IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

iPSC 유래 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 이 프로토콜의 전반적인 목표는 초기 인간 신경 발달 장애를 모델링하는 것입니다. 이 방법은 새로운 신경 발생 및 일차성 소두증에서 신테좀(synthesomes)과 섬모(cilia)의 역할과 같이 인간 뇌 발달 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 환자의 iPSC 유래 뇌 오가노이드로부터 재현 가능한 결과를 얻을 수 있는 견고하고 신속한 모델이라는 점입니다.

이 절차의 시연은 쾰른 분자 의학 센터 내 본인 연구실의 박사 후 연구원인 Elke Gabriel이 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 멸균 가위로 미리 자른 2 mm 팁과 200 µL 마이크로파이펫을 사용하여 뉴로스피어를 수집하십시오. 그다음, 100 mL 디쉬 내의 파라핀 필름 위에 뉴로스피어들을 약 5 mL 간격으로 배치하십시오.

남아 있는 배지를 최대한 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음, 각각의 단일 뉴로스피어 위에 EHS matrix를 한 방울씩 떨어뜨립니다. EHS matrix 방울과 뉴로스피어를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.

그 후, 뉴로스피어 배지로 씻어내어 파라핀 필름으로부터 뉴로스피어를 조심스럽게 세척합니다. 이어서 뉴로스피어를 향후 4일 동안 배양하며, 2일 차에 2 mL의 신선한 뉴로스피어 배지를 추가합니다. 이 과정에서, 각 스피너 플라스크의 사이드 암을 통해 브레인 오가노이드 배지 100 mL를 첨가합니다.

배지를 37 °C 인큐베이터에서 최소 20분 동안 미리 데워둡니다. 그런 다음, 뉴로스피어(neurosphere)들이 모두 분리되어 있는지 확인합니다. 둘 이상의 뉴로스피어가 EHS matrix로 연결되어 있다면, 메스로 연결된 매트릭스를 절단하여 분리합니다.

교반 프로그램을 25 RPM으로 설정합니다. EHS 매트릭스가 포함된 신경구(neurospheres)를 100 milliliters의 오가노이드 배지가 담긴 스피너 플라스크로 조심스럽게 옮깁니다. 그 후, 스피너 플라스크를 인큐베이터 내의 자성 교반 플랫폼 위에 배치하고 37 degrees celsius에서 14일 동안 배양합니다.

오늘은 오가노이드 배양의 0일 차입니다. 일주일에 한 번, 배지의 절반을 제거하고 동일한 양의 신선한 배지를 추가하여 배지를 교체하십시오. 이 단계에서는 미리 절단된 1 mL 마이크로 피펫을 사용하여 배양 14일 차에 스피너 플라스크 배양액에서 오가노이드를 수집합니다.

이들 모두를 60 mm 디시에 넣고 5 mL의 따뜻한 DMEM F12로 3분 동안 한 번 세척합니다. 그 후, 500 µL의 따뜻한 4% PFA가 담긴 1.5 mL 튜브를 준비합니다. 각 오가노이드를 각각의 튜브에 따로 넣고 실온에서 30-60분 동안 고정합니다.

그 후, 접종 루프를 사용하여 오가노이드를 제거합니다. 그런 다음 PFA를 제거하고, 고정된 오가노이드를 1 mL의 PBS로 10분씩 2회 세척합니다. 이어서, 오가노이드를 1 mL의 PBS에 담아 4 °C에서 최대 7일 동안 보관하여 추후 사용합니다.

동결 절편 제작을 위해 오가노이드를 임베딩하려면, PBS를 제거하고 각 튜브에 30% sucrose 용액 1 milliliter를 첨가하여 동결 전 오가노이드를 탈수시킵니다. sucrose 용액을 첨가한 후 오가노이드는 표면에 떠 있어야 합니다. 오가노이드를 sucrose 용액에 담가 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.

다음 날이면 오가노이드가 튜브 바닥으로 가라앉아 있어야 합니다. 그 후, 비닐 표본 몰드에 OCT 화합물 400 milliliters를 채웁니다. 그리고 접종 루프를 사용하여 몰드의 중심에 오가노이드를 배치합니다.

몰드의 가장자리에 샘플 이름을 표시하십시오. 그 후, 오가노이드가 포함된 몰드를 -80 °C에서 냉동 절편 제작 시까지 보관하십시오. 이어서, 유리 냉동 슬라이드를 0.1% PLL과 PBS로 코팅하여 상온에서 5분 동안 유지하십시오.

그 다음, 슬라이드를 3시간 동안 건조시킵니다. 슬라이드를 4 °C에서 보관하고, 사용 전 실온으로 가온합니다. 이후, PLL이 코팅된 유리 냉동 슬라이드 위에 냉동 보존된 오가노이드를 20~50 µm 두께의 절편으로 제작합니다.

절편을 상온에서 1시간 동안 건조시킨 후, 추가 공정을 진행할 때까지 -80°C에서 보관하십시오. 전형적인 VZ와 원시 피질판(primitive cortical plate)을 나타내는 동결 절편 오가노이드의 면역형광 이미지입니다. VZ는 정단측(apical side)에서 기저측(basal side)까지 이어집니다.

VZ 내의 세포들이 울타리 모양의 핵을 보이며, 이는 이들이 방사형 글리아 세포임을 시사한다는 점에 유의하십시오. 오른쪽 패널은 VZ 내의 nestin 양성 NPC와 원시 피질판의 TUJ1 양성 뉴런의 면역형광 염색 결과를 보여줍니다. 여기에는 PVIM 및 ARL 13B로 염색된 VZ의 두 가지 예시가 제시되어 있습니다.

흰색 사각형으로 표시된 영역을 확대한 모습입니다. VZ의 정단측에서 분열하는 정단 방사형 글리아 세포는 PVIM 양성입니다. 후기 세포의 분열면은 ARL 13B 염색으로 표시된 루멘 표면선과 수평을 이룹니다.

이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 23일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 배양물에 대해 주기적인 품질 점검과 마이크로플라즈마 점검을 수행하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발 이후, 신경생물학 발달 분야의 연구자들은 인간 뇌 오가노이드에서의 신경 발달 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 세포 기능이 저하된 환자 세포주를 포함하여 다양한 iPSC 세포주로부터 인간 뇌 오가노이드를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.