Name: 전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 배우세요 전기 자극을 이용한 3D 바이오와이어 배양법으로 인간 줄기세포 유래 심근세포를 성숙시키는 방법입니다. 이 기술은 심장 조직 공학 및 신약 개발 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 보조금의 원조 심장에서 지원되었다 스트로크 캐나다 (G-14-0006265)의 재단, 건강 연구 (137352 및 143066), 그리고 JP 비켈 보조금의 캐나다 연구소에서 운영 보조금 (1013821 ) SSN합니다.

1. 마스터 디자인 및 제작 참고 : 장치 제조를위한 소프트 리소그래피를 사용합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 성형 용 이층 SU-8을 마스터. <ol><li> 장치 (왼쪽 그림 1A) 디자인을 사용하고 제도 소프트웨어를 디자인합니다. 별도로 마스터의 각 층을 그린다. 마스터 (15)의 두 개의 층에 대응하는, dpi로 20,000 개의 포토 마스크에서 디바이스 디자인 인쇄. 투명 같은 디바이스 패턴과 같은 어두운 주변 영역을 설정; 마스크는 (다른 사람 (15)에 의해 기술 된 바와 같이) 광 리소그래피에 의해 SU-8에 디바이스 패턴을 전사하는 템플릿으로서 역할을한다. </li><li> 4 인치 실리콘 웨이퍼의 중심에 SU-8 (50)의 약 4 mL로 분배. 코트 SU-8 (50) 30 초 동안 균등 분 (RPM) 2,000 rpm의 속도로 회전하는 스핀 코터를 사용하여 웨이퍼상의. 10 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼 굽는다. 자외선 (UV)에 리튬 웨이퍼 폭로200에서 엠제이 GHT / cm 2. </li><li> 30 초 동안 2,500 RPM으로 상기 웨이퍼 및 회전 중심 상에 SU-8 2050 약 4 mL를 부어. 15 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트상에서 구워. 실온 (RT) 쿨. </li><li> 단계를 반복 1.3 두 번 더. </li><li> 제 1 층의 투명 마스크로 코팅 된 웨이퍼를 커버. 제 층을 만들기 위해 270 mJ의 / cm 2의 UV 광에 웨이퍼를 노출. 15 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트상에서 구워. </li><li> 두 번 단계 1.3를 반복하여 SU-8 2050의 두 번째 레이어를 확인합니다. </li><li> 노광 마스크를 이용하여 제 층에있는 기능을 2 층째 마스크 정렬. 그 후, 240 mJ의 / cm2로 UV 광에 노출. 15 분 동안 95 ℃에서 구워. 주 : 노광 시간이 필요한 총 UV 조사량 사용하기 전에 날에 측정 된 UV 광 출력 세기에 의해 결정된다. </li><li> 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)에 침수 및 오비탈 진탕 기에서 30 분 동안 200 RPM으로 진탕하여 웨이퍼를 개발한다. </li><li> 장소웨이퍼의 중심 :주의 배양 접시에 마스터는 (1 내지 10 중량의 비율 가교제 염기)를 PDMS 액을 붓는다. 모든 기능을 커버 및 공기 방울을 피하십시오. </li><li> 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 가열한다. PDMS의의 biowire 템플릿의 가장자리 (오른쪽 그림 1A) 주위를 잘라 날카로운 칼날을 사용합니다. 마스터에서 PDMS를 껍질입니다. 블레이드와 트리밍 장치. 20 분 동안 121 ℃에서 멸균 봉지 증기 오토 클레이브에서의 PDMS biowire 템플릿을 넣어. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에서, 페트리 접시에 템플릿 biowire PDMS의 배치합니다. 채 채널 (그림 1B-I)의 양쪽에있는 홈에 착석하여 PDMS의 마이크로 웰의 채널의 중앙에 무균 수술 실크 봉합사 (6-0)의 조각을 탑재 핀셋을 사용합니다. </li></ol> 전기 자극 상공 회의소 2. 창조 <ol><li> 2cm의 X : 폴리 직사각형 조각 (세로 × 가로 × 두께 쌍을0.85 cm X 0.35 cm)와 전기 자극 챔버의 구조로 사용 (도 2). </li><li> 각각의 폴리 카보네이트 구조 부재의 중심선을 따라 2cm 떨어진 두 3mm 와이드 구멍을 뚫는다. </li><li> 1.5 cm 길이 탄소봉 두 조각을 잘라. 끝에서 약 3mm 탄소봉으로 1mm의 폭 구멍을 뚫는다. 카본로드 관통 구멍 백금선 스레드 및 탄소 막대 주위를 감싸는 와이어를 조인다. 전기 자극기와 나중에 연결하기위한 백금 와이어의 타단에 클립을 첨부. </li><li> 폴리 카보네이트 프레임 부분에 카본 봉을 삽입한다. 여섯 웰 플레이트의 웰에 탄소봉으로 조립 된 프레임을 놓는다. </li><li> 웰에 PDMS 2 용액을 붓는다. 가까운 PDMS 표면 레벨을 유지하지만, 탄소봉의 저부에 도달하지 동안 PDMS에 폴리 카보네이트 프레임의 바닥을 담근다. 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 가열한다. </li><li> 여섯에서 전기 자극 챔버를 타고웰로 20 분 동안 121 ℃에서 증기 멸균 멸균 봉지에 넣고. </li></ol> hPSC-의 CM 3. 효소 해리 <ol><li> 확립 된 프로토콜을 사용하여 4 심근 세포로 분화를 유도하는 hPSC. 주 : 간단히 확립 배아 체를 통해 심근 세포를 생성 (EB) 프로토콜 뼈 형태 형성 단백질 (4), 염기성 섬유 아세포 성장 인자, 액 티빈 A, 혈관 내피 성장 인자 및 Dickkopf 상동 1~4와 순차 보급 통해 줄기 프로 매체이다. biowires를 만들기 위해 차별화의 하루 20-34에서 사채를 사용합니다. </li><li> P1,000 피펫 팁과 저 부착 판의 EB를 모아서 원추형 튜브에 옮긴다. 125 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠렛. 하여 펠렛을 상층 액을 제거하고 재현 탁 미리 가온 (37) I 1 %의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제를 함유하는 콜라게나 ° C 타입 I (DNase를 I). 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션소화. </li><li> 예열, 37 ° C 5 mL를 넣고 125 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리하고 배지를 세척한다. 상층 액을 버린다. 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 2 mL를 펠렛을 재현 탁하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 3 %를 함유 정지 배지 1 mL를 넣고 (V / V)의 DNase의 I. </li><li> 3-5 회 5 ml 주사기에 20 G (0.9 mm) 바늘을 부착하고이를 통해 EB 현탁액을 통과한다. </li><li> 5 분 동안 280 XG에서 세탁 매체 원심 7 mL를 넣고. 상층 액을 버린다. Iscove의 수정 둘 베코의 매체 (IMDM)에서 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 저장합니다. 혈구와 휴대폰 번호를 확인합니다. 5 분 동안 280 XG에서 원심 분리하여 0.5 × 106 세포 펠렛을보십시오. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 멸균 튜브를 혼합하기 전에 얼음에 사전 멋진 모든 젤 구성 요소. 다음 콜라겐 겔 성분 (최종 농도)을 믹스 : 2.1 ㎎ / ㎖ 래트 꼬리 콜라겐 타입 I, 24.9 mM의 글루코오스 23.8 mM의 NaH를CO 3 14.3 mM의 NaOH를 10 mM의 HEPES 및 1X M199 배지에서 10 % 세포 외 기질. 콜라겐과 마지막 세포 외 기질을 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 콜라겐 겔 3.5 μL와 0.5 × 106 세포를 재현 탁하고 잘 혼합한다. </li><li> 0.5 cm 길이의 채널 (도 1B-II)로 세포 현탁액 4 μL를 추가하는 P10 피펫 팁을 사용한다. 멸균 된 핀셋 필요하다면 봉합사의 위치를 ​​조정한다. </li><li> 확인 젤을 건드리지 않도록주의하면서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 페트리 접시의 바닥을 커버. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 세포 (그림 1B-III)를 커버하기에 충분한 배지 12 mL를 (예를 들어, 프로 또는 중간 셀 제조업체에서 권장하는 줄기)와 PBS를 교체합니다. 일주 37 ° C에서 인큐베이터에서 문화. 매일 매체를 변경합니다. </li></ol> Biowire 재배 4. 전기 자극 <ol><li> 에서BSC는, 전기 자극기 챔버를 수용하는 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 PBS 2 mL를 넣고. 부드럽게 잘으로 멸균 전기 자극 장치를 배치 멸균 핀셋을 사용합니다. 우물에서 PBS를 폐기하십시오. </li><li> 예열 배지 5 ㎖과 탄소봉 커버. 전기 자극 챔버 내의 biowires 마운트 무균 핀셋을 사용하여 상기 탄소봉 (도 2)에 수직 한 방향들을. </li><li> 6 웰 플레이트의 상부에 뚜껑을 배치하지만, 전기 자극기와 연결 플레이트 외부 도달 충분한 백금 와이어를 떠난다. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 배치하고, 전기 자극에 백금 와이어를 연결한다. </li><li> 이상성 반복 펄스, 1-MS 펄스 듀레이션, 3 V / cm, 초당 1 펄스 (PPS) 전기 다음 설정으로 자극기를 사용 biowires을 자극한다. 다음 값으로 PPS를 24 시간마다 상향 : 1.83, 2.66, 3.49, 40.82, 5.15 및 6 변경 매체 매일. </li><li> 10 배 배율에서 현미경으로 전기 자극에 대한 응답으로 심근 수축력을 준수하십시오. 참고 : 자극 일주일의 biowires이 성숙하게되면 (결과 섹션 참조). </li></ol>

<ol><li>Sun, X., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+hydrogel-based+strategies+for+application+in+cardiac+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration.</a> Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).</li>
<li>Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+strategies+of+engineered+tissues+and+their+application+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration.</a> Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).</li>
<li>Hastings, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+cell+delivery+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug and cell delivery for cardiac regeneration.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 84 (0), 85-106 (2015).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR%2B+embryonic-stem-cell-derived+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Snir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+ultrastructural+and+proliferative+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).</li>
<li>Dolnikov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+intracellular+Ca2%2B+handling+and+the+role+of+sarcoplasmic+reticulum+in+the+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction.</a> Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3A+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+a+differentiated+cardiac+muscle+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct.</a> Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assembly+of+engineered+myocardium+by+electrical+stimulation+of+cardiac+myocytes+cultured+on+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).</li>
<li>Schaaf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+engineered+heart+tissue+as+a+versatile+tool+in+basic+research+and+preclinical+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology.</a> PLoS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+engineered+human+myocardium+with+mechanical+loading+and+vascular+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture.</a> Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).</li>
<li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biowire%3A+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li>
<li>Lake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/4049">Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li>
<li>Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+applications+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Cardiac applications for human pluripotent stem cells.</a> Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).</li>
<li>Radisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+correlate+with+cell+density+and+cell+viability+in+engineered+cardiac+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue.</a> Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 원고는 hPSC-CM의 성숙을 향상시키기위한 엔지니어링 플랫폼 인 biowire의 설정과 구현을 설명합니다. 이 장치는 표준 미세 제조 시설에서 만들 수 있으며, 바이오 와이어는 일반적인 세포 배양 기술과 전기 자극기로 생산할 수 있습니다. 우리가 알기로는, 바이오 와이어와 비슷한 방법은보고 된 바 없다. 이 전략은 개선 된 성숙 특성이보다 높은 자극 속도 상승 요법 (6Hz 대 3Hz)을받은 바이 와이어에서 얻어진 성숙도가 높다는 것을 입증하는 것과 같이 전기 자극 요법에 의존한다는 것을 보여준다. biowires의 심근 세포는 20 일 (EBd20) 또는 40-44 일 (EBd44) 동안 재배 EBs에 비해 적은 자동 성과 높은 hERG 전류와 I K1 을 보여 주었다. EBd20 심근 세포는 biowires에 통합되기 전에 세포의 성질을 나타내는 반면, EBd44 심근 세포는 10 일 동안 배양되었다.onger에도 EB 형식 배양 ...

세포 기반 치료는 심장 수리 / 재생을 달성하기 위해 가장 유망한 및 조사 전략 중 하나입니다. 그것은 심장 조직 공학 및 생체 재료 1, 2의 공동 배달의 도움되었습니다. 대부분의 가능한 셀 소스 손상, 질병, 또는 세 마음 3에 잠재적으로 유익한 효과에 대한 동물 모델에서 연구되고있다. 특히, 상당한 노력이 인간 만능 줄기 세포를 사용되었습니다 (hPSC)은 심근 세포 (hPSC-CM), 심장 조직 공학에 대한 잠재적으로 무제한자가 세포 소스 - 유래. hPSC-CMS는 몇몇 확립 된 프로토콜 4, 5, 6을 사용하여 제조 될 수있다. 그러나, 수득 된 세포는 성체 심실의 심근 대비 7 미성숙 특성의 범위와 태아의 형상 표현형을 표시 </sup&gt; 8. 이는 신약 개발 연구에 성인 심장 질환 모델 (9)의 개발에 성인 심장 조직의 모델로 hPSC-의 CM 응용 프로그램에 장애물이 될 수 있습니다. 표현형 미숙의 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 접근 방식을 적극적으로 심근의 성숙을 촉진하기 위해 조사되었다. 초기 연구는 순환 기계 (10) 또는 전기 자극 (11)을 통해 신생아 래트 심근 세포의 효과적인 친 성숙 특성을 밝혀. 젤 압축 및 고리 기계적 자극은 또한 전기 생리 칼슘 취급 특성의 향상과 최소 hPSC-CM 성숙 (12, 13)의 일부 측면을 개선하는 것으로 나타났다. 따라서, &quot;생물학적 와이어&quot;(biowire)라는 플랫폼 시스템은 큐 구조와 전계 stimulatio 모두를 제공하여 고안된N은 hPSC의 CM-14의 성숙을 증진한다. 이 시스템은 전기장 자극 의무가 정렬 된 심장 조직을 만들기 위해 미세 플랫폼을 사용한다. 이것은 hPSC-CM이의 구조 및 전기 생리학적인 성숙을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 biowires을의 세부 사항을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>L-아스코르브산</td><td>시그마</td><td>A-4544</td><td>hPSC-CM 배양 매체</td></tr><tr><td>구성 요소 AutoCAD</td><td>Autodesk, Inc</td><td></td><td>장치</td></tr><tr><td>설계 소프트웨어 탄소 막대, &Oslash; 3mm</td><td></td><td></td><td>전기 자극기 챔버 구성 요소</td></tr><tr><td>콜라겐, 유형 1, 쥐 꼬리</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>콜라겐 겔: 10%의 성장 인자 감소 Matrigel이 포함된 1x M199 배지에서 24.9mM 포도당, 23.8mM NaHCO3, 14.3mM NaOH, 10mM HEPES에서 쥐꼬리 콜라겐 I형 2.1mg/mL.</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>Ca2+ 및 Mg2+와 함께 PBS에서 0.2% 콜라겐분해효소 I형(w/v) 및 20% FBS(v/v). 0.22 &mu로 살균하십시오. m을 여과하고 12mL 부분 표본을 만듭니다. -20 &deg;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNase I)</td><td>EMD Millipore</td><td>260913-25MU</td><td>1 mg/mL DNase I 저장 용액을 물에 담가둡니다. 멸균 여과 및 0.5mL 부분 표본 보관 &-inus; 20 > C</td></tr><tr><td>드릴 & 드릴 비트 (&Oslash; 1mm 및 2mm)</td><td>Dremel</td><td></td><td>폴리 카보네이트 프레임의 드릴 구멍</td></tr><tr><td>전기 자극기</td><td>잔디</td><td>s88x</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도당&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>콜라겐 젤 구성</td></tr><tr><td>요소 L-글루타민</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>MilliQ</td><td></td><td>18.2 M&Omega; &미드닷; cm 25 &deg; C, 초순수, 모든 용액을 만들기 위해</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>콜라겐 젤 구성</td></tr><tr><td>요소 핫 플레이트</td><td>Torrey Pines</td><td>HS40</td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 Modified Dulbecco's Medium(IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>EVG&nbsp;</td><td>EVG 620</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, 성장 인자 감소&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>콜라겐 겔 성분</td></tr><tr><td>Medium 199 (M199)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11825015</td><td>콜라겐 겔 성분</td></tr><tr><td>모노티오글리세롤(MTG)</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td>hPSC-CM 배양 배지 구성</td></tr> 요소 <tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(P/S)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ 및 Mg2+&nbsp를 함유한 인산염 완충 식염수(PBS);</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>플레이트(6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>플레이트(6-well), 낮은 부착성</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Platinum wires, 0.2 mm</td><td></td><td></td><td>전기 자극기 챔버 구성 요소</td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)</td><td>Doe & 잉걸스 Inc.</td><td></td><td>웨이퍼 파우치 개발을 위해</td></tr><tr><td>Peel-open</td><td>Convertors</td><td>92308</td><td>스팀 살균</td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼, 4 inch</td><td>UniversityWafer Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>콜라겐 겔 성분</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>콜라겐 겔 성분</td></tr><tr><td>Sprin coater</td><td>특수 코팅 시스템</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34 배양 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639011</td><td>hPSC-CM 배양 배지. 50 mL를 만들기 위해, 1.3 mL 보충 교재, 500 &mu를 추가하십시오; 100&times의 L; L-글루타민, 250 &mu; 30 mg/mL 트랜스페린의 L, 500 &mu; 5 mg/mL 아스코르브산의 l, 150 &mu; L of 26 &mu; l /2 mL 모노티오글리세롤(MTG) 및 500 &mu; L (1 %) 페니실린 / 스트렙토 마이신.</td></tr><tr><td>매체</td><td></td><td></td><td>세척 매체 중지 : FBS (1 : 1)</td></tr> <tr><td>SU-8 50&nbsp;</td><td>마이크로켐 주식회사</td><td></td><td>포토레지스트, 마스터 컴포넌트</td></tr><tr><td>SU-8 2050&nbsp;</td><td>마이크로켐 주식회사</td><td></td><td>포토레지스트, 마스터 구성 요소</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202</td><td>hPSC-CM 배양 배지 구성</td></tr> 요소 <tr><td>트립신/EDTA, 0.25%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>hPSC-CM 배양 배지 구성</td></tr> 요소 <tr><td>1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유</td>한<td>세척 배지</td><td></td><td></td> IMDM</tr></tbody></table>

전기 자극을 사용하여 biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

인간 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMS)은 유망한 셀 원천이되어있다, 따라서 약물 발견, 질병 모델링, 조직 공학 및 재생 의학을 포함한 심장 연구에서의 응용 가능성의 조사를 격려했다. 그러나, 기존의 프로토콜에 의해 생산 세포는 네이티브 성인 심실의 심근에 비해 미성숙의 범위를 표시합니다. 많은 노력은 지금까지 달성 완만 한 성숙으로, hPSC-CM이 성숙되었습니다. 따라서 biowire라는 설계 시스템은, 시험 관내에서 성숙 상태 hPSC-CMS에 이끌 물리적 및 전기적 신호를 모두 제공하여 고안되었다. 시스템 I은 점진적으로 증가하는 주파수 전기장 자극을 받는다 정렬 심장 조직 (biowire)에 조립 강성 템플릿 봉합사 따라 겔화 콜라겐 타입 hPSC-CMS에 시드하는 미세 플랫폼을 사용한다. nonstimulated 컨트롤에 비해,biowired 심근 구조적 및 전기 생리 학적 성숙의 강화 정도를 나타내는 자극. 이러한 변화는 자극의 속도에 따라 달라집니다. 이 원고는 구체적으로 biowires의 설계 및 제작에 대해 설명합니다.

biowires의 봉합사를 사용하는 이성 한 축에 정렬하고 심장 섬유의 형상을 모방하는 3 차원 구조물의 형성을위한 템플릿으로서 역할을한다. 우리는 biowire 문화의 7 일 후에, 세포가 봉합 (그림 3A)의 주위에 젤을 개조 한 것으로 나타났습니다. 봉합사의 축을 따라 어셈블 세포는 심장 조직 (도 3)를 배열 형성한다. 예비 배양 7 일 후, 7 biowires 전기장 자극 일 심근의 구조적 및 기능적 성숙 호환 상기 전시 특성을 실시 하였다. biowires에서 PSC-CM이 인간 심장 수축성 단백질의 강한 발현 sarcomeric α-티닌 및 액틴 (도 4a)을 나타내었다. 우리는 myofibrilar 협착 hPSC-CM 수축성 장치 및 배향 sarcomeri...

심장 biowire 플랫폼은 전기 자극 3 차원 세포 배양을 조합하여 인간 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hPSC-CM)를 숙성에 사용되는 시험 관내 방법. 이 원고는 심장 biowire 플랫폼의 자세한 설정을 제공합니다.

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

본 절차의 전반적인 목표는 전기 자극을 이용한 제어된 3차원 세포 배양 방법을 활용하여 인간 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포의 성숙을 촉진하는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 전기 자극 파라미터나 자극 시간이 심장 세포의 기능 및 성숙 상태에 어떠한 영향을 미치는지 등 심장 조직 공학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 최종 결과물은 성숙도가 향상된 공학적 인간 심장 조직입니다.이 기술의 영향은 새로운 약물의 안전성과 효능을 테스트하는 것과 같은 진단 응용 분야까지 확장되는데, 이는 전기적 전도와 같은 성숙한 특성을 가진 심근세포가 약물 스크리닝 연구에서 인간 심장 세포의 더 정확한 모델 역할을 할 가능성이 높기 때문입니다. PDMS 단량체와 경화제를 10:1 비율로 혼합하고 잘 섞습니다. 가스를 제거하기 위해 5분 동안 그대로 둡니다.그 다음 biowire 템플릿의 마스터가 들어 있는 페트리 접시에 PDMS 혼합물을 붓습니다. 이때 기포 형성을 최소화하십시오. 다음으로 PDMS를 70 °C에서 2시간 동안 경화시킵니다.그 다음 가장자리를 따라 날카로운 칼날을 사용하여 굳은 몰드를 분리한 뒤 떼어내어 회수합니다. 이어서 과도한 PDMS를 다듬고 모든 템플릿을 멸균 파우치에 모읍니다. 템플릿을 121 °C에서 20분 동안 고압 증기 멸균기로 멸균합니다.그 다음, 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내의 환기 상태에서 각 템플릿을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 이제 각 템플릿의 전체 채널을 가로지르는 홈에 핀셋을 사용하여 멸균된 6.0 실크 봉합사 조각을 장착합니다. 이제 템플릿은 세포 시딩(cell seeding)을 위한 준비가 완료되었습니다.봉합사는 심장 섬유의 모양을 모방하여 봉합사 축을 따라 정렬되는 3D 구조체 형성의 템플릿 역할을 하게 됩니다. 각 챔버에 대해, 전기 자극 챔버의 프레임 역할을 할 한 쌍의 직사각형 폴리카보네이트 조각을 제작하십시오. 각 조각의 중심선을 따라 2cm 간격으로 지름 3mm의 구멍 두 개를 뚫으십시오.각 챔버당 1.5 cm 길이의 탄소 막대 두 개를 준비합니다. 각 막대의 끝에서 약 3 mm 떨어진 지점에 1 mm 너비의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 각 구멍에 백금선을 끼우고, 선의 한쪽 끝을 막대에 감아 고정합니다.다음으로, 각 챔버에 두 개의 폴리카보네이트 조각 사이에 두 개의 로드를 삽입하여 프레임을 만듭니다. 그런 다음 6-웰 플레이트의 웰에 PDMS 약 2 mL를 붓고, 프레임의 바닥이 잠기도록 PDMS가 담긴 웰에 프레임을 넣습니다. PDMS가 프레임을 고정할 수 있도록 70 °C에서 2시간 동안 PDMS를 경화시킵니다.그 다음, PDMS가 부착된 플레이트에서 완성된 챔버를 제거합니다. 조립된 챔버의 기능을 테스트하려면 백금 와이어를 배터리에 연결하고 전압계를 사용하여 전극을 통해 전류가 흐르는지 확인합니다. 이제 기능이 확인된 챔버를 멸균 파우치에 옮기고, 121 °C에서 20분 동안 증기 멸균을 실시하여 세포 배양을 준비합니다.겔을 준비하려면 모든 겔 성분을 멸균 튜브에서 혼합하기 전에 얼음 위에서 예냉하십시오. collagen과 extra cellular matrix를 마지막에 첨가하고 피펫팅을 통해 성분들을 혼합하십시오. 세포의 경우 인간 다능성 줄기세포에서 분화된 cardiomyocytes를 준비하십시오.세포를 수집하고 각 바이오와이어(biowire) 준비물을 위해 50만 개의 세포를 포함하는 3.5 µL의 콜라겐 겔을 준비합니다. 이제 P10 피펫 팁을 사용하여 각 디시의 0.5 cm 길이 채널 템플릿에 약 4 µL의 현탁액을 주입합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 봉합사가 완전히 펴지도록 위치를 적절히 조정합니다.세포를 파종한 후, 일관된 결과를 얻기 위해 오토클레이브에 넣기 전 항상 겔-세포 혼합물을 재현탁하십시오. 채널에 로딩한 후, 겔에 닿지 않도록 주의하며 접시 바닥을 멸균된 PBS로 덮어주십시오. 이렇게 하면 중합 과정 동안 바이오와이어가 건조되는 것을 방지할 수 있습니다.바이오와이어를 37 °C에서 30분 동안 배양한 후, PBS를 세포가 잠길 정도의 충분한 배양액으로 교체합니다. 일반적으로 12 mL면 충분합니다. 그 다음, 이틀마다 배양액을 교체하며 일주일 동안 디쉬를 배양합니다.생물 안전 작업대 내에서 전기 자극 챔버가 들어갈 6-웰 플레이트의 각 웰에 PBS 2 mL를 첨가합니다. 그런 다음 멸균 핀셋을 사용하여 오토클레이브 장치를 웰 안에 조심스럽게 배치합니다. 배치가 완료되면 PBS를 제거하고, 탄소봉이 완전히 잠기도록 따뜻한 배지 5 mL로 교체합니다.세포를 24시간 동안 배양하기 전에, 심근세포가 전기 자극을 받아들여 수축 반응을 보이는지 확인하기 위해 전기 자극에 따른 심근세포의 수축력을 관찰합니다. 다음으로, 바이오와이어를 전기 자극 챔버에 넣고 채널이 탄소 막대에 수직이 되도록 방향을 맞춥니다. 백금 와이어를 플레이트 바깥으로 길게 뺀 후 플레이트를 덮어줍니다.와이어를 전기 자극기에 연결합니다. 자극기가 1 Hz의 빈도로 1 ms의 이상성 펄스를 cm당 3 V로 전달하도록 설정합니다. 그런 다음 전기 자극기가 연결된 준비물을 37 °C의 배양기로 옮깁니다.0일 차의 1 Hz부터 6일 차의 6 Hz까지 24시간마다 자극 속도를 점진적으로 높입니다. 이 배양 기간 일주일 동안에는 이틀에 한 번씩 배지를 교체합니다. 그리고 매일 심근세포의 수축력을 관찰합니다.biowire에서 7일간의 예비 배양 후, 세포들이 봉합사 주변의 겔을 재형성했습니다. 세포들은 봉합사의 축을 따라 정렬되어 정렬된 심장 조직을 형성했습니다. 세포들은 심장 수축 단백질을 발현했으며, 수축 장치에서 근절 띠(sarcomeric banding)가 나타났고 근원섬유는 봉합사의 축을 따라 정렬되었습니다.바이오와이어(biowire) 내의 세포는 배아체(embryoid bodies) 내의 세포보다 낮은 증식률을 보였다. 바이오와이어에서 배양된 심근세포에서는 칼슘 조절 능력이 유의미하게 향상되었다. 카페인 처리 시 근소포체(sacroplasmic reticulum)로부터 칼슘의 급격한 방출이 유도되었다.이러한 과도 현상은 자극된 세포에서만 발견되었습니다. 또한 칼슘 방출 진폭에 따라 자극 빈도가 유의미하게 더 높게 나타났습니다. 아울러, 바이오와이어(biowires)에서 배양된 심근세포는 배아체(embryoid bodies)에서 배양했을 때보다 hERG 및 내향 정류 전류 밀도가 향상되었으며, 이는 전기 자극에 의해 더욱 강화되었습니다.개선된 내향 정류 전류는 칼륨 내향 정류 채널 유전자인 KCN J2의 발현 증가와 일치했습니다. 자발적으로 박동하는 능력인 자동성은 대조군 biowire에 비해 배아체 유래 심근세포에서 유의하게 더 높았습니다. 대조군은 6 Hz 레지먼을 적용한 biowire 표본과 유사한 자동성을 보였습니다. 설정 방법에 익숙해지면 biowire 설치는 반나절 만에 완료할 수 있습니다.전기 자극 설정에는 몇 시간이 소요되며, 최종 결과는 2주 후에 얻을 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 서로 다른 세포주에서 분화되었거나 서로 다른 프로토콜로 분화된 심근세포는 성숙도와 순도가 약간 다를 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 사용 중인 세포에 맞춰 자극 속도와 같은 실험 파라미터를 최적화하는 과정이 필요할 수 있습니다.이 절차를 통해 세포 구성의 변화 및 돌연변이 심근세포의 활용을 포함한 다른 조건들을 최적화함으로써 다양한 추가 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

maturation-human-stem-cell-derived-cardiomyocytes-biowires-using

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

여기에서는 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 위한 강력하고 빠르며 확장 가능한 심근세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 이 대규모 방법을 사용하여 파생된 심근세포는 인간 심혈관 질환 모델링, 고처리량 약물 스크리닝 및 잠재적인 임상 응용 분야에서 효과적으로 사용할 수 있는 충분한 세포 수를 제공할 수 있습니다.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

인간의 다 능성 줄기 세포 (hPSC-CM)에서 유래 된 심근 세포의 전기 생리 학적 특성은 심장병 모델링 및 약물 반응 결정에 중요합니다. 이 프로토콜은 다중 전극 배열에서 hPSC-CM을 해리 및 플레이트하고 필드 전위를 측정하며 QT 및 RR 간격을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 선물이 심장 생리학을 모방 하는 전기 및 기계적 자극을 사용 하 여 셀 인구를 교육 하기 위한 프로토콜. 이 전기 자극 치료 세포의 cardiomyogenic 잠재력을 강화 하 고 더 세포 치료, 질병 모델링 및 의약품 심사를 위한 유망한 전략 이다.

셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

본 문서는 멀티웰 MEA 플레이트상에서 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 네트워크의 개발을 위한 프로토콜 세트를 함유하고 있으며, 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화한다. 높은 처리량 기록은 며칠 동안 반복적으로 동일한 셀 사이트에서 얻어진다.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

여기에서는 비디오 기반 현미경과 결합된 유연한 기판에 도금된 2D 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 단층을 사용하여 비침습적 심장 의료 기기 수축성 평가 방법을 시연합니다. 이 도구는 심장 전기 생리학 장치의 수축 특성에 대한 시험관 내 평가에 유용합니다.

2D 인간 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 수축성 조절 요법의 평가

여기서, 광학 기반 플랫폼을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 수축성 및 칼슘 측정을 수행하는 확립된 방법이 설명되어 있습니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 돌연변이의 효과와 다양한 자극에 대한 반응을 빠르고 재현 가능한 방식으로 연구할 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 칼슘 및 수축성 매개변수의 실시간 측정

용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.

폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

배우세요 전기 자극을 이용한 3D 바이오와이어 배양법으로 인간 줄기세포 유래 심근세포를 성숙시키는 방법입니다. 이 기술은 심장 조직 공학 및 신약 개발 연구에 활용됩니다.

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

더 많은 동영상 탐색