단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

이 방법은 항원의 특정 집단에 대한 TCR 알파 및 베타 레퍼토리뿐만 아니라 인간 TCR의 생체 내 기능과 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 PCR 반응의 상대적으로 높은 효율과 후속 TCR 클로닝과의 호환성입니다. 이 프로토콜은 TCR 염기서열에 대한 사전 지식 없이 단일 세포에서 TCR 알파 및 베타 사슬을 증폭하기 위해 2단계 PCR을 사용합니다.

첫 번째 PCR은 불변 영역에 대한 특이적 프라이머와 함께 알파 또는 베타 가변 영역 특이적 프라이머 풀을 사용하는 다중 반응입니다. 두 번째 PCR은 내부 불변 영역 서열뿐만 아니라 PCR 산물의 5 프라임 말단에 통합된 어댑터 서열에서 프라이밍하는 중첩 반응입니다. 이 뇌관은 또한 PCR 제품의 5개의 전성기 및 3개의 주요한 말단으로 유일한 금지 연속적인 클로닝을 촉진하기 위하여 위치를 편입합니다.

일단 template vector로 복제되면, 인코딩된 TCR 염기서열은 chimeric이며, 미러링 상수 영역이 있는 human variable region으로 구성됩니다. 키메라 TCR 구조체는 TCR과 미러링 CD3 신호 복합체 간의 상호 작용을 허용하여 이 TCR 클로닝 프로토콜이 미러링 세포주 및 인간화 마우스 모델의 후속 기능 연구와 호환되도록 합니다. 깨끗하고 템플릿이 없는 영역에서 역전사 시약을 준비하여 단일 세포 분류를 설정합니다.

일반적으로 단일 세포 PCR 방법을 처음 접하는 개인은 낮은 수준의 템플릿으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 반면에, 멀티플렉스 중첩 PCR의 민감도는 낮은 수준의 템플릿 오염에 민감합니다. 따라서 PCR 반응을 설정할 영역을 철저히 청소해야 합니다.

알파 및 베타 사슬의 불변 영역에 특이적인 3개의 역 프라이머의 혼합물이 이 반응에 사용됩니다. 피펫팅 저장소에서 시약을 결합하여 역전사 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 10개의 추가 웰에 충분한 반응 혼합물을 만듭니다.

멀티채널을 사용하여 웰당 6마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 밀봉으로 접시를 느슨하게 덮고 접시를 얼음 위에 보관하십시오. 세포 표면 마커에 대한 항체로 세포를 염색하여 단일 세포 분류를 위해 T 세포를 준비합니다.

웰당 세포를 한 번에 분류하고 12열은 비워 두면 음성 대조군 역할을 합니다. 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 섭씨 4도에서 5분 동안 1000g으로 회전합니다. 즉시 역전사 반응을 실행합니다.

가능하면 같은 날 첫 번째 PCR 반응을 실행합니다. 멀티플렉스 반응을 실행하려면 피펫팅 저장조에서 V alpha 및 V beta PCR 마스터 믹스를 별도로 혼합합니다. cDNA가 있는 플레이트를 얼음이나 차가운 블록에 보관하십시오.

22.5마이크로리터의 TCR 베타 반응을 새로운 96웰 피스 PCR 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 다중 채널을 사용하여 2.5마이크로리터의 cDNA를 PCR 플레이트로 전달합니다. 멀티채널을 사용하여 22.5마이크로리터의 TCR 알파 반응을 나머지 cDNA가 포함된 플레이트에 직접 피펫팅합니다.

접착제로 플레이트를 밀봉하고 부드럽게 와류를 일으키고 잠시 회전합니다. 첫 번째 PCR 반응을 실행합니다. 접시는 섭씨 20도에서 보관할 수 있습니다.

다음 날, 두 번째 중첩 PCR 반응을 준비합니다. 멀티채널을 사용하여 웰당 22.5마이크로리터의 속도로 TCR 알파 및 TCR 베타 반응을 위한 마스터 믹스를 두 개의 새로운 96웰 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 웰당 2.5마이크로리터에서 멀티플렉스 PCR 반응 템플릿을 추가합니다.

플레이트를 밀봉하고 부드럽게 소용돌이치며 잠시 회전합니다. 나머지 첫 번째 PCR 반응은 밀봉하고 섭씨 20도에서 보관하여 백업 템플릿의 소스로 사용해야 합니다. 두 번째 PCR 반응을 수행합니다.

두 번째 중첩 PCR 반응이 완료된 후 1% 아가로스 겔에 5마이크로리터의 반응을 실행합니다. positive 및 negative control well을 포함합니다. 예상 대역은 약 500 염기쌍 크기에서 실행되어야 합니다.

96-well 형식의 PCR 정제 키트를 사용하여 두 번째 반응의 나머지 부분인 20마이크로리터를 정제하고 Sanger 염기서열분석을 수행합니다. 얻어진 TCR 염기서열은 온라인에서 사용 가능한 면역유전학 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다. 염기서열 정보는 T 세포 집단의 레퍼토리와 클론성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

쌍을 이룬 TCR 알파 및 베타 염기서열은 추가 기능 분석에 사용할 수 있습니다. TCR beta 및 TCR alpha를 템플릿 벡터에 연속적으로 접합합니다. 주형 TCR beta 및 TCR alpha는 PCR 증폭 사슬로 대체됩니다.

첫 번째 결찰에서 템플릿 TCR 베타는 PCR 증폭 베타 사슬로 대체됩니다. test-digest insequenceing으로 TCR beta의 성공적인 삽입을 확인한 후 템플릿 TCR alpha를 PCR 증폭 알파 사슬로 교체합니다. HEK293T cell은 성공적인 TCR chain pairing 및 cell surface expression을 테스트하는 데 사용됩니다.

HEK293T 세포는 ametrine fluorescent reporter로 표시된 TCR 벡터 및 GFP로 표시된 CD3 복합체를 인코딩하는 벡터와 함께 transfection됩니다. 키메라 TCR의 표면 발현은 anti-mouse CD3 항체로 세포를 염색하여 유세포 분석으로 검증합니다. 키메라 TCR 구조체로 transfection된 세포의 표면 CD3 발현 수준은 fully mirroring control template vector로 transfection된 수준과 유사해야 합니다.

요약하면, 우리는 단일 세포에서 쌍을 이루는 TCR 사슬의 식별 및 복제를 위한 효율적인 PCR 기반 프로토콜에 대해 설명했습니다. 우리는 이것이 자가면역, 종양 감시 및 병원체 제거에서 인간 T 세포 반응을 연구하는 데 유용한 도구가 될 것으로 기대합니다. 여기에 설명된 PCR 프로토콜의 주요 장점은 후속 시험관 내 및 생체 내 연구와의 호환성입니다.