td>Gibco, 미국</td><td>15140122</td><td>여러 공급업체</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 용액(PLL)</td><td>시그마-알드리치, 미국</td><td>P8920-100ML</td><td>여러 공급업체</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>포스포-비멘틴(Ser55) mAb</td></tr><tr><td>시약 A&nbsp;</td><td>줄기세포 기술</td><td># 05872</td><td>프로토콜 1.1.1.2에 대한 참고; ReLSR(효소가 없는 인간 ES 및 iPS 세포 선택 및 계대 시약); manufactorer&acute를 따르십시오. s 프로토콜; 다양한 공급 업체의 대체 제품 사용 가능</td></tr><tr><td>시약 B &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase 용액은 단일 세포 해리를 위한 효소 용액입니다; 여러 공급업체; 프로토콜 1.1.2 "효소 세포 해리 용액" &nbsp;</td></tr><tr><td>연구 저온 유지 장치 Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>여러 공급 업체</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>여러 공급</td></tr><tr><td>업체 Spinner flask 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td></td> 182026 <td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>여러 공급 업체</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>슬라이드에는 "+"와 양전하를 띤 라벨이 있어야 합니다</td></tr>. <tr><td>보충제 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 보충제(100x)</td></tr><tr><td>비타민 A 없는 보충제 2</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 보충제(50x), 비타민 A 제외; 여러 공급업체</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>여러 공급업체</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 컴파운드</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>여러 공급업체</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>여러 공급업체</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&beta;-Tubulin III(토끼 다클론)</td></tr><tr><td>TUNEL 분석</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd 형광 측정 TUNEL 시스템; 여러 공급업체</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular biology</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>여러 공급 업체</td></tr><tr><td>방수 시트</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>파라 필름 " M&rdquo;; 여러 공급업체</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); 복수 공급업체</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>Gibco, 미국</td><td></td><td>31350010 2-메르캅토에탄올 (50 mM); 복수 공급업체</td></tr></tbody></table>

ipsc 파생 된 인간의 두뇌 organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

복잡한 인간 두뇌 발달을 안정적으로 나타낼 수 있는 적절한 체외 모델의 가용성이 제한되는 것은 기본적인 뇌 연구를 임상 적용으로 전환하는 것을 제한하는 심각한 병목 현상입니다. 유도만능줄기세포(iPSC)가 윤리적으로 의심스러운 인간 배아 줄기세포를 대체했지만, iPSC 기반 신경 세포 분화 연구는 세포 수준에서 설명적인 수준에 머물러 있지만 복잡한 3D 인간 뇌 조직에서 파생될 수 있는 세부 정보를 적절하게 제공하지 못하고 있습니다. 
이 간극은 이제 복잡한 인간 뇌 발달의 많은 특징을 모델링하는 iPSC에서 파생된 3D 뇌 오가노이드인 "Brains in a dish"의 적용을 통해 채워집니다. 여기에서는 iPSC에서 파생된 3D 뇌 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다. 오가노이드는 희귀한 인간 신경 발달 장애인 상염색체 열성 원발성 소두증(MCPH)을 모델링하는 데 도움이 될 수 있습니다. MCPH의 뇌 기형에 대한 널리 받아들여지는 설명은 인간 뇌 발달의 초기 단계에서 신경 줄기 세포 풀의 고갈이며, 이는 체외에서 재현하거나 증명하기 어려운 발달 결함입니다.
MCPH를 연구하기 위해 중심체 단백질 CPAP에 돌연변이가 있는 환자 유래 섬유아세포에서 iPSC를 생성했습니다. 소두증 3D 뇌 오가노이드의 심실 영역을 분석하여 신경 전구 세포의 조기 분화를 보여주었습니다. 이러한 3D 뇌 오가노이드는 신경독성 화학물질, 신경영양성 바이러스 감염 또는 유전적 돌연변이에 의해 유발되는 선천성 뇌 장애를 모델링하는 데 중요한 역할을 하는 강력한 체외 시스템입니다.

뇌 organoids의 생성은 연속 배양 (그림 1A)의 적어도 세 주이 필요합니다. 재현 가능한 결과를 달성하기 위해, 우리는 연구자가 모든 단계를 문서화하고, 중요한 매체 구성 요소, 시점, 세포 처리에 관한 변경을 방지하는 것이 좋습니다. 여기서 우리는 중요한 이정표가 실험의 끝에서 충분한 품질의 organoids를 얻기 위해 도달하는 경우 평가하는 방법에 대한 요약을 제공합니다. 96- 웰 플레이트에서 neurosphere를 형성은 제 neurosphere를는 각 웰의 바닥 (도 1b, 단계 1)에서와 같은 잘 정의 된 분야를 인식 할 수있는 일로부터 명확히 볼 수 있어야한다. 5 일째, neurosphere를는 ~ 500 μm의 직경이어야 어두운 중심을 둘러싸는 밝은 테두리와, 평활 한 표면...

신경 상피 조직의 전례 없는 복잡성으로 인해 인간의 뇌 발달을 모델링하는 데 방해를 받았습니다. 여기에서는 인간 뇌 발달의 초기 사건을 묘사하고 체외에서 소두증을 모델링하기 위해 뇌 오가노이드의 강력한 생성 방법을 설명합니다.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

iPSC 유래 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 이 프로토콜의 전반적인 목표는 초기 인간 신경 발달 장애를 모델링하는 것입니다. 이 방법은 새로운 신경 발생 및 일차성 소두증에서 신테좀(synthesomes)과 섬모(cilia)의 역할과 같이 인간 뇌 발달 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 환자의 iPSC 유래 뇌 오가노이드로부터 재현 가능한 결과를 얻을 수 있는 견고하고 신속한 모델이라는 점입니다.이 절차의 시연은 쾰른 분자 의학 센터 내 본인 연구실의 박사 후 연구원인 Elke Gabriel이 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 멸균 가위로 미리 자른 2 mm 팁과 200 µL 마이크로파이펫을 사용하여 뉴로스피어를 수집하십시오. 그다음, 100 mL 디쉬 내의 파라핀 필름 위에 뉴로스피어들을 약 5 mL 간격으로 배치하십시오.남아 있는 배지를 최대한 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음, 각각의 단일 뉴로스피어 위에 EHS matrix를 한 방울씩 떨어뜨립니다. EHS matrix 방울과 뉴로스피어를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.그 후, 뉴로스피어 배지로 씻어내어 파라핀 필름으로부터 뉴로스피어를 조심스럽게 세척합니다. 이어서 뉴로스피어를 향후 4일 동안 배양하며, 2일 차에 2 mL의 신선한 뉴로스피어 배지를 추가합니다. 이 과정에서, 각 스피너 플라스크의 사이드 암을 통해 브레인 오가노이드 배지 100 mL를 첨가합니다.배지를 37 °C 인큐베이터에서 최소 20분 동안 미리 데워둡니다. 그런 다음, 뉴로스피어(neurosphere)들이 모두 분리되어 있는지 확인합니다. 둘 이상의 뉴로스피어가 EHS matrix로 연결되어 있다면, 메스로 연결된 매트릭스를 절단하여 분리합니다.교반 프로그램을 25 RPM으로 설정합니다. EHS 매트릭스가 포함된 신경구(neurospheres)를 100 milliliters의 오가노이드 배지가 담긴 스피너 플라스크로 조심스럽게 옮깁니다. 그 후, 스피너 플라스크를 인큐베이터 내의 자성 교반 플랫폼 위에 배치하고 37 degrees celsius에서 14일 동안 배양합니다.오늘은 오가노이드 배양의 0일 차입니다. 일주일에 한 번, 배지의 절반을 제거하고 동일한 양의 신선한 배지를 추가하여 배지를 교체하십시오. 이 단계에서는 미리 절단된 1 mL 마이크로 피펫을 사용하여 배양 14일 차에 스피너 플라스크 배양액에서 오가노이드를 수집합니다.이들 모두를 60 mm 디시에 넣고 5 mL의 따뜻한 DMEM F12로 3분 동안 한 번 세척합니다. 그 후, 500 µL의 따뜻한 4% PFA가 담긴 1.5 mL 튜브를 준비합니다. 각 오가노이드를 각각의 튜브에 따로 넣고 실온에서 30-60분 동안 고정합니다.그 후, 접종 루프를 사용하여 오가노이드를 제거합니다. 그런 다음 PFA를 제거하고, 고정된 오가노이드를 1 mL의 PBS로 10분씩 2회 세척합니다. 이어서, 오가노이드를 1 mL의 PBS에 담아 4 °C에서 최대 7일 동안 보관하여 추후 사용합니다.동결 절편 제작을 위해 오가노이드를 임베딩하려면, PBS를 제거하고 각 튜브에 30% sucrose 용액 1 milliliter를 첨가하여 동결 전 오가노이드를 탈수시킵니다. sucrose 용액을 첨가한 후 오가노이드는 표면에 떠 있어야 합니다. 오가노이드를 sucrose 용액에 담가 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.다음 날이면 오가노이드가 튜브 바닥으로 가라앉아 있어야 합니다. 그 후, 비닐 표본 몰드에 OCT 화합물 400 milliliters를 채웁니다. 그리고 접종 루프를 사용하여 몰드의 중심에 오가노이드를 배치합니다.몰드의 가장자리에 샘플 이름을 표시하십시오. 그 후, 오가노이드가 포함된 몰드를 -80 °C에서 냉동 절편 제작 시까지 보관하십시오. 이어서, 유리 냉동 슬라이드를 0.1% PLL과 PBS로 코팅하여 상온에서 5분 동안 유지하십시오.그 다음, 슬라이드를 3시간 동안 건조시킵니다. 슬라이드를 4 °C에서 보관하고, 사용 전 실온으로 가온합니다. 이후, PLL이 코팅된 유리 냉동 슬라이드 위에 냉동 보존된 오가노이드를 20~50 µm 두께의 절편으로 제작합니다.절편을 상온에서 1시간 동안 건조시킨 후, 추가 공정을 진행할 때까지 -80°C에서 보관하십시오. 전형적인 VZ와 원시 피질판(primitive cortical plate)을 나타내는 동결 절편 오가노이드의 면역형광 이미지입니다. VZ는 정단측(apical side)에서 기저측(basal side)까지 이어집니다.VZ 내의 세포들이 울타리 모양의 핵을 보이며, 이는 이들이 방사형 글리아 세포임을 시사한다는 점에 유의하십시오. 오른쪽 패널은 VZ 내의 nestin 양성 NPC와 원시 피질판의 TUJ1 양성 뉴런의 면역형광 염색 결과를 보여줍니다. 여기에는 PVIM 및 ARL 13B로 염색된 VZ의 두 가지 예시가 제시되어 있습니다.흰색 사각형으로 표시된 영역을 확대한 모습입니다. VZ의 정단측에서 분열하는 정단 방사형 글리아 세포는 PVIM 양성입니다. 후기 세포의 분열면은 ARL 13B 염색으로 표시된 루멘 표면선과 수평을 이룹니다.이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 23일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 배양물에 대해 주기적인 품질 점검과 마이크로플라즈마 점검을 수행하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발 이후, 신경생물학 발달 분야의 연구자들은 인간 뇌 오가노이드에서의 신경 발달 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 세포 기능이 저하된 환자 세포주를 포함하여 다양한 iPSC 세포주로부터 인간 뇌 오가노이드를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포에서 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 신경권이 어떻게 다른 세균층의 형성을 억제하는 신경외배엽층을 형성하는지 보여줍니다. 신경구는 3D 젤 매트릭스에 내장되어 신경 상피 새싹을 형성합니다. 오가노이드 배지로 배양하면 이러한 신경 상피 새싹은 특정 뇌 영역으로 분화되어 성숙한 뇌 오가노이드를 형성합니다.

인간 뇌 오가노이드를 생성하는 체외 방법

이 동영상은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 분석을 보여줍니다. 인간 iPSC는 배아체(EB)를 형성하도록 유도됩니다. EB는 유도 배지를 사용하여 고분자 골격 위에서 배양되어 신경 줄기 세포, 전구 세포 및 미성숙 뉴런으로의 분화를 촉진합니다. 마지막으로, EB는 매트릭스에 삽입되어 대뇌 오가노이드 형성을 위한 유지 배지로 전달됩니다.

유도 만능 줄기 세포 유래 대뇌 오가노이드 생성

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

이 연구에서, 우리는 표준 피더가없는 hPSC 배양물을 사용하여 간단하면서도 견고한 피질 오가노이드 배양 시스템에 대한 상세한 기술을 제공합니다. 이것은 시험관 내에서 뇌 노화의 측면을 모델링하는 오가노이드를 생성하기위한 신속하고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜입니다.

체외에서 뇌 신경 노화를 모델링하기위한 피질 뇌 오가노이드의 강력하고 재현 가능한 생성

우리는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 조혈전구세포(HPC)를 오가노이드 개발에 통합하여 상주 미세아교세포를 가진 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

배우세요 iPSC 유래 인간 뇌 오가노이드 생성 방법을 통해 초기 신경 발달 장애를 모델링하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 미세두증 연구에 활용될 수 있습니다.

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