Name: Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 학습하세요 마우스 정자세포에서 감수분열 염색체를 확산하는 방법을 통해 수컷 감수분열을 연구하세요. 이 기술은 다양한 감수분열 단계의 세포핵을 풍부하게 제공하여 재조합 및 염색체 분리 메커니즘을 분석합니다.

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저자 애비 해리스의 기술 지원을 인정 한다. 그들은 또한 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 프로토콜을 최적화 하는 데 도움에 대 한 폴라 코헨과 김 웨이 인정 합니다. 저자는 또한 중요 한 독서의 카 렌 쉰들러에 의해 원고를 주셔서 감사합니다.
이 작품은 NIH R01 GM106262 K.M.B.에 의해 지원 되었다

쥐를 포함 하는 모든 방법을 활용 높은 윤리 및 복지 표준, 그리고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Drexel 대학 대학의과 대학에 의해 승인 했다.
1입니다. 솔루션 및 필요한 악기의 준비
<ol><li>초순 실험실 급료 물, pH 8.2-8.4 (표 1) 50 mL에 소형 추출 버퍼 (히)를 준비 합니다. 신선한 때마다, 얼음, 유지 하 고 확산; 준비의 2 시간 이내 사용 솔루션 이것은 줄이고 각각 DTT와 PMSF의 활동을 억제 하는 효소를 최적화 해야 합니다. 히의 10 mL를 사용 하 여 마우스 testes의 각 쌍에 대 한.</li>
	<li>학년 물 초순 실험실의 10 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 100 mM 자당 솔루션 (신선한 각 시간)을 준비 합니다. 8.2에 pH를 조정</li>
	<li>통 솔루션 준비 (1 %paraformaldehyde (PFA), 0.15% 트라이 톤 X-100, pH 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 조정) 신선한 월별와 스토어 실내 온도에 그것은 빛 으로부터 보호. 작업 사진으로 사용 하기 위해 1 X PBS에서 4%로 16% 상용 PFA 시작 재고 희석 하 고 후-20 ° c.에 4 %aliquots 저장<ol>
<li>통 솔루션을 준비 하려면 추가 4 %PFA 솔루션의 10 mL와 10%의 600 µ L 트라이 톤 X-100 1 X PBS의 30 mL를 섞어 잘, 그리고 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 pH를 조정. (더 이상 4 주)에 대 한 실 온에서 알루미늄 호 일에 싸여 50 mL 원뿔 튜브에 통 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포토 플로 200 세척 솔루션 (해당 되는 동안 슬라이드 마지막 30 분 건조) 준비: 0.4% 포토 플로 200/PBS (320 µ L 포토 플로 200의 1 X PBS의 80 ml에서) 및 0.4% 포토 플로 200/dH2O (160 µ L 포토 플로 200 초순 실험실 급료 물 40 mL에). 가득한 솔루션의 40 mL 50 mL Coplin jar를 사용 하 여 한 번에 10 개 이하의 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>다음 악기를 준비: 1 켤레 (피부 incise)을 수술가 위, 좋은 팁 (incise 복)을 수술가 위의 1 개 쌍 (각 고환 개 해 부)를 바로 좋은 팁 겸, 2 쌍 1 똑 바른 가장자리 면도기 블레이드 (각 고환 incise), 2 쌍의 곡선 (각 고환 고정을 짜 seminiferous tubules) 팁 집게, 50 mL Coplin 항아리, 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드, 크기 11 블레이드, 습도 챔버, 100 x 15 mm 페 트리 접시, 좋은 팁 영구 마커 또는 연필, 1 메스와 플랫폼 회전 통입니다.<ol>
<li>충전된 장소 프리미엄 통 솔루션 사용까지 가득 50 mL Coplin jar에 똑바로 두르고 끝 유리 슬라이드 precleaned. 참고: 연필 슬라이드 에탄올, 형광 제자리에서 교 잡 등을 요구 하는 절차에서 이후에 사용 하는 경우 기본 설정입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. spermatocyte 핵 확산
<ol><li>기관 지침 (또는 CO2 질 없이 예: 자 궁 경부 전위)에 따라 남성 마우스 안락사</li>
	<li>사용 P10-P20 남성 spermatogenesis;의 물결 meiotic 세포 평가 하 우리는 일상적으로 사용 P15-의향 I. 성인 testes 제공의 모든 substages에서 세포를 얻기 위해 P17 남성 의향에서 세포 나도, 하지만 그들은 또한 spermatids와 같은 더 postmeiotic 셀을 얻을 것입니다.</li>
	<li>수확 및 무게 testes (짝된 무게 기록); 그런 다음 그들을 축축한 유지를 추운 히 몇 방울을 포함 하는 배양 접시에 배치 합니다.</li>
	<li>고환 접시의 바닥에 대 한 곡선된 팁 집게로 누른 직선 가장자리 면도기 블레이드는 고환의 캡슐을 통해 작은 수직 중간 절 개를 사용 하 여. 여전히 한 집게와 접시의 바닥에는 고환 잡고, 곡선된 팁 집게 또는 직선 모서리 면도날의 두 번째 집합을 사용 하 여 부드럽게는 고환에서 seminiferous tubules를 짠 다.<ol>
<li>찬 히, 캡슐의 튜브에 않도록 하기 위해 돌의 10 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에는 tubules를 놓습니다. 두 번째 고환이이 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포함 하는 고환의 크기에 따라 30-60 분 동안 얼음에 히 원뿔 튜브에 decapsulated seminiferous tubules를 품 어. 한 쌍의 고환 무게 30 mg에서 seminiferous tubules를 품 어 이하로 30 분, 60 분에 대 한 30-45 분, 그리고 큰 고환에 대 한 31 ~ 50 밀리 그램을 무게 testes의 쌍에서 tubules. 하나의 고환에 대 한 시간을 변경 하지 않습니다. 참고: 최적의 부 화에 실험, 사용, 시 약 및 분석 되는 쥐의 경험에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>Seminiferous tubules 히에 잠복기는, 하는 동안 마커 또는 연필 마우스 precleaned 슬라이드의 서리로 덥은 끝 번호, 슬라이드 번호 및 날짜를 사용 합니다. 다음 통 솔루션이 포함 된 Coplin jar에 미리 청소 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>부 화, 다음 깨끗 한 Petri 접시와 약 3 m m 직경 수 풀에 별도 tubules tubules와 히를 붓는 다. 각 덩어리 생성 2 슬라이드 하 고 굴복 하는 슬라이드 수 고환의 크기에 따라 다릅니다. 참고: 우리는 야생 타입 subfertile Chtf18에서 6 슬라이드에서 8 슬라이드 얻을-P16 testes (있는) meiotic mitotic 세균 세포8의 감소 숫자로 인해 작은 null. 한 성인 고환 100 밀리 그램 이상의 무게 16 슬라이드를 예상 될 것 이다.</li>
	<li>테 플 론의 한 반지로 100mm 자당 솔루션의 장소 23 µ L 인쇄, 3 슬라이드 링 반지 seminiferous tubules의 한 덩어리를 추가.  다음을 사용 하 여 곡선 팁 겸 덩어리를 잡고, 부드럽게 솔루션 흐린 될 때까지 크기 11 면도날으로 tubules를 말하다. 참고:이 조각난된 염색체에 발생 overmince 하지 않습니다. Note 조각난된 염색체 돌연변이 표현 형을 나타내는 수도 수 있습니다.</li>
	<li>이물질 제거, 자당 솔루션의 또 다른 23 µ L을 추가 하 고는 micropipette를 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 혼합물을 위아래로 몇 번 하는 정지에서 세포를 분리 하는 데 도움이.</li>
	<li>포함 된 통 솔루션 Coplin jar에 몸을 담글 슬라이드를 제거 하 고 그 하나의 관대 한 방울 슬라이드의 하단 모서리에서 수집 그래서 항아리에 슬라이드를 기울기.<ol>
<li>피펫으로 20 µ L 프리미엄 통 물방울에 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드의 반지에서 자당 세포 현 탁 액의 젖 빛 유리 슬라이드, 그리고 피펫으로 위아래로 2-서 스 펜 션 3 번. 참고: 통 방울 되어야 합니다 볼륨에 충분히 큰 그래서 그것에 자당 세포 현 탁 액의 20 μ의 추가 허용 범위 전체 슬라이드에 걸쳐 혼합물 (2.11 아래 참조) 전염 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>천천히 기울기 확산 슬라이드의 길이 따라 세포 현 탁 액을 방울 반대 측면에 슬라이드. 다음 슬라이드를 천천히 기울기 다시 완전히 커버 슬라이드의 너비를 따라 세포 현 탁 액을 확산. 슬라이드 보다 더 한 번 그렇지 않으면 셀 서로 겹칠 것의 동일한 지역에 정지를 확산 하지 마십시오.</li>
	<li>즉시 슬라이드 습도 챔버에 평평 하 게 놓고 반복 단계 2.8 2.11 seminiferous tubules의 모든 대단히 짧은 시간까지 슬라이드를 만들기 위해 사용 되었습니다. 그것은 찢 어과 셀 중복을 피하기 위해 건조 과정에서 습도 챔버를 이동 하지 해야 합니다.</li>
	<li>그들은 천천히 하 고 완전히 건조 되도록 2.5 h에 대 한 실 온에서 덮여 습도 챔버에 품 어를 슬라이드 수 있습니다. 높은 습도 및이 단계에서 느린 건조는 chromatin의 적절 한 확산 되도록 중요 하다. 그리고 챔버의 커버를 제거 슬라이드 추가 30 분 완전히 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>슬라이드 (다시 뒤로 또는 지그재그 패턴) 0.4% 포토 플로 200/1 X PBS 솔루션 포함 Coplin jar에 고는 슬라이드를 두 번, 5 분을 세척, 부드럽게는 Coplin agitating, 통을 회전 하는 플랫폼에 항아리. 각 세척에 대 한 신선한 솔루션을 사용 하 고는 세척의 각각에 대해 별도 항아리에 다른 마우스에서 슬라이드를 계속.</li>
	<li>교 반 하면서 한 번 포함 하는 5 분 동안 0.4% 포토 플로 200/dH2O 솔루션 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>제거 슬라이드는 Coplin jar (마지막 세척), 신중 하 게 하 게 가장자리와 과잉 액체를 제거 하는 슬라이드의 바닥 닦아 하 고 건조 각도, 거의 직 립 위치에 슬라이드를 배치. 이 기술에 능숙 한 실험 자 수 처리 하 고 하루에 4 또는 5 쥐에서 표면 확산 핵을 준비.</li>
	<li>일단 건조 (15-20 분), 즉시 면역 형광 염색 법 또는-80 ° c 최대 3 주에 대 한 빛에서 보호 된 단단히 닫은 슬라이드 상자에서 저장소에 대 한 슬라이드를 처리 (; 평가 대상 단백질에 따라 최적의 결과 얻을 수 있습니다 경우 스테인드 같은 일 또는 2 주 이내).<ol>
<li>-80 ° C에 저장 하는 경우 다음에 실내 온도와 서 얼룩이 지기 전에 5 분 동안 1 Coplin jar에 X PBS 또는 블록 세척 슬라이드 수 있습니다. 참고: 많은 다른 면역 형광 얼룩 프로토콜; 좋은 결과 제공할 것입니다. immunostaining 프로토콜8버코위츠 외.를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+mammalian+meiosis%3A+regulation%2C+dynamics+and+impact+on+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li>
<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
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<li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li>
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<li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li>
<li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cohesins+in+mitosis%2C+meiosis%2C+and+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li>
<li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+in+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li>
<li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+elaboration%3A+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li>
<li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li>
<li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li>
<li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+premature+G2%2FM-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

잘 확산, 좋은 품질 spermatocyte 핵의 높은 번호를 얻을,이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 히, 적절 한 seminiferous tubules의 닦지 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간을 포함 하 고 기술을 고용 통 코팅된 슬라이드에 자당 세포 현 탁 액 분산. 우리는 testes comparably 세 Chtf18에서 45 분, HEB에서 성인 기에 출생 후 하루 15에서에서 배열 하는 야생 타입 남성의 고환에서 seminiferous tubules를 품 어-null 생쥐는 인 큐베이 팅만 30 분 testes 절반 크기 포함 하기 때문에 상당히 적은 생식 세포8. 우리의 경험에서는, Chtf18의 부 화-대 제대로 해결된 homologs의 결과로 세포의 무결성을 손상 하는 30 분 이상 testes를 null. Seminiferous tubules만 흐린 자당 세포 현 탁 액을 얻기 위해 다진은 고 각 슬라이드 (2...

마우스는 포유류에서 감수 분열을 연구 모델 생물으로 광범위 하 게 사용 됩니다. 정상적인 발달 과정 및 감수 분열 중 발생 하는 결함을 평가할 수 있습니다. 타임 라인 및 의향 어 substages, 하는 동안 발생 하는 돌출 하는 특징의 진행으로 다양 한 특정 단백질 감수 분열의 규칙에 중요 한 프로세스에 관련 된 야생 유형 및 돌연변이 생쥐에서 특징 수 있습니다. 내가 (헨델과 Schimenti1검토) 세부에서 공부 될 수 있다 감수 분열 중 발생 하는 몇 가지 특수 프로세스. DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 형성 및 수리, 재결합, synaptonemal 복잡 한 형성 및 염색체 분리 포함 됩니다.
Meiotic 프로세스의 중요 한 측면은 핵 시각과 광학 해결 되어 더 나은 포함 동종 염색체 구별 하 고 식별 의향 5 substages는 이루어져 I. 의향의 substages를 검사 하는 능력 그 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 형성을 포함 하 여 특정 기능에 의해 특징. 사우스 캐롤라이나는 페어링 있도록 자간 단백질 비 계 및 homologs의 DNA 이중 가닥 브레이크 수리. Leptonema, 동안 homologs는 SC의 축 요소 답니다로 맞춥니다. 다음 zygonema 중 synaptonemal 복잡 한 중앙 요소 첨부 파일 homologs의 쌍 사이 연결 및 물리적 연결을 (synapsis)을 촉진 한다. Pachynema, 동안 homologs의 synapsis 완료 되 고 DNA 크로스 동종 재결합을 통해 DNA 두 배 물가 틈의 선택 인구의 수리에서 형성 된다. 사우스 캐롤라이나 동안에 diplonema, homologs desynapse 하지만 그들의 centromeres, DNA 크로스의 사이트에 연결 된 남아 있도록 디스어셈블 합니다. 마지막으로 동안에 diakinesis, homologs recondense 그리고 분열에 전환1.
역사적으로, 특히 그 의향의 초기 단계에서 몇 가지 핵 나왔고 meiotic chromatin의 표면 확산 나2. 결과적으로, 이러한 방법은 조직 즉 고환 (난소)에서 세포의 분리, 확산 meiotic chromatin의 기술과 높은 품질 meiotic 핵 평가2,3, 의 수확량을 개선 하기 위해 수정 된 4. 또한,이 방법은 핵 보존에 유용 하 게 입증 하 고 chromatin meiotic 핵에서 단백질 바인딩 같이 게시 된 immunolocalization 기법5,,67. 메서드를 처음 피터 스2 로 설명 하 고 시연 여기 수익률 겪고 의향의 leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, 및 diakinesis substages homologs를 포함 하는 많은 별도 버스트 spermatocyte 핵 따라서, 내가.
표면 확산 핵 (chromatin 확산 분석이 라고도 함)을 준비 하는 기술은 감수 분열 생식과 세포 생물학의 분야에서 연구에 널리 사용 됩니다. 표면 확산 핵 포함 된 슬라이드 수 이후에 관심사의 단백질에 항 체와 immunostained 또는 실버 얼룩, 대상이 되며 다음 현미경으로 분석. 메서드는 수정 여성 쥐2에 대 한 설명 되었습니다 비록 둘 다 남성과 여성 쥐에 대 한 유사. 그것은 overmince seminiferous tubules를 하지 중요 합니다. 핵 해야 합니다 또한 잘 확산 될 immunostaining homologs 다음 있도록 하 고 관련된 단백질 현미경으로 명확 하 게 볼 수 있습니다. 표면 확산 핵 불과 몇 시간에 어느 immunostained 즉시 준비 하거나 3 주 전에 해빙 및 immunostaining의 최대-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 그러나, 어떤 단백질에 대 한 최적의 결과 가져옵니다 가장 immunostaining 즉시 또는 표면 확산 핵 준비 2 주 이내에 수행 되는 경우. 슬라이드, 관심사의 단백질에 항 체를 사용 하 여 표준 프로토콜 immunostained 수 뒤에 2 차 항 체에 형광 활용된 단백질 또는 염료, 부 화 후 형광 현미경8군데. 출생 후 하루 15-21에서 6-10 슬라이드를 야생 타입 testes의 쌍 당 충분 한 조직 그리고 더 오래 된 쥐 (성인 포함) 더 많은 슬라이드를 얻을 것입니다. 그러나, 강포한 유형 쥐 6 주 동안 얻을 것입니다 또한 immunostaining 다음 슬라이드에 더 포스트 meiotic 세포 (예: spermatids). 또한, 의향의 모든 substages 내가 관찰할 수 있습니다 청소년과 성인 쥐에서. 출생 후 일 15 10 남성에서 고환 많은 leptotene 및 zygotene 셀을 얻을 것입니다. 쥐 출생 후 하루 14 ~ 15 보다 오래 된 pachytene 및 diplotene 핵을 더 얻을 것입니다.
여기 우리가 설명 하 고 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 널리 사용 방법을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(포름알데히드 수용액)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>16% 용액을 1X PBS로 4% 작업 재고로 희석하고 -20°C에서 부분 표본을 동결합니다. C</td></tr><tr><td>테플론 프린트 3링 슬라이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 충전되지 않은 서리 끝 유리 슬라이드</td><td>여러 상업 브랜드</td><td></td>가 <td>있습니다. 슬라이드를 에틸 또는 이소프로필 알코올로 청소하고 사용 전에 물기를 떨어뜨려 건조시킵니다; 슬라이드의 후속 사용에 따라 영구 마커 또는 연필로 서리 끝의 슬라이드를 라벨합니다</td></tr>. <tr><td>수술용 가위 (날카롭고 뭉툭한 끝)</td> <td>고급 과학 도구</td><td>14001-12</td><td>유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다.</td></tr><tr><td>미세 팁 수술용 가위(날카로운 팁)Fine</td> <td>Science Tools</td><td>14058-11</td><td>유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다</td></tr><tr><td>. 직선 미세 팁 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다</td></tr><tr><td>. 곡선형 중간 팁 집게</td><td>Fisher</td><td>16100110</td><td>유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다.</td></tr><tr><td>메스 손잡이</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>유사한 유형의 다른 브랜드가 작동합니다</td></tr><tr><td>마우스 anti-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>1:300에 사용</td></tr><tr><td>Anti-centromere protein (human CREST 환자 혈청에서 유래)</td><td>항체 통합</td><td>15-234-0001</td><td>1:50</td></tr><tr><td>가습 챔버</td><td></td><td></td><td>사용 우리는 Nunc 정사각형 배양 접시 500cm2 / 웰을 촉촉한 종이와 함께 사용합니다. 수건</td></tr><tr><td>epifluorescence를 가진 광시야 현미경</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>모든 표준 모델</td></tr><tr><td>Coplin 항아리</td><td>여러 상업 브랜드</td><td></td><td>50ml 용량; 직경 40mm(1.6인치), 10개의 슬라이드 수용(뒤로)</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>여러 상업 브랜드</td><td></td><td>직경 100 x 15mm 직경, 폴리스티렌 멸균 미처리</td></tr></tbody></table>

meiotic 염색체의 준비에서 마우스 spermatocytes 확산

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

포유류의 감수 분열은 생식 세포에서 발생 하 고 공부 하 고 수 있는 특징 동적 개발 프로세스입니다. 메서드를 사용 하 여 슬라이드의 표면에 핵 확산 (보다는 오히려 그들에서 떨어지는 높이), 마우스 spermatocytes에 1997 년에 처음으로 설명 했다는 최적화 된 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 널리 이용 되는 고품질 핵 겪고 I. Seminiferous 의향의 substages의 과다 생성 때문에 포유류 감수 분열을 공부 하는 실험실에서 tubules 먼저 spermatocytes를 소형 솔루션에 배치 됩니다. 다음 spermatocytes를 만드는 세포 현 탁 액, 자당 솔루션으로 출시 되 고 핵 정착 액 젖 유리 슬라이드에 전파 됩니다. Immunostaining, 다음 meiotic 프로세스에 밀접 한 단백질의 다양성 시험 될 수 있다. 예를 들어 synaptonemal 복잡 한, homologs의 염색체 축/코어를 함께 연결 하는 3 자간 구조의 단백질은 쉽게 구상 될 수 있다. Meiotic 재결합 단백질, 동종 재결합에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 수리에 관련 된, 또한 의향의 진행을 평가 하는 immunostained 수 나. 여기 우리가 설명 하 고 자세하게에서 설명 널리 spermatocytes 청소년 이나 성인 남성 생쥐에서의 포유류 감수 분열을 공부 하는 기술.

많은 수의 표면 그대로 homologs를 포함 하는 핵 확산을 제공 하는이 방법의 능력 세 가지 주요 요인에 따라 달라 집니다: 1) 소형 버퍼 (즉 히)를 적절 하 게에서 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간 부 어 spermatocyte 버스트에서 분해 하지 않는 핵 히, 2 부 화 연장) micropipetting 함께, clumped는 핵 3 분리 중단을 얻기 위해 셀의 자당 방울) 한 번에 한 방향으로 슬라이드 코팅 각 정착 제를 기울이기 그리고 아니라 앞 뒤로입니다. 일단 준비, 표면 확산 핵 immunostained 관심사의 단백질에 붙일 레이블된 항 체와 수 고와 현미경 검사 법 (대표적인 예는 그림 1 과 그림 2에 표시 됩니다 다음 몇 군데. 그림 1 (A), 핵 포함 균등...

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 마우스 정모세포로부터 감수분열 염색체 도말 표본을 준비하여 수컷의 감수분열을 연구하는 것입니다. 이 방법은 감수분열 재조합과 염색체 분리를 조절하는 메커니즘에 관한 생식 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 감수분열의 서로 다른 단계, 특히 전기 1의 세부 단계에 있는 정모세포 핵을 다량으로 얻을 수 있다는 점입니다.정세포핵을 슬라이드 위에 퍼뜨리는 데 사용되는 기술은 글로 전달하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 먼저, 출생 후부터 성체 단계의 수컷 마우스에서 적출한 한 쌍의 고환 무게를 측정하고, 측정된 시료를 차가운 저삼투압 추출 버퍼 몇 방울이 들어 있는 페트리 접시에 넣으십시오. 세정관을 적출하려면, 곡선 핀셋 끝으로 고환 하나를 접시 바닥에 고정하고, 일자 면도날을 사용하여 고환의 피막을 따라 수직으로 중앙선을 따라 작게 절개하십시오.두 번째 곡선 핀셋이나 일자 면도날을 사용하여 고환에서 세정관을 부드럽게 짜내어, 차가운 저삼투압 추출 버퍼 10 mL가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 이때 세정관과 함께 고환 낭 조각이 수집되지 않도록 주의하십시오. 모든 세정관을 수집한 후, 고환의 크기에 따라 30분에서 60분 동안 원추형 튜브를 얼음 위에 둡니다. 세정관을 배양하는 동안, 미리 세척한 슬라이드의 성에 낀 끝부분에 마우스 번호, 슬라이드 번호 및 날짜를 표시하고, 표시된 슬라이드를 고정액이 담긴 Coplin jar에 넣습니다.배양이 끝나면 세관들을 새로운 페트리 접시에 붓고, 세관들을 지름 약 3mm 크기의 덩어리로 나눕니다. 다음으로, 테플론 인쇄된 3링 슬라이드의 링 하나에 100 minimal 용액 또는 설탕 용액 23 µL를 넣고, 세관 덩어리 하나를 해당 링에 추가합니다. 곡선 팁 핀셋으로 덩어리를 고정한 상태에서, 11번 면도날을 사용하여 용액이 탁해질 때까지 세관을 조심스럽게 잘게 다집니다.용액이 흐려지면, 잔해물을 제거하고 sucrose 용액 23 µL를 링에 추가로 넣습니다. 마이크로 피펫을 사용하여 혼합물을 몇 번 부드럽게 피펫팅하여 현탁액 내의 세포들이 잘 분리되도록 합니다. 그런 다음 고정액에서 슬라이드를 꺼내 단지 위로 기울여 하단 모서리에 충분한 양의 방울 한 방울이 맺히게 합니다.액적의 크기가 충분하여 추가적인 세포 현탁액과 결합했을 때, 혼합물

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

핵 표면 퍼짐은 만피증 도중 염색체 사건을 공부하기 위한 필수적인 공구입니다. 여기서 우리는 제브라피쉬 정자세포로부터 의한 1단계 진행 중에 메오성 염색체를 준비하고 시각화하는 방법을 시연한다.

제브라피쉬 정자세포에서 메오틱 염색체 스프레드 의 준비

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

이 기사는 남성 감수 분열에 대한 귀중한 모델인 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통한 CENP-E의 생체 내 억제를 보고합니다. 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 CENP-E 억제가 마우스 정자세포에서 염색체 정렬 불량 및 게놈 불안정성을 초래한다는 것을 보여줍니다.

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

이 동영상은 마우스 splenocytes의 단일 셀 suspensions를 준비하는 gentleMACS의 Dissociator를 사용하여 자동 조직 분리에 대한 간단한 시간 절약 기법을 설명합니다.

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

학습하세요 마우스 정자세포에서 감수분열 염색체를 확산하는 방법을 통해 수컷 감수분열을 연구하세요. 이 기술은 다양한 감수분열 단계의 세포핵을 풍부하게 제공하여 재조합 및 염색체 분리 메커니즘을 분석합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

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