Name: 단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 학습하세요 단일 세포 TCR 알파 및 베타 사슬 증폭과 레트로바이러스 벡터 생성 방법을 통해 인간 TCR의 생체 내 기능을 연구하는 효율적인 면역학 프로토콜입니다.

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이 연구는 JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, 이다 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 파일럿 PJ, 그리고는 로버트와 제 니스 맥 네 어 재단에 의해 투자 되었다.
우리는 산드라 페 냐와 Andrene 맥도날드 환자 모집, 새뮤얼 블 럼 박사 조지 Makedonas 항 체 및 제어 PCR 최적화에 사용 하는 DNA의 선물에 대 한 기술 지원에 대 한 감사.

1. 관심의 T 세포 인구를 식별.
 참고: 항 원 자극에 대 한 응답에서 그들의 확산을 기반으로 항 원 (Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르, CFSE) 처럼 세포 분열 염료와 함께에서 특정 확산 T 세포를 분리 사용할 수 있습니다. PBMCs에서 시작 하는 경우 7 일에서 체 외에 확장은 항 원 특정 CFSE 낮은 인구 12를 식별 하기 위해 충분 해야 한다.
<ol><li>믹스 PBMCs 일치 하는 MHC 피더 세포와 라벨 5 µ M CFSE 세포 분열 염료와 1:1.</li>
	<li>접시 2-2.5 x 10 5 셀 잘 당 96 잘 라운드-하단에 문화 접시 200 µ L 10 %FCS 완전 한 RPMI 미디어에. 
	참고: 완전 한 RPMI 포함 2 m m l-글루타민, 나트륨 pyruvate 1 m m, 100 µ M MEM 불필요 한 아미노산, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 2-mercaptoethanol의 단위, 100ml U &#8722; 1 페니실린과 100 µ g mL &#8722; 1 스.</li>
	<li>25 µ M 펩 티 드 항 원 가진 세포를 자극.</li>
	<li>문화의 4 번째 날에 신중 하 게 제거 하 고 대체 미디어의 100 µ L. 
	참고: T 세포 항 원 특정 식별에 대 한 더 최적의 접근 펩 티 드-HLA tetramers 13의 사용 이다. HLA-제한 뿐 아니라 항 원 특이성의 동시 평가 허용 tetramer 얼룩.</li>
</ol> 2. 단일 셀 정렬 설정.
<ol><li>수행 후드 또는 지정 된 영역에서 모든 절차는 증폭 된 서식 파일의 무료. Aliquot을 피하기 위해 오염, 시 약 모든 작업 표면 청소 및, 경우, 10%와 장비 PCR 설치 전에 표 백제. 사용 하 여 필터 팁, RNAse와 DNAse 무료 시 약 및 모든 PCR 및 벡터 클로닝 단계에서 플라스틱. 주요 시 약 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다. 
	참고: 다중 PCR 반응이 매우 민감한 및 오염 물질의 낮은 수준이 증폭된 제품에서 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>생성 10 RT 반응 배를 결합 하 여 반전 녹음 방송 마스터 믹스 버퍼, 25 X DNTPs, 9 U RT 효소, 0.01 %0.7 U RNAse 억제제, 트리톤 X 383 및 살 균 pipetting 저수지에서 (표 1에 나열 된) 각 RT TCR 뇌관의 nM. 각 96 잘 접시 메이크업 10 추가 반응 (전체 106)에 대 한 충분 한 마스터 믹스 pipetting 동안 액체의 손실에 대 한 보상. 반응의 구성 요소와 잘 당 금액 표 2를 참조 하십시오.</li>
	<li>준비 96 잘 PCR 컬렉션 플레이트 멀티 채널 피 펫 잘 당 반전 녹음 방송 마스터 믹스의 pipetting 6 µ L에 의해 정렬 셀. 얼음 이나 차가운 블록 플레이트를 유지.</li>
	<li>세포 표면 마커 (등 CD4, CD3, 또는 CD8 CD3, 각각 2 µ g/mL, 세포 분열 염료 또는 tetramer 얼룩이 함께)에 항 체와 함께 셀 라벨.</li>
	<li>정렬 T 세포에서 셀 음, 부정적인 컨트롤 될 것입니다 12 행을 건너뛰는 당. 
	참고: 정렬의 효율성 뿐만 아니라 셀과 cDNA 반응 전에 낮은 온도에 번호판 플레이트 홀더 내의 정확한 컬렉션 판 정렬에 따라 달라 집니다. 컬렉션 접시 보관 한다 얼음에 항상 제외 하 고 정렬 때 냉각 플레이트 내에서 해결 하는 동안. 모든 종류로 온도 조절된 플레이트 홀더; 장착 그러나, 하나의 사용이 좋습니다. 종류는 일반적으로 접시 당 약 10-15 분 소요, 이후 있다 RNA 저하에 대 한 증가 잠재력 접시 낮은 온도에서 유지 되지 않습니다.</li>
	<li>긍정적인 컨트롤로 추가 (100 셀)의 많은 수 수동으로 피 펫과 우물 중 하나를이 단계에서. 또는, 이전 절연 풀링된 세포에서 RNA에서 사용하실 수 있는 긍정적인 제어로 10 ng 잘 당. 
	참고: 정화 제어 RNA 정밀 플라스틱 및 다른 우물과 거짓 긍정적인 결과의 상호 오염을 피하기 위하여 신경.</li>
	<li>접착제 필름, 격판덮개 및 4에서 5 분 동안 1000 x g에서 스핀 다운 ° c.</li>
	<li>즉시 녹음 RNA cDNA를 10 분, 45 분 동안 37 ° C에서 25 ° C에서 접시를 배양 하 여 10 분에 85 ° c 
	참고: 효율적인 PCR 반응 되도록 첫 번째 PCR 반응 같은 날 수행 될 것이 좋습니다. 또는, 베낀된 접시 보관 하실 수 있습니다-80 ° C에서 최대 2 개월.</li>
</ol> 3. 멀티플렉스 중첩 PCR 수행 참고: 오염을 피하기 위하여 템플릿-무료 깨끗 한 지역에서 모든 마스터 믹스 준비.
<ol>각 reconstitute <li>가변 지역 뇌관 DNAse과 RNAse 무료 H 2 o. 100 µ M 다음, 20 µ L V-알파 뇌관 풀 생성 하 44 뇌관의 각각의 결합. V-베타 생성 뇌관 풀 20 µ L 40 V-베타 뇌관의 각각 플러스 DNAse과 RNAse 무료 H 2 o. 뇌관 순서는 표 1에 나와 있습니다 80 µ L의 결합. 풀링, 일단 믹스에 각 뇌관의 농도 2.3 µ M.</li>
	<li>DNAse 100 µ M 재고 솔루션을 일정 지역 뇌관 reconstitute 자유롭고 RNAse H 2 o. Dilute 10 µ M 작업 솔루션을 사용 하기 위해 약 수 상수 지역 뇌관.</li>
	<li>는 TCR 알파와 베타 TCR 확대를 위한 두 개의 별도 마스터 믹스를 준비합니다. 5 X를 결합 하 여 믹스 마스터를 생성, 80 µ M dNTPs, 3 %DMSO, 2 µ M 뇌관 수영장 버퍼 (46의 최종 농도 각 뇌관에 대 한 nM), 200 nM TCR 상수 지역 역 뇌관, 1 U DNA 중 합 효소, 그리고 DNAse과 RNAse 무료 H 2 O (표 2 < / >). Pipetting 동안 액체의 손실을 보상 하기 위해 10 추가 반응 (전체 106)에 대 한 충분 한 마스터 믹스 메이크업 각 96 잘 접시. 
	참고: 계산 기반 22.5 µ L 마스터 PCR 혼합 2.5 µ L cDNA 서식 파일을 함께 잘 당 25 µ L의 최종 PCR 볼륨.</li>
	<li>얼음 또는 차가운 블록에서 cDNA와 플레이트를 유지합니다. 멀티 채널을 사용 하 여 새로운 96-잘 PCR 격판덮개로 TCR 베타 반응의 22.5 µ L 플라스틱. 다음 PCR 접시에 cDNA의 2.5 µ L를 전송 하는 멀티 채널을 사용 하 여.</li>
	<li>는 멀티 채널을 사용 하 여 포함 하는 cDNA의 나머지 접시에 직접 TCR 알파 반응의 22.5 µ L 플라스틱.</li>
	<li>4 1000 x g 5 분에서 내려와 접착제, 부드럽게 소용돌이, 스핀 번호판 봉인 ° c.</li>
	<li>멀티플렉스 PCR 반응 다음 사이클 실행: 95 ° C에서 5 분 뒤에 20의 34 주기 s 95 ° C, 30에서 54 ° c, s 및 72 ° C에서 1 분 72에 7 분 뒤 ° c.</li>
	멀티플렉스 PCR 혼합물의 2.5 µ L를 사용 하 여 템플릿으로 <li>수행 25의 마지막 볼륨에 중첩 된 PCR 반응 밖으로 µ L
	<ol><li>100 µ m와 DNAse과 RNAse 무료 H 2 o. 확인 10 µ M aliquots 작업 사진에 대 한 내부와 어댑터 뇌관 reconstitute.</li>
		<li>는 TCR 알파와 베타 TCR ampl에 대 한 두 개의 별도 마스터 믹스를 준비ification입니다. 믹스 5 버퍼 25 X DNTP, 3 %DMSO, 200 nM 앞으로 어댑터 뇌관, 200 nM 역 중첩 된 뇌관, 1 U DNA 중 합 효소와 DNA 중 합 효소, nuclease 무료 H X 22.5 µ L (표 2)의 최종 볼륨에 대 한 2 O. 에 대 한 각 96 잘 접시 메이크업 10 추가 반응 (전체 106)에 대 한 충분 한 마스터 믹스 pipetting 동안 액체의 손실에 대 한 보상. 
		참고: 두 번째 PCR 반응 사용에서 5 X PCR 버퍼 agarose 젤 로드를 촉진 하기 위하여 포함 된 로드 염료.</li>
		<li>는 멀티 채널을 사용 하 여 두 개의 새로운 96-잘 PCR 접시에 잘 당 22.5 µ L에서 TCR 알파와 TCR 베타 반응에 대 한 마스터 믹스 플라스틱.</li>
		<li>잘 당 2.5 µ L에서 다중 PCR 반응 템플릿 추가. 
		참고: 나머지 첫 번째 PCR 반응 해야 봉인, 하 고 필요한 경우 추가 서식 파일의 원본으로-20 ° C에 저장 (4.3 참고 단계 참조).</li>
		<li>인감 플레이트, 부드럽게 소용돌이, 그리고 스핀 다운 1000 x g 5 분에서 4 ° c.</li>
		<li>중첩된 PCR 반응 다음 사이클 실행: 95 ° C에서 5 분 뒤에 20의 34 주기 95 ° C, 30에서 s s 56 ° C에서 72 ° C에서 1 분에 72 7 분 다음 ° c.</li>
		<li>1 %agarose 밖으로 최종 반응의 실행 5 µ L 젤 포함 ethidium 평범한 사람 (를 포함 하 여 부정과 긍정적인 제어 우물). 
		참고: 예상된 밴드는 약 500 bp 크기에서 실행 해야 합니다. 예제 반응을 그림 2에 표시 됩니다.</li>
		<li>96 잘 형식 PCR 정화 키트를 사용 하 여 두 번째 반응 (20 µ L)의 나머지를 정화 하 고 70 ° C H 2 O 잘, 당 15 µ L 함께 elute 하 고, 수행 생어 시퀀싱. 적절 한 TCR 알파 또는 베타 TCR 어댑터 앞으로 뇌관을 사용 하 여 시퀀싱 (표 1). 
		참고: 시퀀스는 온라인 사용 가능한 immunogenetics 소프트웨어와 함께 분석할 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 4. 알파와 베타 PCR 체인 하위 복제.
 참고: 첫 번째 반응에서 앞으로 프라이 머 및 두 번째 PCR 반응에서 역방향 뇌관의 풀 제한 사이트를 통합 하는 데 사용 됩니다. 따라서, 얻은 알파와 베타 체인 PCR 제품은 순차적으로 하위 템플릿 retroviral 벡터 ( 그림 1)에 복제 될 준비가.
베타에서 <ol><li>다이제스트 순화 PCR 제품 중첩 반응 BstbI와 MfeI (표 3). 
	참고: 5 µ g 삽입을 초과 하지 마십시오.</li>
	<li>병렬로 소화 BstbI와 MfeI (표 3) 서식 파일 벡터. TCR 당 서식 파일 벡터의 1-2 µ g를 사용 합니다. Agarose 젤에 소화 벡터를 실행 하 고 큰 밴드 (~ 7500 bp)를 분리 합니다. DNA 정제 키트 젤 벡터 정화. 
	참고: 제한 효소 다이제스트 동안 템플릿 murine TCR 베타 변수 지역의 제거 되 인간의 TCR 베타 변수 영역의 추가 대 한 허용.</li>
	<li>PCR 정화 키트를 사용 하 여 소화 PCR 제품을 정화. 
	참고: 확인; 키트에 포함 된 열의 DNA 정화 능력 여러 열을 사용 하 여 필요한 경우. 순화 삽입 성공적인 결 찰 반응에 필요한 최소 금액은 50 ng 10 ng / µ L의 최소 농도에. 순화 삽입 금액 성공적인 결 찰에 대 한 충분 하지 않은 경우 두 번째 PCR 반응을 반복 될 수 있다.</li>
	<li>열 비활성화 75에서 10 분 뒤 각자 결 찰을 방지 하기 위해 37 ° C에서 10 U CIP 효소 1 h에 대 한 서식 파일 벡터 치료 ° C. Purify DNA PCR 정화 키트 (표 3).</li>
	<li>Ligate TCR-베타 삽입 하 고 실 온에서 30 분 동안 삽입의 6 어 금 니 과잉에서 20 µ L 총 볼륨에 DNA 리가 사용 하 여 벡터. 
	참고: 총, 결 찰 반응 해야 포함 약 150 ng의 DNA (표 3).</li>
	<li>변환, 화학적으로 유능한 대장균 DH5α 세포 (자료 테이블)의 80 µ L로 결 찰 반응의 8 µ L를 혼합 하 고 30 분 45 미 추가 500 µ L 42 ° C에서 열 충격에 대 한 얼음에 품 어 슈퍼 Catabolite 억제 (S.O.C.) 매체와 쉐이크 1.5 h 37에 대 한 최적의 국물 ° c.</li>
	<li>판 250 개 µ L 세균성 문화 Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지를 포함 하는 암 피 실린에의. 하룻밤 플레이트 (~ 16 h) 37 품 어 ° c.</li>
	<li>다음날 세균성 식민지를 선택 하 고 3 mL 파운드 매체 암 피 실린을 포함 하는 것은 하룻밤 사이에 그들을 자라. DNA 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 플라스 미드 DNA 분리.</li>
	<li>는 BstbI 및 MfeI 금지 효소로 소규모 테스트 다이제스트 베타 체인의 성공적인 삽입을 확인합니다. 12 µ L 총 반응 볼륨에 결합 200-500 µ g 플라스 미드 DNA, 각 효소의 0.25 µ L 10 X 효소 버퍼 (표 3). Ethidium 평범한 사람 삽입 밴드의 크기를 확인 하려면 포함 하는 1 %agarose 젤에 반응 밖으로 실행 (~ 500 bp).</li>
	<li>IRES 역방향 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 벡터의 TCR 베타 섹션 순서는 삽입의 존재를 확인 한 후.</li>
	<li>알파 변수 영역의 삽입에 대 한 비슷한 프로세스를 수행 하는 TCR-베타 삽입의 시퀀스 확인. 알파 중첩 된 반응, 그리고 벡터, SnaBI와 SacII를 포함 하는 새로 생성 된 TCR 베타 삽입에서 순화 된 PCR 제품을 소화. 
	참고: 제한 효소 다이제스트 동안 템플릿 murine TCR 알파 변수 지역의 제거 인간의 TCR 알파 변수 영역의 추가 대 한 허용.</li>
	<li>Ligate 알파 실 온에서 30 분 동안 삽입의 6 어 금 니 과잉에서 20 µ L 총 볼륨에 DNA 리가 사용 하 여 해당 베타 가변 영역을 인코딩 하는 TCR 벡터에 삽입. 
	참고: 총, 결 찰 반응 해야 포함 약 150 ng의 DNA (표 3).</li>
	<li>변환, 화학적으로 유능한 대장균 DH5α 세포 (자료 테이블)의 80 µ L로 결 찰 반응의 8 µ L를 혼합 하 고 30 분 45 미 추가 500 µ L S.O.C. 42 ° C에서 열 충격에 대 한 얼음에 품 어 매체와 쉐이크 1.5 h 37에 대 한 ° C.</li>
	<li>판 250 개 µ L 세균성 문화 Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배지를 포함 하는 암 피 실린에의. 하룻밤 플레이트 (~ 16 h) 37 품 어 ° c.</li>
	<li>다음날 세균성 식민지를 선택 하 고 3 mL 파운드 매체 암 피 실린을 포함 하는 것은 하룻밤 사이에 그들을 자라. DNA 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 플라스 미드 DNA 분리.</li>
	<li>소규모 테스트-다이제스트 제한 효소 SnaBI 및 SacII 알파 체인의 성공적인 삽입을 확인합니다. 12 µ L 총 반응 볼륨에 결합 200-500 µ g 플라스 미드 DNA, 각 효소의 0.25 µ L 10 x 효소 버퍼 (표 3). Ethidium 평범한 사람 삽입 밴드의 크기를 확인 하려면 포함 하는 1 %agarose 젤에 반응 밖으로 실행 (~ 500 bp).</li>
	<li>삽입의 존재를 확인 한 후 MSCV2 앞으로 뇌관 (표 1)를 사용 하 여 벡터의 TCR 알파 섹션 순서.</li>
	<li>알파 체인 시퀀스의 유효성을 검사 하는 일단 TCR-베타-리버스 및 IRES 반전 뇌관 (표 1) 연속 완전 한 TCR 삽입 확인 합니다.</li>
</ol> 5. TCR 세포 표면 표현 및 특이성을 확인 합니다.
 참고: HEK293T 셀 성공적인 TCR 체인 커플을 테스트 하는 데 사용 됩니다ng와 세포 표면 식 ( 그림 3A) 8. 펩 티 드 MHC tetramer 얼룩도 수행할 수 있습니다 transfected HEK293T 세포 항 원 특이성 게시물 TCR 유전자 분리 ( 그림 3B)의 보존에 대 한 테스트.
각 새로운 TCR에 대 한 별도 우물을 지정 충분 한 세포 <ol><li>접시 당 1 mL 전체 DMEM 미디어 포함 5 %FCS, 잘 1 x 10 5 셀에서 12 음 조직 문화 접시와 문화 37에서 하룻밤에 HEK293T 세포 ° C. 접시 컨트롤 템플릿 TCR 벡터, CD3 벡터만, TCR 벡터, 그리고 비 페를 잘 제어. 
	참고: 템플릿 사용 하 여 완전히 마우스 TCR Transfection mCD3εγδζ pMIG 벡터, 혼자, mTCR pMIA 벡터와 결합에서 (mTCR-pMIA) 벡터와 mCD3εγδζ pMIG 벡터 혼자 긍정적이 고 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 
	참고: 완전 한 DMEM 포함 2 m L-글루타민, 1mm 나트륨 Pyruvate, 100 µ M m 비 필수 아미노산, 5 mM HEPES 버퍼, 10 -5 단위 2-mercaptoethanol, 100 U/ml 페니실린/스 x 5.5.</li>
	<li>다음 날 transfect 1 µ g 공상 h/mTCR-pMIA 벡터, 1 µ g 마우스 CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) 벡터와 liposome에 기초를 둔 transfection 시 약 제조업체 지침에 따라 셀.</li>
	<li>각 TCR 100 µ L 실내 온도, 혈 청 무료 DMEM 6 µ L transfection 시 약 추가. 짧게 소용돌이, 15 분에 대 한 실 온에서 품 어와</li>
	<li>별도 1.5 ml에서 튜브 결합 TCR pMIA 벡터의 1 µ g 1 µ g 마우스 CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) 벡터, 또는 컨트롤에 대 한 별도 각 벡터의 1 µ g.</li>
	<li>Dropwise, 벡터 DNA를 포함 하는 튜브를 transfection 시 약/DMEM 솔루션을 추가 합니다. 15 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>Dropwise, HEK293T 세포 transfection 시 약/DMEM/DNA 솔루션을 추가 합니다. 부드럽게 섞어 접시를 누릅니다. 24 h. 위해 37 ° C에서 품 어</li>
	<li>후 24 h는 미디어를 대체 하 고 셀 추가 24 헤에 대 한 문화를 유지</li>
	<li>활기찬 pipetting으로 접시에서 셀을 제거 하 고 얼룩 방지 마우스 CD3 항 체 (2.5 µ g/mL) 공상 TCR의 표면 표현 cytometry에 의해 확인 된 셀.</li>
	<li>CD3 식 비슷한 수준, transfected 있던 세포 사이 비교 하기 위해 게이트 형광 기자 분자 (GFP, 복잡 한 c d 3에 대 한 그리고 TCR 식 벡터에 대 한 애)의 비슷한 높은 수준을 표현 하는 셀에 대 한 분석. GFP + 애 + 10 셀에 분석 해야 문이 하는 최적, 10 5 형광 강도 ( 그림 3A) 4. 
	참고: 공상 구조와 페 셀에서 CD3 식의 수준 컨트롤 마우스 (원래 템플릿) 벡터 ( 그림 3A)를 비교 해야 합니다. 생성 된 TCR retroviral 벡터는 앞에서 설명한 4 식 시스템 vivo에서 호환.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

현재 프로토콜에서 우리가 단일 셀 TCR 증폭 및 후속 하위 복제 쌍된 TCR 알파와 베타 체인의 템플릿 retroviral 식 벡터에 대 한 효율적인 방법을 설명 합니다. 비록, 여러 단 세포 PCR 프로토콜을 개발 하 고, 아무도 지금까지 있다 식 벡터에 즉시 하위 복제와 호환. 대부분의 경우, 높은 변수 CDR3 영역을 포괄 하는 부분 시퀀스는 증폭, 변수 영역을 추정 하는 것 충분 한 순서. 이 작은 PCR 제품 크기 높은 PCR 효율을 지원 하지만 드 노 보 TCR 유전자 합성 기능 연구 필요로 합니다. 현재 프로토콜 전체 변수 영역 복제에 대 한 적합을 포함 하는 더 긴 amplicon 저조한 동시에 이전에 게시 CDR3 중심 단일 셀 TCR 시퀀싱 프로토콜의 효율성을 유지 합니다. 따라서, 시스템 설명 주는 기능 출력 뿐만 아니라 양적 시퀀스에 증가 한 융통성이 있다.
해결 하는 과학적 질문에 따라 소스 및 분석 하는 T 세포의 특이성은 달라질 수 있...

T 세포 수용 체 (TCR) T 세포 운명 결정 개발, 안정 상태/항상성, 그리고 주변1,2,3항 원 자극 동안 지시. 깊은 기술을 시퀀싱의 최근 확장 이전 받는 TCR 다양성 내의 항 원 특정 한 T 세포 응답을 발견 했다. TCR 다양성 기능적으로 광범위 한 T 세포 응답에 대 한 잠재력을 제안합니다. TCR 시퀀스 레 퍼 토리 분석 TCR 기능적인 분석 실험, 통합 하려면 시퀀싱 방법 실험 시스템과 vivo 모델 선택의 후속 기능 분석에 대 한 활용에 호환 되도록 설계 되어야 한다 TCRs입니다. 우리 인간의 TCR 시퀀스 격리에 대 한 효율적인 접근 방식을 개발 하 고 하위 TCR 식 HLA humanized 쥐4와 호환 공상 인간/마우스 TCR 서식 파일 벡터에 클로닝 간소화. Heterodimeric TCRs의 해당 알파와 베타 체인의 절연 단일 셀에서 두 체인의 PCR 증폭을 해야합니다. 비록, 여러 단일 셀 TCR 복제 프로토콜 개발 되 고 활용, 아무도 지금까지 있다 높은 처리량 유선형 직접 복제의 알 수 없는 Vα/Vβ TCRs retroviral 벡터 재 식 vivo에서 필요한에 쉽게 호환 4,5,,67. 이전 연구 두 가지 주요 방법, 선택적으로 시퀀스를 추정 하거나 전체 TCR 시퀀스4,,56 증폭 충분 한 TCR의 일정된 부분을 증폭에 활용 , 7. 첫 번째 접근 방식을 통해 얻은 TCR 시퀀스의 하류 기능 분석 필요 비용 실리콘에 어셈블리와 드 노 보 의 건설에 TCR의. 두 번째 방법은 제공 하지만 완전 한 TCR 순서, 인간의 지속적인 지역 마우스 모델에서 복제 TCRs의 비보에 식이 호환 되지 않습니다. 우리의 접근 방식은 특히 vivo에서 기능 분석 TCRs의 마우스 모델에서 호환 되도록 설계 되었습니다. 우리는 효율적이 고 간소화 된 단일 셀 직접 서브 클로닝 PCR 파편의 템플릿 식 벡터에 대 한 수 PCR 프로토콜을 개발.
우리의 접근 방식을 매우 민감한 멀티 플렉스 중첩 PCR 반응이 두 단계에서 수행 되는 사용 합니다. 첫 번째 다중 반응에서 40 뇌관 모든 V 베타 체인에 대 한 특정의 수영장과 44 뇌관 V-알파 사슬 TCR 알파 또는 베타 TCR 시퀀스 (표 1)의 사전 지식 없이 증폭 하는 데 사용 됩니다 모든 특정의 수영장 단계. 앞으로 뇌관에는 5' PCR 제품의 통합 어댑터 시퀀스를 있다. 반전 뇌관 TCR의 일정 영역을 기반으로 합니다. 우리가 확인 독특한 제한 사이트 인간의 변수 또는 접합 TCR 지역에서 결 석 하 고 새로 디자인 된 TCRα 및 TCRβ 뇌관 (그림 1)에이 통합. 두 번째 중첩 된 반응에서 어댑터 시퀀스에 대 한 특정 뇌관 및 일정 지역 내에서 중첩 된 역방향 뇌관 TCR 체인으로 증가 (표 1, 그림 1) 증폭에 사용 됩니다. 단일 셀 격리 후 PCR의 라운드 2 (첫 번째 반응 Vα와 Vβ 뇌관의 풀과 함께 두 번째 어댑터 뇌관) 수 직접 하위 복제 될 템플릿 retroviral 벡터에 PCR 제품에서 결과. 단 하나 열려있는 독서 프레임 (ORF), 마우스 일정 지역 '자체 cleaving' 단백질 순서에 의해 연결 된와 함께 인간의 변수 영역에에서 최종 TCR 구문 인코딩할 것 이다 P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A 시퀀스 여러 시스템에서 사용 되 고 특히 TCRs8,9,,1011의 표현에 대 한 광범위 하 게 테스트 되었습니다. 비록, P2A 시퀀스 남아의 대부분에 연결 후 번역의 알파 사슬의 베타 체인 신호 순서는 추가 프롤린,이 수정 유연한 링커로 연결 C terminus는 TCR 기능에 해로운 영향을 주지 않습니다. 마우스 일정 지역 하류 신호 구성 요소와 잠재적인 변경된 상호 작용을 피하기 위해 인간 대신 구문에 사용 됩니다 때 다시 마우스 세포에 표현. 단일 ORF 알파와 베타 체인9,11의 화학 량 론 별도 식에서 발생 합니다. 현재 프로토콜 시 약 및 널리 사용할 수 있는, 접근에 근거 하 고 간소 하 고 효율적인 방식으로 수행 하도록 설계 되었습니다. 비록 우리가 구체적으로 TCRs self-reactive T 세포 자가 면역 당뇨병에 연루에서 분석 결과를이 기술을 사용, 우리는이 프로토콜 식별 및 인간의 TCRs 대 한 특정의 기능 평가 대 한 광범위 하 게 적용 될 수 있습니다 예상 면역 epitopes, 암 epitopes, 또는 병원 균 및 백신에 대 한 응답.

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp;</td><td>이바이오사이언스&nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>반인간 CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>항인간 CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD3 AF647</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>재조합 RNAse 억제제 생명공학 grd 2.5KU&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 고용량 cDNA RT 키트&nbsp;</td><td>인버추젠&nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT 효소)&nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: 뉴클레아제가 없는 물 1000mL</td><td>Invirtogen&nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA 중합효소 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 웰 하프 스커트 PCR 플레이트</td><td>Phoenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 투명 접착 필름&nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td></td><td></td>4306311</tr><tr><td>울트라퓨어 아가로스&nbsp;</td><td>인버추젠&nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩&nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U(삽입) 30 U(벡터)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (삽입) 80 U (벡터)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (인서트) 80 U (벡터)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (삽입) 80 U (벡터)</td></tr><tr><td>송아지 장 인산가수분해효소 (CIP)</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>퀵 리가제&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩&nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus는 DNA 정제 시스템을 최소화합니다&nbsp;</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps DNA 정제 시스템&nbsp;</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA 클린 & 집중 장치-25 키트</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA 클린 & 집중 장치-5 키트</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>서브클로닝 효율 DH5a 유능한 세포&nbsp;</td><td>써모피셔&nbsp;</td><td></td><td></td>18265017</tr><tr><td>Transit LT-1 시약 1mL (transfection 시약)</td><td>Mirus&nbsp;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (분류기)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (유세포 분석기)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 셀 tcr 고립과 retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 vivo에서 표현의 인간의 tcrs 간소화

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

단 T 세포에서 쌍체 T 세포 수용 체 (TCR) 알파와 베타 체인의 시퀀싱에 대 한 여러 가지 방법을 개발 되었습니다, 하지만 아무도 지금까지 왔다 TCR heterodimers의 기능 분석에 다운스트림 도움이 vivo에서 . 우리 인간의 TCR 알파와 베타 체인의 전체 변수 영역에 걸쳐 PCR 제품 귀착되는 2 단계 멀티 플렉스 중첩 PCR에 기반으로 하는 향상 된 프로토콜을 개발 했습니다. 식별 하는 고유한 제한 사이트 PCR 뇌관으로 그들을 통합 함으로써, 우리는 만들어 PCR 제품 템플릿 retroviral 벡터에 직접 하위 복제와 호환. 결과 retroviral 구조 공상 인간/마우스 TCR 마우스 셀에서 또는 vivo에서 마우스 모델에서 작동 되는 마우스 세포내 도메인으로 인코딩합니다. 전반적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 인간 단일 셀 쌍 TCR 알파와 베타 체인 식별 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 표현 위한 retroviral 벡터 쉽게 적응의 유선형된 세대와 결합 합니다. 중요 한 단계는 뒤 및 잠재적인 함정을 피할 수 있도록 비디오와 함께 제공 된 자료 PCR, 단일 셀의 매우 상세한 설명을 제공 하도록 설계 됩니다. 또한, 우리는 복제 식 벡터를 생성 하는 데 필요한 단계에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 일단 마스터, TCR 식 정렬 단일 셀에서 모든 절차는 짧은 2 주 기간에 수행 수 있습니다.

멀티플렉스 중첩 PCR 반응의 효율성 단계 3.2.7 (그림 2)는 agarose 젤에 두 번째 반응의 5µL에 밖으로 실행 하 여 확인 됩니다. 평균 TCR 베타 증폭의 효율 TCR 알파 반응의 효율은 일반적으로 낮은, 약 50%에서 80%, 약 될 것으로 예상 된다4. 만 쌍된 TCR 알파와 베타 TCR 사슬 TCR 식; 사용할 수 있습니다. 그러나, 모든 PCR 제품 TCR 시퀀스 및 레 퍼 토리 정보 시퀀싱 될 수 있습니다.
유전자 침묵만 주어진된 T 세포에 표현 될 하나의 TCR 베타 체인을 허용 합니다. 그러나, T 세포는 두번째 TCR 알파 사슬을 다시 정렬 하 고 T 세포의 약 25%는 14체인 두 번째 프레임에...

단일 셀 쌍 인간의 TCR 알파와 베타 체인 시퀀싱과 현재 프로토콜 결합 유선형 retroviral 벡터 생체 외에서 그리고 vivo에서 TCR 식와 호환의 세대.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

이 방법은 항원의 특정 집단에 대한 TCR 알파 및 베타 레퍼토리뿐만 아니라 인간 TCR의 생체 내 기능과 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 PCR 반응의 상대적으로 높은 효율과 후속 TCR 클로닝과의 호환성입니다. 이 프로토콜은 TCR 염기서열에 대한 사전 지식 없이 단일 세포에서 TCR 알파 및 베타 사슬을 증폭하기 위해 2단계 PCR을 사용합니다.첫 번째 PCR은 불변 영역에 대한 특이적 프라이머와 함께 알파 또는 베타 가변 영역 특이적 프라이머 풀을 사용하는 다중 반응입니다. 두 번째 PCR은 내부 불변 영역 서열뿐만 아니라 PCR 산물의 5 프라임 말단에 통합된 어댑터 서열에서 프라이밍하는 중첩 반응입니다. 이 뇌관은 또한 PCR 제품의 5개의 전성기 및 3개의 주요한 말단으로 유일한 금지 연속적인 클로닝을 촉진하기 위하여 위치를 편입합니다.일단 template vector로 복제되면, 인코딩된 TCR 염기서열은 chimeric이며, 미러링 상수 영역이 있는 human variable region으로 구성됩니다. 키메라 TCR 구조체는 TCR과 미러링 CD3 신호 복합체 간의 상호 작용을 허용하여 이 TCR 클로닝 프로토콜이 미러링 세포주 및 인간화 마우스 모델의 후속 기능 연구와 호환되도록 합니다. 깨끗하고 템플릿이 없는 영역에서 역전사 시약을 준비하여 단일 세포 분류를 설정합니다.일반적으로 단일 세포 PCR 방법을 처음 접하는 개인은 낮은 수준의 템플릿으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 반면에, 멀티플렉스 중첩 PCR의 민감도는 낮은 수준의 템플릿 오염에 민감합니다. 따라서 PCR 반응을 설정할 영역을 철저히 청소해야 합니다.알파 및 베타 사슬의 불변 영역에 특이적인 3개의 역 프라이머의 혼합물이 이 반응에 사용됩니다. 피펫팅 저장소에서 시약을 결합하여 역전사 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 10개의 추가 웰에 충분한 반응 혼합물을 만듭니다.멀티채널을 사용하여 웰당 6마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 밀봉으로 접시를 느슨하게 덮고 접시를 얼음 위에 보관하십시오. 세포 표면 마커에 대한 항체로 세포를 염색하여 단일 세포 분류를 위해 T 세포를 준비합니다.웰당 세포를 한 번에 분류하고 12열은 비워 두면 음성 대조군 역할을 합니다. 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 섭씨 4도에서 5분 동안 1000g으로 회전합니다. 즉시 역전사 반응을 실행합니다.가능하면 같은 날 첫 번째 PCR 반응을 실행합니다. 멀티플렉스 반응을 실행하려면 피펫팅 저장조에서 V alpha 및 V beta PCR 마스터 믹스를 별도로 혼합합니다. cDNA가 있는 플레이트를 얼음이나 차가운 블록에 보관하십시오.22.5마이크로리터의 TCR 베타 반응을 새로운 96웰 피스 PCR 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 다중 채널을 사용하여 2.5마이크로리터의 cDNA를 PCR 플레이트로 전달합니다. 멀티채널을 사용하여 22.5마이크로리터의 TCR 알파 반응을 나머지 cDNA가 포함된 플레이트에 직접 피펫팅합니다.접착제로 플레이트를 밀봉하고 부드럽게 와류를 일으키고 잠시 회전합니다. 첫 번째 PCR 반응을 실행합니다. 접시는 섭씨 20도에서 보관할 수 있습니다.다음 날, 두 번째 중첩 PCR 반응을 준비합니다. 멀티채널을 사용하여 웰당 22.5마이크로리터의 속도로 TCR 알파 및 TCR 베타 반응을 위한 마스터 믹스를 두 개의 새로운 96웰 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 웰당 2.5마이크로리터에서 멀티플렉스 PCR 반응 템플릿을 추가합니다.플레이트를 밀봉하고 부드럽게 소용돌이치며 잠시 회전합니다. 나머지 첫 번째 PCR 반응은 밀봉하고 섭씨 20도에서 보관하여 백업 템플릿의 소스로 사용해야 합니다. 두 번째 PCR 반응을 수행합니다.두 번째 중첩 PCR 반응이 완료된 후 1% 아가로스 겔에 5마이크로리터의 반응을 실행합니다. positive 및 negative control well을 포함합니다. 예상 대역은 약 500 염기쌍 크기에서 실행되어야 합니다.96-well 형식의 PCR 정제 키트를 사용하여 두 번째 반응의 나머지 부분인 20마이크로리터를 정제하고 Sanger 염기서열분석을 수행합니다. 얻어진 TCR 염기서열은 온라인에서 사용 가능한 면역유전학 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다. 염기서열 정보는 T 세포 집단의 레퍼토리와 클론성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.쌍을 이룬 TCR 알파 및 베타 염기서열은 추가 기능 분석에 사용할 수 있습니다. TCR beta 및 TCR alpha를 템플릿 벡터에 연속적으로 접합합니다. 주형 TCR beta 및 TCR alpha는 PCR 증폭 사슬로 대체됩니다.첫 번째 결찰에서 템플릿 TCR 베타는 PCR 증폭 베타 사슬로 대체됩니다. test-digest insequenceing으로 TCR beta의 성공적인 삽입을 확인한 후 템플릿 TCR alpha를 PCR 증폭 알파 사슬로 교체합니다. HEK293T cell은 성공적인 TCR chain pairing 및 cell surface expression을 테스트하는 데 사용됩니다.HEK293T 세포는 ametrine fluorescent reporter로 표시된 TCR 벡터 및 GFP로 표시된 CD3 복합체를 인코딩하는 벡터와 함께 transfection됩니다. 키메라 TCR의 표면 발현은 anti-mouse CD3 항체로 세포를 염색하여 유세포 분석으로 검증합니다. 키메라 TCR 구조체로 transfection된 세포의 표면 CD3 발현 수준은 fully mirroring control template vector로 transfection된 수준과 유사해야 합니다.요약하면, 우리는 단일 세포에서 쌍을 이루는 TCR 사슬의 식별 및 복제를 위한 효율적인 PCR 기반 프로토콜에 대해 설명했습니다. 우리는 이것이 자가면역, 종양 감시 및 병원체 제거에서 인간 T 세포 반응을 연구하는 데 유용한 도구가 될 것으로 기대합니다. 여기에 설명된 PCR 프로토콜의 주요 장점은 후속 시험관 내 및 생체 내 연구와의 호환성입니다.

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 체세포 핵 전송 (SCNT)를 통해 epigenetic 프로그래밍이 사전 정의된 T 세포 수용체 (TCR) specificities와 마우스 모델을 생성하는 도구로 사용할 수 여기를 보여줍니다. 이러한 transnuclear 생쥐는 내생 모터의 제어하에 자신의 내생 로커스에서 해당 TCR을 표현.

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

우리는 단일 T 세포 수용체(TCR) 레트로바이러스 기반 생체 내 발현 시스템을 위한 빠르고 유연한 프로토콜을 제시합니다.  레트로바이러스 벡터는 골수 전구 세포를 transduction하여 TCR 형질전환 마우스의 대안으로 in vivo에서 단일 TCR의 T 세포 발달 및 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 생산과 쥐 T 세포 transduction을 간소화하여 마우스 CAR-T 세포의 효율적인 생성을 촉진합니다.

Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

우리는 수용체 매개 장기 및 미세환경 특이적 림프구 위치를 연구하기 위해 트래픽 수용체의 레트로바이러스 전달과 경쟁적 귀환을 위한 개선된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 면역 세포 이동 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며 향후 기초 및 치료 연구에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

다양한 조직 미세환경에서 GPCR 매개 T 세포 국소화 연구를 위한 효율적인 레트로바이러스 형질도입 및 경쟁력 있는 호밍(Competitive Homing)

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

이 프로토콜은 mRNA 전기천공에 의한 일차 T 세포의 분리, 활성화, 증식, 일시적 형질전환 등 원차 T 세포 배양의 필수 단계를 설명합니다. 또한, 표현형, 활성화 마커, 생존 가능성 및 키메라 항원 수용체(CAR) 발현의 유동 세포 분석을 위한 워크플로우 및 항체 패널도 제안됩니다.

1차 인간 T 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법

학습하세요 단일 세포 TCR 알파 및 베타 사슬 증폭과 레트로바이러스 벡터 생성 방법을 통해 인간 TCR의 생체 내 기능을 연구하는 효율적인 면역학 프로토콜입니다.

단일 셀 TCR 고립과 Retroviral 벡터 생체 외에서 의 생성과 Vivo에서 표현의 인간의 TCRs 간소화

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