Name: 상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 7 s
Description: 배우세요 WEHI 164 세포를 이용한 항-TNF-α 단클론 항체의 상대적 효능 측정 방법을 통해 면역학 연구에서 중화 효율성을 비교 분석하는 기술을 익히세요.

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이 작품은 과학의 국가 위원회에 의해 지원 되었다 고 기술 (CONACYT), 멕시코 연구의 설계에 참여 하지 않고 페이 CONACYT 2015 220333를 부여 합니다.

1. 미디어와 솔루션의 준비 <ol><li>문화 매체를 준비: RPMI-1640 10 %FBS, pH 7.4.</li>
	<li>준비 분석 결과 문화 매체: RPMI-1640 페 놀 레드 하지 않고 있지만 1 %FBS, pH 7.4.</li>
	<li>세포 세척 솔루션 준비: DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션 0.02 %EDTA, pH 7.4.</li>
	<li>세포 분리 솔루션 준비: 1 mm EDTA 0.125 %trypsin.
	<ol><li>녹여 100 mL의 트립 신-EDTA와 메 마른 500 mL 플라스 크에 0.25% 솔루션.</li>
		<li>믹스 셀의 100 mL와 함께 솔루션을 세척 하 고 15 mL 무 균 튜브에 15 mL aliquots 분배. -70-80 ° C까지 사용 하 게.</li>
		<li>0.22 μ m 멤브레인 통해 이러한 솔루션을 필터링 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C 까지의 따뜻한.</li>
	</ol></li> <li>Apoptosis 유도 재고 솔루션 TNFα 솔루션 3.3 µ g/mL에서 준비.
	<ol><li>500 µ L의 기본 컨테이너와 완전 한 해체까지 믹스에 필터 살 균 물과 TNFα의 분해 20 µ g.</li>
		<li>15 mL 무 균 튜브에 전송 하 고이 관에 DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션의 5.5 mL를 추가 합니다. 와 동 믹서를 사용 하 여 부드럽게 혼합.</li>
		<li>약 70 µ L 부분으로 수입니다. 0.5 mL microtubes-80에서 저장소에 각 약 수를 분배 ° c.</li>
	</ol></li> <li>준비 apoptosis 유도 솔루션: 40 ng/mL에서 TNFα 솔루션.
	<li>10 분에 대 한 25 ˚C에서 물 욕조에 그것을 잠복기 apoptosis 유도 재고 솔루션의 약 수를 해 동</li> <ol>
		<li>15 mL 무 균 튜브에 분석 결과 문화 매체의 4.939 mL을 3.3 µ g/mL TNFα 솔루션의 61 µ L을 추가 하 여 40 ng/mL을 apoptosis 유도 재고 솔루션을 희석.</li>
		<li>10 소용돌이 믹서로 혼합 s;이 솔루션은 사용 하기 전에 갓 준비 해야 합니다.</li>
		<li>회 eneutralization 분석 결과에서 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C에 솔루션을 따뜻한.</li>
	</ol></li> <li>기판 솔루션 준비: caspase 3/7 저런 솔루션 7 , 8.
	<ol><li>녹여 caspase 버퍼 솔루션 (caspase 3/7 Glo 버퍼) 사용 하기 전에 12 h.</li>
		<li>Caspase 버퍼 솔루션 및 기판 (caspase 3/7 Glo 기판) 앉아 별도로 25 ± 5 ° C에서 혼합 전에 30 분 동안 하자.</li>
		<li>반전 하 여 기판 유리병 및 혼합 caspase 버퍼 솔루션의 10 mL 전송할.</li>
		<li>계속 25 ± 5 ° C, 사용까지 빛 보호. 
		참고:이 솔루션은 실 온에서 6 h에 대 한 안정적인.</li>
	</ol></li></ol> 2. 세포 Culturing 및 계산 <ol><li>셀 해빙 하 고 첫 번째 subculture.
	<ol><li>WEHI 164 셀 9 한 유리병-80 ˚C에 냉장고에서 제거 하 고 얼음 목욕에 그들을 전송.</li>
		<li>냉동된 세포는 완전히 해 동 때까지 미리 데워 진된 문화 매체의 1 mL와 함께 아래로 플라스틱.</li>
		<li>분배 15 mL 무 균 튜브에 미리 데워 진된 문화 매체의 9 mL.</li>
		<li>15 mL 무 균 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 반전 5 번 부드럽게 혼합.</li>
		<li>원심 125 x g 3 분 삭제에 세포 현 탁 액은 상쾌한 고 셀 펠 릿 세분화.</li>
		<li>튜브를 문화 매체의 5 mL을 추가합니다. 세포는 완전히 resuspended 때까지 혼합.</li>
		<li>셀 카운팅을 위한 500 µ L microtube 및 50 µ L 0.4 %trypan 파랑의 혼합 세포 현 탁 액의 50 µ L을 전송. 셀을 계산 하 고 10 6 셀/mL x 0.5를 조정 합니다. 아래 단계 2.2를 참조 하십시오.</li>
		<li>75 mL 세포 배양 플라스 크를 미리 데워 진된 문화 매체의 13 mL을 추가.</li>
		<li>단계 2.1.6 셀 문화 플라스 크에서 10 6 셀/mL x 0.5를 달성 하 고 37 ° C, 5% CO 2에서 밤새 품 어 충분 한 셀 서 스 펜 션 볼륨 분배.</li>
	</ol></li> <li>셀 세. 
	참고: 참조 참조 10.
	<ol><li>솔루션을 사용 하 여 단계의 2.1.6, 0.05 mL는 hemocytometer를 전송과 trypan 블루 제외를 사용 하 여 현미경으로 세포 밀도 결정.</li>
		<li>셀과 가능한 셀의 총 수를 계량.</li>
		<li>10 6 셀/mL x 0.5 셀 정지 조정. 
		방정식 1 
		V 문화 매체 (mL) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55376/55376eq1.jpg" /> V 문화 매체 (mL) = (5 mL-V 세포 현 탁 액) V 문화 매체 (mL) = 조정 된 양의 WEHI 164 현 탁 액 셀 NVC 가능한 WEHI 164 셀/mL의 수 = V 문화 매체 (mL) = 0.5 x 10 6 셀/mL를 달성 하기 위해 세포 현 탁 액에 추가 분석 결과 문화 매체 볼륨 0.5 x 10 6 = 대상 셀 밀도</li>
	</ol></li> <li>세포 분리 및 두 번째 및 세 번째 subculture. 
	참고:는 플라스 크에서 솔루션을 제거 하는 진공 시스템을 사용할 수 있습니다. 일회용 또는 유리 살 균 펫을 사용할 수 있습니다. 피펫으로 목화 덩어리 있으면 상단에, 그것은 사용 하기 전에 제거 해야 합니다.
	<ol><li>세포 배양 1 mL 균 피 펫 및 진공을 사용 하 여 T-플라스 크에서에서 문화 매체를 제거.</li>
		<li>셀 세척의 분배 5 mL 솔루션 T-플라스 크, 문화에 부드럽게, 혼합 하 고 솔루션을 삭제. 이 단계를 반복 하 여 두 번. 
		참고: 문화 매체의 완전 한 제거는 효율적인 전지 분리에 대 한 중요.</li>
		<li>T-플라스 크에 세포 분리 솔루션의 15 mL를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에서 3 분 서 보자.</li>
		<li>는 현미경 아래 플라스 크 내부 벽에 연결 된 셀의 부재를 확인합니다. 문화 20 mL의 멸 균 피 펫을 사용 하 여 T-플라스 크에서에서 셀을 제거 하 고 살 균 50 mL 튜브에 그들을 분배.</li>
		<li>원심 125 x g 3 분 삭제에 세포 현 탁 액은 상쾌한 고 문화 매체의 또 다른 5 mL와 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>셀을 계산 하 고 식 1에 따라 원하는 셀 농도 도달 충분 한 문화 매체를 추가.</li>
		<li>72 cm 2 T-플라스 크에이 정지를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO 2에서 밤새 품 어.</li>
		<li>Subculture 최소한 두 번 중립화에 그들을 사용 하기 전에 셀 시험. 다음 2 일에 대 한 단계 2.3.1-2.3.8 반복.</li>
	</ol></li> <li>세포 현 탁 액을 시험.
	적어도 3 개의 패스를 <ol><li>선택 WEHI 164 subculture 2.1 단계를 참조 하십시오.</li>
		<li>분리와 2.2와 2.3이이 프로토콜의 단계에 따라 셀.</li>
		<li>10 6 셀/mL x 0.5 식 1에 따라 세포 현 탁 액 희석.</li>
		<li>중화 분석 결과 대 한이 세포 현 탁 액을 사용합니다. 믹스와 동 믹서 사전 사용 하 여 모든 셀 정지.</li>
	</ol></li></ol> 3. 항 체 준비 및 희석 <ol><li>는 mAbs의 정량.
	그들의 대량 멸종의 계수 (1.39) 11를 사용 하 여 <ol><li>결정 참조 물질, 컨트롤 샘플 및 280에 UV 흡수를 통해 분석 샘플의 농도 nm. 
		참고: 원래 농도 약 제품 라벨에서 가져온 수 있습니다. 그러나,이 자외선 흡수 하 여 확인 해야 합니다.</li>
	</ol></li> <li>mAb 희석.
	DPBS 2 mL microtubes, 2 mg/mL까지 Mg 및 Ca 무료 솔루션 3 중에서 독립적으로 <ol><li>Dilute 모든 샘플. 빈으로 DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션을 사용 하 여 3 중에 UV 흡수이 농도 확인.</li>
		<li>5 재고 단백질 솔루션을 믹스와 동 믹서를 사용 하 여 s.</li>
		<li>분석 결과 문화 매체의 0.9 mL으로 각 2 mg/mL mAb 솔루션의 희석 100 µ L.</li>
		와 동 믹서에 의해 <li>믹스 5 s. 
		참고:이 솔루션 200 µ g/mL의 농도 있다. 각 3 중의 희석은 이루어져야 합니다.</li>
		<li>희석 10 & #181. L 각 200 µ g/mL mAb 솔루션의 분석 결과 문화 매체의 0.99 mL와 함께. 5에 대 한 믹스와 동 믹서를 사용 하 여 s. 이러한 솔루션 2 µ g/mL의 농도 있다. 각 3 중 직렬 희석 중화 분석 결과에서 그들을 사용 하기 전에 수행.</li>
		<li>는 MAb 희석 3 개의 독립적인 microplates에 안티 TNFα 확인합니다. 각 독립 3 중에서 중복을 확인 하 고 표 1에 표시 된 대로 한 microplate에 그들을 분배 한다. 물질 참조 < 테이블 fo:keep-together.within-페이지 "1" fo:keep =-와-next.within-페이지 "항상" fo:text =-정렬 = "센터" > <tbody><tr><td colspan="2"> 접시 1</td> <td colspan="2"> 접시 2</td>
					<td colspan="2"> 플레이트 3</td></tr>
				<tr><td>웰 스</td> <td>샘플</td> <td>웰 스</td> <td>샘플</td> <td>웰 스</td> <td>샘플</td></tr>
				<tr><td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> 참조 물질이</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> 컨트롤 샘플</td> <td>B2:B11</td> <td rowspan="2"> 분석 샘플</td></tr>
				<tr><td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td> <td>C2:C11</td></tr>
				<tr><td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> 분석 샘플</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> 참조 물질이</td> <td>D2:D11</td> <td rowspan="2"> 컨트롤 샘플</td></tr>
				<tr><td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td> <td>E2:E11</td></tr>
				<tr><td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> 컨트롤 샘플</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> 분석 샘플</td> <td>F2:F11</td> <td rowspan="2"> 기준 물질</td></tr>
				<tr><td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td> <td>G2:G11</td></tr></tbody>
		</table> 표 1: Microplate 샘플 배열. 완전 한 무력화 분석 결과 g 11을 좌표 B2 내 3 microplates에서 실행 되어야 합니다. 임의의 참조, 분석, 및 제어 샘플의 분배 수 연구원 분석 결과에 어떤 편견을 확인 하.</li>
		<li>각 참조의 수행 mAb 희석 샘플, 또는 제어, 표 2에서 같이. 
		참고:이 표에 설명 된 안티-TNFα mAb 농도 중립화 시험에서 최종 농도 되지 않습니다.
		<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>플레이트 열</td> <td>분석 결과 볼륨 문화 매체 (μ)</td> <td>볼륨의 참조 물질, 분석 샘플 또는 제어 샘플 (uL)</td> <td>농도 분석 결과 플레이트 (ng/mL)에서</td></tr> <tr><td>2</td> <td>0</td> <td>230</td> <td>2000</td></tr> <tr><td>3</td> <td>150</td> <td>선에서 2 150</td> <td>1000</td></tr>
				<tr><td>4</td> <td>75</td> <td>75 선 3에서에서</td> <td>500</td></tr> <tr><td>5</td> <td>100</td> <td>선 3에서에서 50</td> <td>333</td></tr> <tr><td>6</td> <td>75</td> <td>75 선 4에서에서</td> < td > 250</td></tr> <tr><td>7</td> <td>75</td> <td>75 선 5에서에서</td> <td>166</td></tr> <tr><td>8</td> <td>75</td> <td>선 6에서에서 75</td> <td>125</td></tr> <tr><td>9</td> <td>75</td> <td>75 이리저리 m 라인 7</td> <td>83</td></tr> <tr><td>10</td> <td>75</td> <td>75 선 9에서에서</td> <td>41</td></tr> <tr><td>11</td> <td>150</td> <td>선 10에서에서 75</td> <td>13</td></tr></tbody></table> T 수 2: 안티-TNFα mAb 희석. 안티 TNFα mAbs의 직렬 희석을이 테이블에서 보여 줍니다. 이 표에 설명 된 최종 농도 되지 않습니다 분석 결과, 농도 안티 TNFα mAbs (mAb 희석 + 배양 세포 현 탁 액) 3 배 희석 했다. 선은 굵게 나타냅니다 희석을 3, 5, 7, 9, 및 10; 라인에서 오는 굵은 비 줄 라인 3, 4 및 6에서 희석을 나타냅니다. 이러한 직렬 희석 중화 분석 결과 수행 하기 전에 그냥 할 수 있습니다. 주의 희석을 분배 하기 전에 세 번 아래로 pipetting으로 혼합 해야 합니다.</li>
		<li>사용까지 25 ± 5 ° C에서 번호판을 유지.</li>
	</ol></li></ol> 4. WEHI 164 세포 분석 결과 중화 <ol>vortexing 모든이 프로토콜의 모든 단계에서 분배 이전 정지 (0.5 x 10 6 셀/mL)를 셀에 의해 <li>믹스. 
	참고:이 섹션에서 따뜻하게 사용 하기 30 분 전에 대 한 37 ° C에 각 솔루션.</li>
	<li>열 2 11, 선 B g.를 이동 하는 microplates의 60 우물의 각 세포 현 탁 액의 전송 50 µ l</li>
	<li>MAb 참조, 샘플 및 컨트롤 전송 50 µ L 희석 microplates로. 그림 1에 표시 된 패턴을 따릅니다.</li>
	<li>각 잘 apoptosis 유도 솔루션의 추가 50 µ L.</li>
	<li>WEHI 164의 50 µ L의 셀룰러 컨트롤 사용 세포, 3 개의 우물에 적절. 분석 결과 문화 매체와 150 µ L의 최종 볼륨을 각 잘가지고.</li>
	<li>는 WEHI 164 셀의 50 µ L의 혼합물의 세포 독성 제어 플러스 apoptosis 유도 솔루션의 50 µ L을 사용합니다. 분석 결과 문화 매체와 150 µ L의 최종 볼륨을 각 잘가지고.</li>
	<li>TNFα에 대 한 제어, apoptosis 유도 솔루션의 50 µ L를 사용 하 고 분석 결과 문화 매체와 150 µ L에 가져다.</li>
	<li>빈, 혼자 분석 결과 문화 매체의 150 µ L 사용.</li>
	<li>접시 증발 효과 피하기 위해 문화 매체의 150 µ L을 채울 나머지 우물.</li>
	<li>반복 단계 4.1.1-4.1.9 2 개의 다른 microplates에 두 번. 
	참고: mAb 최종 농도에 미 판 있습니다: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014, 및 0.004 µ g/mL.</li>
	<li> 그림 1에 표시 된 대로 microplates에서 샘플 로드. 
	<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig1.jpg" /> 그림 1: 시험 접시에서 샘플의 처리. B1 G11 ~ 잘 좌표는 microplates에 있으며 샘플 희석 배치 됩니다 위치 설명. 누락 된 좌표는 웰 스 컨트롤 및 분석 결과 문화 매체 (A1-A12 및 H1 H12)으로 가득 합니다. 샘플 (는 microplates에서 앞으로 역 희석)의이 무작위 배포 매체 또는 다른 변수의 증발 때문에 결과에서 바이어스를 제거에 도움이 됩니다. 그것은 최고의 각 미 판 한 번에 한 애 널 리스트에 의해 수행 됩니다. R: 참조, s: 샘플, CS: 컨트롤 샘플, Dil: 희석. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a></li>
	<li>16 ± 37 ° C, 5% CO 2 세 접시를 품 어 2 헤</li>
	<li>Caspase 3/7 저런 형광 시 약 25 ± 5 ° C에서 사용 하기 전에 30 분 동안 서 보자.</li>
	<li>샘플 및 컨트롤을 포함 하 여 모든 웰 스에이 시 약의 추가 100 µ L.</li>
	<li>즉시 우물으로 분배 후 25 ± 5 ° C에서 3 분 microplate 소용돌이 믹서를 사용 하 여 번호판을 흔들.</li>
	<li>2.5 ± 0.5 h 25 ± 5 ° C, 빛 으로부터 보호에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>마이크 삽입roplates는 루미 노에 다음 섹션을 완료 하 고.</li>
</ol> 5. 분석 결과의 <ol><li>발광 모드 및 기능을 선택 발광 검출을 위한 소프트웨어를 사용 하 여.</li>
	<li>선택 96 잘 클리어-하단 플레이트 및 열 1 및 12를 제외 하 고 그것의 80 내부 우물.</li>
	<li>1250 ms 및 10의 통합 시간 선택 읽기 전에 microplate 혼합에 대 한 s.</li>
	<li>우물 참조 물질, 분석 물질 및 컨트롤 샘플 배치 됩니다 및 그들의 대응 농도와 식별을 선택 합니다.</li>
	<li>는 루미 노와 microplates에 배치 샘플 읽기.</li>
	<li>결과의 분석에 대 한 네 번째 매개 변수 방정식을 사용합니다. 그림 2에서 같이 복용량 응답 곡선 그래프. 
	<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig2.jpg" /> 그림 2: 복용량 응답 곡선. 발광 (세포 생존 능력) 대 안티 TNFα mAb 농도 그려져 있습니다. 네 번째 매개 변수 방정식 mAbs의 안티 TNFα 보호를 설명 하는 모델으로 사용 되었다. EC50은 슬로프에 변화 그래프에서 궁 행 각 분석 결과에 50% 세포 죽음을 일으키는 원인이 되는 TNFα의 양을 중화 시킬 수 mAb의 농도 이다. 바 각 mAb 농도 대 한 발광의 표준 편차를 설명합니다. x 안티 TNFα Ab 농도 나타내고 y 나타내는 반면 ng/ml, 로그 기능으로 묘사 된다 임의의 발광 단위에서 발광 반응. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
	참고: 네 번째 매개 변수 방정식에 C 효과적인 농도 50 (EC50) 이다. 이 값 effector 기능에 의하여 참조 물질, 분석 샘플, 및 제어 샘플을 비교 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>상대 potencies 계산, 기준 물질을 100%로 수정 하 고 샘플의 potencies 계산 하 고 적절 하 게 제어. 
	참고: 이러한 값 그림 3에서 묘사 된다. 
	<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55376/55376fig3.jpg" /> 그림 3: 사용 하는 EC50s 및 그들의 값을 계산 하는 수학 방정식. EC50 값, 또는 C 매개 변수를 표준 오류로 묘사 그들의 불확실성을가지고 있다. 상대적인 힘의 샘플 및 참조 결과 EC50s의 비교도 그려져 있습니다. α와 신뢰 구간 계산 = 0.05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55376/55376fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a></li>
</ol>

<ol><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+A+Review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Patho%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: A Review of programmed cell death.</a> Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Darwish, R. S. <a target="_blank" href="https://www.dovepress.com/regulatory-mechanisms-of-apoptosis-in-regularly-dividing-cells-peer-reviewed-article-CHC">Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells.</a> Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).</li>
<li>Tracey, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18155297">Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review.</a> Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).</li>
<li>Körner, H., Sedgwick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+necrosis+factor+and+lymphotoxin%3A+Molecular+aspects+and+role+in+tissue-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity.</a> Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).</li>
<li>Wong, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17916444">TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions.</a> Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).</li>
<li>Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+antagonists%3A+different+kinetics+and%2For+mechanisms+of+action+may+explain+differences+in+the+risk+for+developing+granulomatous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection.</a> Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).</li>
<li>Karvinen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+time-resolved+fluorescence+quenching+assay+%28LANCE%29+for+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3.</a> J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).</li>
<li>Ren, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+TRAIL+death+receptors+DR4+and+DR5+by+the+signal+recognition+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle.</a> Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).</li>
<li>Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+CD8%2B+T+cells+to+control+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3(2001).</li>
<li>Ramasubramanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamasubramanyan%2C+N+%22Low+acidic+species+compositions+and+methods+for+producing+and+using+the+same%22">Low acidic species compositions and methods for producing and using the same</a>. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li>
<li>Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WEHI+164+subclone+13+assay+for+TNF%3A+sensitivity%2C+specificity%2C+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability.</a> Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).</li>
<li>Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+formulations+of+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor.</a> Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).</li>
<li>Ponnappan, S., Ponnappan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+immune+function%3A+molecular+mechanisms+to+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiox+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions.</a> Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).</li>
<li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li>
<li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark%3A+a+potential+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li>
<li>Männel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li>
<li>Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li>
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저자 공개할 게 없다

이 특성화 비싸고 시간이 많이 걸리는 임상 시험 실시 전에 선험적으로 개발 중인 분자의 생물 학적 행동 결정에 도움이 됩니다. 승인 된 약 제품의 일괄 처리를 일괄 처리 릴리스도 유용합니다. 이 분석 실험 분자는 그것의 행동의 메커니즘에 대 한 적절 한 생물학적 효과 여부를 확인 하는 데 유용은 언급 가치가 있다. 이 자습서에 바이오 분석 방법은 다른 안티-TNFα 분자의 비교에 매우 중요입니다. 일반적인 물리 화학 방법에도 불구 하 고이 방법론 생물 학적 의미, 효능 및 따라서 이펙터 기능의 완전 하 고 전체 의미를 보여주는 품질 특성으로 약물의 효능을 통해 확인할 수 있다.
일반적으로, 세포 apoptosis 응답 TNFα 연구자 수행에 대 한 어려운 작업을 수 있습니다. 이 생물 학적 방법을 표준화 하기 전에 매일에 사용 되는 셀 뱅크의 특성화를 통해 문제 해결을 수행할 수 있습니다. 한 예로 셀 라인 노화12에 관...

생물 학적 힘 수량 (대량 표현)는 단백질 함량의 물리 화학적 측정 관련 생물 속성에 연결 된 분석 제품 특성에 따라 생물 학적 활동의 양적 척도 이다. 다른 분석 방법론을 함께 힘 테스트 제품 적합성, 안정성, 및 comparability 연구의 일부로 수행 됩니다. 이런이 의미에서 힘 측정 제품 배치에 맞는지 중요 한 품질 특성 (CQAs) 또는 승인 기준 및 시장 승인 후 임상 시험의 모든 단계를 설명 하는 데 사용 됩니다.
Apoptosis는 프로그램된 한 세포 죽음, 그 타협 세포 생존 능력 및 기능1,2요소 바이러스 또는 세포는 환경에 의해 스트레스 세포 감염 때 자연스럽 게 발생. 다른 가운데, apoptosis 억제, 또는 생물 학적 중화 면역 중재 염증 성 질환 등 만성 질환의 치료에 특히 mAbs의 주로 알려진된 치료 메커니즘 중 하나입니다. 안티 TNFα 분자는 p55 p75 세포 표면 수용 체3, 마지막으로 세포 apoptosis 이어질 신호 경로 방지와 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα)의 상호 작용을 차단 하 여 그들의 치료 속성을 발휘 한다.
TNFα 일부 만성 질환4에 염증을 일으킬 수 있다. TNFα 쓰레드가 extracellular 환경에 타고 난 면역 체계와 질병5의이 종류에 있는 주요 배우의 보초는 대 식 세포에 의해 은닉 된다. 일반적인 경로로 TNFα 규제 완화는 이러한 질병의 병 인 연결 됩니다. 제어 없이 및 지속적인 유도 및 세포 스트레스, TNFα 궁극적으로 류 마티스 관절염, Crohn의 질병, 그리고 다른 병 적인 프로필6로 이어지는 세포 죽음 및 조직 변성을 유도 합니다.
TNF와 그것의 수용 체 사이 상호 작용을 차단 하는 TNF 길 항 제는 점점 징후를 줄이고 이들이 질병의 진행을 방해 하는 효과적인 치료로 사용 되었습니다. 요즘, 안티 TNFα 약 제품 추가 참여 조직의 변성 방지이 cytokine의 조직 농도 제어를 널리 사용 됩니다. 이런이 의미에서 재현 하 고 강력한 생물의 생물 학적 효과 달성 하는 약물의 특정 능력을 설명 하기 위해 제공은 필수적입니다.
이 프로토콜, 중요 한 중화 분석 결과의 개발 단계 식별-생물 학적 힘의 성공적인 측정에 대 한 강조 표시 됩니다, 바이오 분석 메서드를 실행 하는 데 필요한 기술에 특히 강조와 함께. 이 바이오 분석 방법 마약 제품을 임상 시험된 기준 물질에 비해 다른 배치 또는 안티-TNFα 사이 유용한 comparability 정보를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>WEHI 164</td><td>ATCC</td><td>CRL-1751</td><td>Mus musculus의 섬유육종 세포</td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td>매체 2 &deg에서 매체 저장; C에서 8 &deg; C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체, 페놀 레드 없음</td><td>GIBCO</td><td>11835-030</td><td>매체 2°C에서 보관; C에서 8 &deg; C</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25 %), 페놀 레드</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td>-10 °C에서 매체를 저장; C에서 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>GIBCO</td><td>14190-136</td> 2°C<td>에 매체 저장; C에서 8 &deg; C</td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-알파 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-020</td><td>-20 &deg에 저장; C에서 -70 &deg; C</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (미국), 슈퍼 로우 IgG</td><td>HyClone</td><td>SH3089803</td><td>-10 &deg에서 보관; C에서 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (미국), -</td>10 &deg에서 <td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td>Store를 특성화; C에서 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 분석 키트</td><td>Promega</td><td>G8093</td><td>저장 Caspase-Glo. 3/7 기질 및 Caspase-Glo. 3/7 버퍼 at &ndash; 20 & 순서; C 보호 대상 Light</td></tr><tr><td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. 시약</td><td>J.T.Baker</td><td>8993-01</td><td>--</td></tr><tr><td>Sample mAb Adalimumab</td><td>Probiomed</td><td>NA</td><td>마이크로플레이트의 최종 농도는 다음과 같습니다:&nbsp; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 및 0.004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>참조 및 제어 mAb Adalimumab</td><td>Abbvie</td><td>NA</td><td>마이크로플레이트의 최종 농도는 다음과 같습니다.&nbsp; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 및 0.004 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>89429-536</td><td>SpectraMax M3 멀티모드</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더 소프트웨어&nbsp;</td><td>분자 장치</td><td>--</td><td>SoftMax Pro 6.3 GxP</td></tr><tr><td>인큐베이터&nbsp;</td><td>레브코&nbsp;</td><td>30482</td><td>Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2</td></tr><tr><td>층류 후드&nbsp;</td><td>더 베이커 컴퍼니&nbsp; &nbsp;</td><td>200256</td><td>베이커 SG603A-HE | 고효율, 클래스 II 타입 A2&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

상대적인 힘의 안티-tnf 단 클론 항 체 (mab) 중화 방 청 tnf는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

이 프로토콜 안티 TNFα mAb를 사용 하 여 마우스 fibroblast 세포 모델 (WEHI 164)에서 TNFα의 apoptotic 활동 중립화의 측정을 보여줍니다. 또한,이 프로토콜 융해 단백질 등 다른 안티 TNFα 분자를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기 고용 셀룰러 모델 TNFα 중재 된 apoptosis에 민감한 때 추가 스트레스 요소가 셀 문화 조건 (예: 혈 부족)에서 유도 된다. 이 절차 실행이 분석 분석 결과, 샘플 준비, 셀 희석, apoptosis 유도, 성공적인 결과 보장 하기 위해 중요 한 spectrophotometric 측정에 관련 된 주요 작업을 강조 표시 하는 방법을 예로 보여주. 이 프로토콜 apoptosis 유도 및 효율적인 신호 기록, 낮은 불확실성 값을 선도 하는 최고 성능 조건을 보여준다.

(컨트롤)와 복용량 응답 그래프 
그림 1 mAb 농도 대 발광 응답을 나타냅니다. 이 자형 기능 분석 결과 배양 세포 세포의 용 해 때문에 caspase 3 및 7 릴리스를 예로 보여주. 세포 죽음은 혈 청 기아 플러스 TNFα 유도 신호에 의해 향상 됩니다. 따라서, 안티-TNFα 분자 (mAb)는 TNF 세포 수용 체와의 상호 작용 (입체 방해)에 의해 억제 사이토카인 상호 작용 합니다. 이 인해 높은 mAb 농도에서 세포 생존.
메서드에서 사용 하는 컨트롤 했다: 분석 결과와 세포 매체, 셀 플러스 TNFα 플러스 분석 결과 문화 매체, 문화 및 문화 mediumalone 분석 결과. FBS 기아에서 분석 결과 문화 매체와 혼자 셀 apoptosis, 따라서 발광을 개...

프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 anti-TNF-alpha 분자의 상대적 효능을 측정하는 것입니다. 본 예시에서는 두 가지 anti-TNF-alpha 단일클론 항체를 비교하여, 조사 대상인 샘플 mAb 대비 하나의 기준 mAb의 중화 효율을 결정합니다. 이 튜토리얼은 문헌에 포함되지 않은 TNF-alpha 중화 효능 결정을 위한 상세 단계를 보여줍니다.세포는 기아 상태와 같은 다양한 환경적 요인에 의해 스트레스를 받을 수 있습니다. 각 세포의 표면에는 수용체라고 불리는 서로 다른 단백질들이 존재합니다. 그중 일부는 사이토카인인 TNF-alpha에 특이적입니다.이 분자가 수용체와 상호작용하여 특정 신호가 생성되면, 이러한 신호 전달이 환경적 스트레스 요인과 결합하여 아포토시스(apoptosis)라고 불리는 예정 세포사와 같은 프로그램된 세포 사멸을 유도합니다. 그러나 단클론 항체일 수 있는 항-TNF-alpha 분자가 존재하면, 사이토카인이 해당 mAb에 의해 적정되어 중화 과정을 거치게 되며, 이는 세포의 생존을 돕습니다. 따라서 표준화된 방법론을 통해 분자의 중화 강도를 측정할 수 있습니다.본 프로토콜은 현재 5일에 걸쳐 수행됩니다. 첫째 날에는 세포 배양을 위한 용액들을 준비해야 합니다. 또한, WEHI 164 세포를 해동하고 계대 배양합니다.둘째 날과 셋째 날에 세포의 합류도(confluency)를 확인해야 합니다. 이 단계 이후에 세포를 분리하고, 수를 세어 세포 밀도를 조절한 다음, 마지막으로 세포를 다시 배양해야 합니다. 이 모든 단계는 매일 수행되어야 합니다.4일 차에 UV 흡광도로 mAb 농도를 측정하고 항체 희석을 수행해야 합니다. 세포 사멸 유도 용액을 준비합니다. 마지막으로, WEHI 164 세포의 세포 밀도를 mL당 50만 개로 조정해야 합니다.5일 차에는 세포 사멸 세포 검출을 위한 기질 용액을 준비하고 분광 광도 분석을 수행합니다. 마지막으로, 결과에 대한 in silico 분석을 논의합니다. 본 프로토콜에 사용된 모든 용액은 이 슬라이드에 표시되어 있습니다.첫째 날, 아포토시스 유도 및 기질 용액(재구성 후 즉시 사용해야 함)을 제외한 모든 용액은 프로토콜 실행 전에 미리 준비해야 합니다. 프로토콜 시작 시, 액체 질소 용기에서 냉동 세포를 꺼내십시오. 냉동된 WEHI 세포가 들어 있는 이 바이알은 사용 전까지 얼음 위에 보관해야 합니다.교차 오염을 방지하기 위해 모든 작업을 수행하기 전 작업 공간을 청결하게 유지하고 소독하십시오. 등온 랙(isotherm rack)을 층류 후드(laminar flow hood)로 옮기고, 15mL 멸균 튜브에 미리 데워둔 배양액 9mL를 분주하십시오. 미리 데워둔 배양액 1mL를 사용하여, 냉동된 세포가 마이크로튜브에서 떨어져 나올 때까지 부드럽게 상하 피펫팅을 하며 WEHI 164 세포를 세척하십시오.냉동된 세포가 완전히 해동될 때까지 다섯 번 뒤집어서 섞어줍니다. 그 다음 세포를 125 g에서 3분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 분산시킵니다.미리 데워둔 배양액 5 mL를 튜브에 넣고 세포가 완전히 재현탁될 때까지 현탁액을 섞어줍니다. 세포를 T-culture 플라스크로 회수합니다. 그리고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 세포를 분리하고 계수하기 전 매일 현미경 하에서 배양 상태의 건강함을 확인하는 것이 필수적입니다.연구자는 계대 배양을 위해 세포의 상태, 생존율 및 세포 밀도를 확인해야 합니다. 이러한 확인 과정은 생물학적 분석 시에도 수행되어야 합니다. 우선, 박테리아와 같은 생물학적 오염이 없는지 확인해야 합니다.둘째로, 세포의 건강 상태는 합류도(confluency)를 통해 확인할 수 있습니다. 90% 이상의 합류도면 양호한 결과를 얻기에 충분합니다. 하지만 세포가 원하는 세포 밀도에 도달하지 않았다면, 플라스크를 다시 배양기에 넣고 세포가 원하는 밀도와 합류도에 도달할 때까지 기다려야 합니다.T 플라스크에서 노후된 배양액을 제거해야 합니다. T 플라스크 벽면에 부착된 세포를 5 mL의 세포 세척액으로 세척하십시오. 이때 부착된 세포가 제거되지 않도록 주의하십시오.배양액 잔해와 세포 파편을 제거하기 위해 수동으로 혼합합니다. 이 단계는 두 번 반복하여 수행해야 합니다. 진공 장치를 사용하여 잔여 세척액을 제거하고 3 mL의 세포 분리 용액을 첨가합니다.3분 동안 흔들어 섞으며 배양합니다. 배양이 끝나면, 효소를 불활성화하기 위해 미리 데워둔 배양액을 T flask에 첨가합니다. 그 후 세포를 회수합니다.세포 현탁액을 15-mL 튜브로 옮기고 원심분리합니다. 세포 펠릿을 확인하고 상층액을 제거합니다. 건강한 세포 배양을 위해서는 노후된 배양액을 제거하는 것이 중요합니다.세포 펠렛을 분산시키고 미리 데워둔 배양액 5 mL로 세포를 재구성합니다. 세포 현탁액 50 µL를 마이크로튜브로 옮깁니다. trypan blue 배제법을 사용하여 세포 수를 측정합니다.세포 수를 측정하고 세포 생존율을 결정합니다. 생존 세포 수가 파악되면, 다음 공식을 사용하여 15 mL의 배양 배지를 mL당 50만 개의 세포 밀도가 되도록 조정합니다. 조정된 세포 현탁액 15 mL를 T-culture 플라스크에 옮겨 담고 하룻밤 동안 배양합니다.중화 시험을 시작하기 전, 이러한 전체 배양 과정을 최소 한 번 더 반복하여 총 3회의 세포 계代배양을 수행해야 합니다. 4일째에 표준물질, 분석 시료 및 대조 시료의 광학 밀도를 280 nm에서 UV 흡광도로 측정합니다. 각 시료에 대해 분석 배양 배지를 사용하여 2 mg/mL로 1차 희석을 수행하며, 이때 각각 독립적으로 3회 반복 측정합니다.각 mAb 샘플을 mL당 2 µg으로 2차 희석합니다. 폴리스티렌 마이크로플레이트 중앙에 위치한 60개 웰에 분석 배양액 75 µL를 분주합니다. 2B 및 2C 웰에는 표준 물질 230 µL를 첨가합니다.분석 시료를 웰 2D와 2E에 넣습니다. 마지막으로, 컨트롤 시료를 웰 2F와 2G에 넣습니다. 컨트롤 시료는 상대적 효능이 알려진 분자입니다.그 다음 마이크로플레이트에 연속 희석액을 만듭니다. 예시는 다음 슬라이드에 나와 있습니다. 웰에 분주하기 전에 용액을 미리 혼합해야 함을 기억하십시오.이 작업은 본 프로토콜의 성공을 위해 매우 중요합니다. 분주기에 1mL당 50만 개의 세포가 되도록 미리 조정하십시오. 분석 플레이트의 2열부터 11열까지 내부 60개 웰에 세포 현탁액 50 µL를 첨가하십시오.마이크로플레이트에 액체를 추가하기 전에 세포 현탁액을 미리 혼합하십시오. mAb 희석액 50 µL를 즉시 분석 플레이트로 옮기십시오. 쌍을 이룬 레인의 경우, 마이크로피펫을 돌려가며 희석액을 분주하십시오.mAb 희석액을 다음 순서에 따라 웰에 분주하고, 대조군은 주변 웰에 분주합니다. TNF-alpha를 500 µL의 초순수로 희석합니다. 볼텍스 믹서를 사용하여 2200 rpm으로 혼합합니다.15-mL 튜브로 옮긴 후, 마지막으로 분석 배양 배지를 사용하여 40 nanograms per mL로 희석합니다. 60개의 내부 분석 웰에 세포사멸 유도 용액 50 microliters를 분주합니다. 60개의 내부 분석 웰에 세포사멸 유도 용액 50 microliters를 분주합니다.마지막으로, 16시간 동안 배양합니다. 5일째 되는 날, 제조사의 지침에 따라 이 완충 용액으로 기질을 재구성합니다. 5회 반전시켜 혼합합니다.기질 용액을 분주합니다. 분석 플레이트의 각 샘플 웰에 기질 용액 50 µL를 추가합니다. 대조군에도 기질을 추가합니다.어세이 플레이트를 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 400 rpm에서 3분 동안 교반합니다. 믹서에서 어세이 플레이트를 꺼내 실온에서 배양합니다. 플레이트 리더-분광광도계를 켭니다.SoftMax Pro 소프트웨어 또는 그와 동등한 프로그램을 실행합니다. 마이크로플레이트를 분광광도계에 장착하고 다음 파라미터를 조정합니다. 발광(luminescence) 기능과 읽기 유형(Read Type)을 엔드포인트(Endpoint) 기능으로 활성화합니다.1번과 12번 컬럼을 제외하고 읽기 영역(Read Area)을 조정하십시오. 플레이트 유형(Plate Type)을 96 Well Standard clear bottom microplate로 선택하십시오. 적분 시간(Integration Time)을 최대 1250 milliseconds까지 변경하십시오.마이크로플레이트의 흔듦 시간을 10초로 조정합니다. 표준 물질, 분석 물질 및 대조군 샘플이 배치될 웰을 선택합니다. 측정을 시작합니다.이 분석의 결과는 mAb 농도의 로그 스케일에 대비하여 발광으로 표현된 반응 곡선입니다. 이 곡선들의 변곡점은 각 mAb의 유효 농도인 EC50입니다. C 또는 EC50은 nanograms per mL로 표시됩니다.하지만 이 값은 대조군 샘플과 비교하지 않으면 그 자체로는 의미가 없습니다. 따라서 분석 샘플의 역가는 백분율로 표시하며, 이를 상대 역가라고 합니다. 상대 역가는 각 플레이트의 EC50 값으로부터 도출된 세 번의 독립적인 마이크로플레이트 결과의 평균값입니다.대조군 샘플과 표준 샘플 간의 비교는 현재 분석법에서의 편차나 바이어스를 결정하는 데 도움이 됩니다. 표준 샘플과 분석 샘플을 비교하면 상대적 역가를 결정할 수 있습니다. 이 표는 mAb의 상대적 역가와 95% 신뢰 구간을 보여줍니다. 또한 표준 물질의 역가와 관련된 각 샘플의 상대 표준 편차를 나타냅니다.상대 표준 편차가 15%를 초과하는 경우 수용 불가능한 것으로 간주합니다. 이러한 특성 분석은 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리는 임상 시험을 수행하기 전에, 개발 중인 분자의 생물학적 거동을 사전에 결정하는 데 도움이 됩니다. 또한, 승인된 제품의 배치 간 출하 승인에도 유용합니다.우리는 이러한 분석법들이 분자가 그 작용 기전에 따라 적절한 생물학적 효과를 갖는지 판단하는 데 유용하다고 판단합니다. 생물물리학적 방법의 일환으로, 이 방법론은 생물학적 수단을 통해 약물의 품질과 특성에 따른 효능(potency) 및 유효성(efficacy)을 결정할 수 있으며, 이를 통해 이펙터 기능의 완전하고 충분한 유의성을 보여줍니다.

determination-relative-potency-an-anti-tnf-monoclonal-antibody-mab

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연구

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멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

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항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

여기 우리는 중화 항 체 또는 인간 매트릭스, 뇌 척추 액체 (CSF) 등 인간의 혈 청에에서 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 방해 하는 다른 요소를 감지 하는 셀 기반 흐름 cytometry 방법을 제시.

세포 기반 분석 결과와 효소 대체 요법의 세포질 통풍 관을 중화 하는 항 체의 검출

이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

MALT1 타고 난 면역을 조절 하지만 병이 정의 남아 어떻게이 발생 합니다. 우리는 타고 난 신호 통행세 같이 또는 C 형 lectin 같이 수용 체의, MALT1 골수성 cytokines의 생산 조절 시연 다운스트림 다운스트림 MALT1의 기여를 푸는 선택적 MALT1 paracaspase 억제제 MLT-827 사용 C-타입 lectin 같이 수용 체의 선택적으로.

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

배우세요 WEHI 164 세포를 이용한 항-TNF-α 단클론 항체의 상대적 효능 측정 방법을 통해 면역학 연구에서 중화 효율성을 비교 분석하는 기술을 익히세요.

상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

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