전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

이 절차의 전반적인 목표는 전기 자극에서 제어된 3차원 세포 배양 방법을 활용하여 인간 배아 및 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포의 성숙을 촉진하는 것입니다. 이 방법은 다양한 전기 자극 매개변수 또는 시간이 심장 세포 기능 및 성숙 상태에 미치는 영향을 포함하여 심장 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 최종 결과는 성숙도가 향상된 인간 심장 조직으로 설계되었습니다.

이 기술의 의미는 신약의 안전성 및 효능 테스트와 같은 진단 응용 분야로 확장되는데, 이는 전기적 진행과 같은 성숙한 특성을 가진 심근세포가 약물 스크리닝 연구에서 인간 심장 세포의 보다 정확한 모델 역할을 할 가능성이 가장 높기 때문입니다. PDMS 단량체와 경화제를 10:1 비율로 결합하고 잘 혼합합니다. 가스를 제거하기 위해 5분 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 바이오와이어 템플릿의 마스터가 들어 있는 페트리 접시에 PDMS 혼합물을 로드합니다. 기포 형성을 최소화하십시오. 다음으로 PDMS를 섭씨 70도에서 2시간 동안 경화시킵니다.

그런 다음 먼저 가장자리 주위에 날카로운 칼날을 사용한 다음 껍질을 벗겨내어 응고된 곰팡이를 복구합니다. 그런 다음 여분의 PDMS를 다듬고 모든 템플릿을 멸균 파우치에 수집합니다. 스팀 자동 클레이브는 섭씨 121도에서 20분 동안 템플릿을 사용합니다.

그런 다음 각 템플릿을 생물 안전 캐비닛의 환기 아래에 있는 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 이제 각 템플릿에 대해 핀셋을 사용하여 멸균 6.0 실크 봉합사 조각을 전체 채널에 걸친 홈에 장착합니다. 그러면 템플릿이 세포 시딩을 위한 준비가 됩니다.

봉합사는 심장 섬유의 모양을 모방하여 봉합사 축을 따라 정렬되는 3D 구조물의 형성을 위한 템플릿 역할을 합니다. 각 챔버에 대해 전기 자극 챔버의 프레임 역할을 할 한 쌍의 직사각형 폴리카보네이트 조각을 만듭니다. 각 조각의 중심선을 따라 2cm 간격으로 3mm 너비의 구멍 2개를 뚫습니다.

각 챔버에 대해 1.5cm 길이의 탄소 막대 2개를 준비합니다. 각 막대 끝에서 약 3mm 떨어진 곳에 1mm 너비의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 각 구멍을 백금 와이어로 끼우고 와이어의 한쪽 끝을 막대에 감습니다.

다음으로, 각 챔버에 대해 두 개의 폴리 카보네이트 조각 사이에 두 개의 막대를 삽입하여 프레임을 만듭니다. 그런 다음 약 2밀리리터의 PDMS를 6개의 웰 플레이트의 웰에 붓고 PDMS로 프레임을 웰에 배치하여 프레임 바닥을 잠깁니다. PDMS가 프레임을 고정할 수 있도록 섭씨 70도에서 2시간 동안 PDMS를 경화합니다.

그런 다음 PDMS가 부착된 플레이트에서 완성된 챔버를 제거합니다. 조립된 챔버의 기능을 테스트하려면 백금 와이어를 배터리에 연결하고 전압계를 사용하여 전기가 로드를 통해 전달되고 있는지 확인합니다. 이제 기능성 챔버를 멸균 파우치에 옮기고 섭씨 121도에서 20분 동안 증기 멸균을 사용하여 세포 배양을 준비합니다.

젤을 준비하려면 멸균 튜브에 혼합하기 전에 모든 젤 구성 요소를 얼음에서 예열하십시오. 콜라겐과 여분의 세포 기질을 마지막에 추가하고 피펫팅을 사용하여 성분을 혼합하십시오. 세포는 인간 만능 줄기 세포와 분화된 심근세포를 가지고 있기 때문입니다.

세포를 수집하고 각 바이오와이어 준비 공장에 대해 50만 개의 세포를 포함하는 3.5마이크로리터의 콜라겐 젤을 준비합니다. 이제 P10 피펫 팁을 사용하여 각 접시의 0.5cm 길이의 채널 템플릿에 약 4ml의 현탁액을 로드합니다. 필요에 따라 멸균 집게를 사용하여 봉합사의 위치를 조정하여 완전히 펴지도록 합니다.

세포를 파종한 후에는 일관된 결과를 얻기 위해 오토클레이브를 복용하기 전에 항상 겔 세포 혼합물을 재현탁해야 합니다. 채널을 로드한 후 젤을 만지지 않도록 접시 바닥을 멸균 PBS로 덮습니다. 이렇게 하면 중합 중에 바이오와이어가 탈수되지 않습니다.

바이오와이어를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후 PBS를 세포를 덮을 수 있는 충분한 배양 배지로 교체합니다.일반적으로 12밀리리터면 충분합니다. 그런 다음 일주일 동안 접시를 배양하고 격일로 배지를 교체하십시오.

생물 안전 캐비닛에서 전기 자극기 챔버를 수용하는 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터의 PBS를 추가합니다. 그런 다음 멸균 핀셋을 사용하여 오토클레이브 장치를 우물에 부드럽게 놓습니다. 제자리에 고정되면 PBS를 버리고 탄소 막대를 완전히 덮어야 하는 5ml의 따뜻한 매체로 교체합니다.

24시간 동안 세포를 배양하기 전에 전기 자극에 대한 반응으로 심근세포의 수축성을 관찰하여 세포가 전기 자극을 포착하고 수축으로 반응하는지 확인합니다. 다음으로, 바이오와이어를 전기 자극기 챔버에 넣고 채널을 탄소 막대에 수직으로 배치합니다. 백금 와이어를 플레이트에서 멀리 늘린 다음 플레이트를 덮습니다.

전선을 전기 자극기에 연결합니다. 1헤르츠와 센티미터당 3볼트에서 바이페이식 1밀리초 펄스를 전달하도록 자극기를 설정합니다. 그런 다음 전기 자극기의 제제를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮깁니다.

자극 속도를 24시간마다 0일차 1헤르츠에서 6일차 6헤르츠로 점진적으로 증가시킵니다. 이 문화 주간에는 격일로 매체를 바꾸십시오. 그리고 매일 심근세포의 수축성을 관찰합니다.

바이오와이어에서 7일간의 전배양 후 세포는 봉합사 주위의 겔을 다시 성형했습니다. 세포는 봉합사의 축을 따라 모여 정렬된 심장 조직을 형성했습니다. 발현된 심장 수축 단백질은 수축 기관에서 육종 밴딩을 보였으며 근섬유는 봉합사의 축을 따라 정렬되었습니다.

바이오와이어(biowire)에 있는 세포는 배아체(embryoid body)에 있는 세포보다 더 낮은 증식률을 보였다. 칼슘 취급은 바이오와이어에서 배양된 심근세포에서 크게 개선되었습니다. 카페인 치료는 천상소포체에서 칼슘의 갑작스러운 방출을 유도했습니다.

이러한 과도 현상은 자극된 세포에서만 발견되었습니다. 또한 칼슘 방출 진폭에 따라 자극 빈도가 유의하게 높았습니다. 또한, 바이오와이어에서 배양된 심근세포는 배아체에서의 배양에 비해 hERG 및 내부 정류기 전류 밀도가 개선되었으며, 이는 전기 자극에 의해 더욱 강화되었습니다.

개선된 내향 정류기 전류는 칼륨 내향 정류 채널 진, KCN J2의 발현 증가와 일치했습니다. 자발적으로 박동할 수 있는 능력인 자동성은 통제된 바이오와이어에 비해 배아체 유래 심근세포에서 훨씬 더 높았습니다. 대조군은 6 헤르츠 요법에 따른 바이오와이어 제제에 필적하는 자동성을 보여주었습니다. 일단 마스터하면 바이오와이어 설정을 반나절 만에 완료할 수 있습니다.

전기 자극을 설정하는 데는 몇 시간이 걸리며 최종 결과는 2주 안에 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 다른 세포주 또는 다른 프로토콜에 의해 분화된 심근세포는 성숙도와 순도가 약간 다를 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 세포에 대한 자극 속도와 같은 실험 매개변수를 최적화해야 할 수 있습니다.

이 절차에 따라 세포 구성의 변화 및 돌연변이 심근세포의 활용을 포함한 다른 조건을 최적화하여 많은 추가 질문에 답할 수 있습니다.