Name: 미국 황소 개구리의 Sacculus (헤어 세포의 생리 준비 모이 catesbeiana) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 배우세요 미국 황소개구리의 sacculus를 분리하여 모발세포 생리학 연구를 위한 생물물리학적 실험을 수행하는 방법을. 이 기법은 감각신경과학에서 청각 및 평형감각 메커니즘을 탐구하는 데 활용됩니다.

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저자는 이 논문에 설명된 제제를 개발하는 데 자금을 지원하고 전문 지식을 제공한 A. J. Hudspeth 박사에게 감사를 표합니다. 또한 이 프로토콜에 사용되는 많은 맞춤형 장비와 소프트웨어를 만들고 유지 관리해 주신 Brian Fabella에게 감사드립니다.
J. B. A.는 그랜트 F30DC014215, J. D. S.는 그랜트 F30DC013468, J. B. A.와 J. D. S.는 모두 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 그랜트 T32GM07739로 지원됩니다.

윤리 정책 : 모든 절차는 록펠러 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 사전 실험 Prespanparation <ol><li> 솔루션 <ol><li> 유게 놀 솔루션을 준비 (2.5 g · L -1 · kg -1 개구리). 식염수 용액 (표 1)을 준비합니다. 참고 : 하나의 챔버 준비를 들어, 인공 외 림프를 준비; 두 챔버 준비를 위해, 인공 외 림프 및 인공 림프을 모두 준비합니다. </li></ol></li></ol> 2. 실험 도구 <ol><li> 자극 유리 섬유의 제조 <ol><li> 고온과 높은 속도로 한 줄 당김의 전극 풀러와 붕규산 유리 모세관을 좁 힙니다. 솔레노이드 구동 풀러에 뽑아 모세관을로드합니다. </li><li> 유리 비드 필라멘트쪽으로 모세관의 끝 부분을 가지고모세관 콘택트 유리 비드까지 용융 상. </li><li> 유리 구슬로 모세관의 끝 부분을 용융 필라멘트를 켭니다. 모세관과 구슬 사이의 유리 형태의 얇은 다리되면, 필라멘트 전원을 끄고 같은시기에 솔레노이드 풀러를 활성화합니다. 참고 :이 긴 축에 직각으로 유리 모세관을 당겨 단단한 섬유를 생성합니다. </li><li> 섬유의 직경이 더 이상 0.5 있는지 확인 - 1 ㎛는 그 길이가 100을 초과하지 않는 - 300 μm의. 섬유의 길이가이 치수를 초과하는 경우, 홍채 가위를 트리밍. 이미 해부 도구의 손상을 방지 할 수 둔한 있습니다 가위를 사용합니다. </li><li> 광학 대비를 향상시키기 위해 코트를 섬유 스퍼터. 금 - 팔라듐 소스와 스퍼터 코터를 사용합니다. 수직 원본으로의 테이퍼 끝 스퍼터 코터로 각 섬유를로드합니다. 금 - 팔라듐 소스에서 2cm - 하나의 거리에 섬유의 팁을 가져옵니다. </li><li> 닫습니다시일을 형성하고 전원을 켜 코터의 챔버를 스퍼터. 반복 아르곤으로 주변 공기를 세척합니다. 공기 세척 한 후, 10 파 (70 mTorr 이하)을 챔버 내의 압력을 감소시킨다. </li><li> 120 s의 과정을 통해 10 초 지연으로 10 초 펄스에서 코트를 스퍼터. 주 : 스퍼터 코팅이 성공하면 섬유의 끝이 프로토콜의 지속 시간 동안 어둡게된다. </li></ol></li><li> 날카로운 미소 전극의 제조 <ol><li> 한 줄 높은 열 풀을 사용하여 내부 필라멘트와 유리 모세관을 당겨. 3 M KCl을 가득 때 300 MΩ - 전극 (100)의 저항이 있어야합니다. 3 M KCl을 각 전극을 입력합니다. </li><li> 앰프의 headstage (16)에 장착 할 때 벤드는 microforge 각 전극의 끝은 머리 세포 혀끝의 표면이 수직 렌더링합니다. </li></ol></li><li> 이온 토 포레 시스 피펫의 준비 <ol><li> 내부에 유리 모세관을 당겨50 MΩ 팁 필라멘트. 농축 용질 (예를 들어, 500 밀리미터가 황산 젠타 마이신)를 입력합니다. </li></ol></li><li> 알루미늄 장착 광장의 준비 <ol><li> 알루미늄 호일의 1cm X 1cm 사각형을 잘라. pithing로드 또는 다른 날카로운 물체의 끝 중앙에 호일을 관통. 그것은 원형 직경 약 1mm가되도록 관통 구멍을 형성. </li></ol></li><li> 진공 그리스 충전 된 주사기의 준비. <ol><li> 5 ML의 주사기에서 플런저를 제거합니다. 진공 그리스와 뒷면에서 주사기를 입력합니다. 플런저를 교체합니다. </li></ol></li><li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 접착제 도포의 준비 <ol><li> 나무 주걱 스틱의 끝 부분으로 잘라 2mm 긴 축합니다. 최종에서 볼 때 슬릿은 어플리케이터의 중심에 있어야합니다. </li><li> 예리한 가위 면도날, 1mm 두께의 시트로부터 폴리 테트라 플루오로 에틸렌의 2mm X 4mm 사각형을 잘라. </l난&gt; <li> 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 사각형의 2mm 길이의 가장자리의 얇은 하나 면도날을 사용합니다. 직사각형의 중앙에서 시작하여, 구형의 선단부에 경사면을 형성하는 외측 슬라이싱하여 직사각형의 두께를 감소시킨다. </li><li> 경사 날 멀리 스틱에서 향하도록 나무 주걱 슬릿에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 사각형을 삽입합니다. 제자리에 고정하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 직사각형의베이스에 5 분 에폭시를 적용한다. 접착제의 도포는, 실온에서 1 시간 동안 경화 할 수있다. </li></ol></li><li> 두 챔버의 하부 절반의 제조 탑재 <ol><li> 기계 또는 3D는 2 챔버의 하부 절반 (보조 파일 2)을 탑재 인쇄. 상기 챔버의 하부면에 직경 20mm 오목 원을 식별한다. </li><li> 오목 원의 가장 외측에 에폭시 3mm의 얇은 층을 적용한다. 에폭시에 한 18mm 원형 유리 커버 슬립을 적용합니다. 에폭시는 1 치료 허용시간. </li></ol></li></ol> 내부 귀 기관의 3. 추출 <ol><li> 10 분 동안 유게 놀 마취 용액을 함유하는 작은 양동이에 배치하여 미국 Bullfrog 마취. 용액의 부피를 조정하는, 그래서 그냥 액체 무선 인터페이스 위의 개구리의 humero - 견갑골 관절 거짓말. </li><li> 더블 pithing에 의해 마취 황소 개구리를 안락사. <ol><li> 턱 아래 하나의 코 꼭대기 손가락과 다른과 마취 개구리를 잡고 앞으로 개구리의 머리를 돌립니다. </li><li> 신속 개구리의 뒤통수 프로세스 사이의 중간 선에서 발견되는 난원 매그넘을 통해 뇌 볼트에 pithing로드를 뛰어. </li><li> 천천히 철회와 팁이 난원 매그넘에서 출발 할 때까지로드를 회전합니다. 척수를 파괴하는 척추 foramina을 통해 꼬리 쪽로드를 강제로. </li><li> 개구리가 제대로 이중 하부 사지 연장하는 것을 관찰함으로써 pithed되었는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 안정성 향상을위한 vomerine 치아를 잡고 코와 첫 번째 손가락 꼭대기 엄지 손가락으로 개구리를 잡고. 양측 턱 관절을 절단하고 이후 rostrocaudal 축에 직각으로 절단하여 개구리 목을 벨. 두개골 내 내부 귀 기관이 그대로 남아 있음을 보장하기 위해 절단 모두 tympana에 꼬리 있는지 확인합니다. </li><li> stereodissection 현미경을 사용하여, 조직 (도 1a)의 가장 후방 정도로 vomerine 치아에서 구개 조직을 잘라 정중선을 실행한다. </li><li> 절단 및 후방 연골을 나타 내기 위해 구개 조직 아래에 누워 메스의 수평 컷 어떤 근육을 취소합니다. 근육을 제거한 후, 귀 캡슐의 경계를 형성하는 시간 연골 사탕 형상을 관찰한다. </li><li> 귀의 캡슐의 연골과의 접촉의 지점에서 코 기둥을 절단. </li><li> 반복 shallo함으로써이 연골의 얇은 층을 면도그것을 통해 w 가로 잘라냅니다. 내부 귀 기관에 손상을 방지하기 위해 깊은 상처를 피하십시오. 이 시간 연골 (그림 1B)의 롤리팝 구조 내에서 발견 된 귀 캡슐을 엽니 다. 귀의 캡슐 내에서 개구리의 내부 - 귀 기관 (도 1C)입니다. </li><li> 내부 귀 기관이 손상되지 않도록주의하면서 후방과 귀 캡슐의 측면 모서리를 낸다. 해부하는 동안 자주가 침수 및 수화 상태를 유지하도록 내이 기관을 통해 식염수 흐름. </li><li> 중간 선에 연골의 내측 연결에서 측두골에있는 두 개의 원형 구멍을 찾습니다. 시간적 뼈 파열 가장 내측 구멍을 통해 아래로 잘라. </li><li> 그 측방 가장자리에 귀의 캡슐을 통해 두 번째 아래로 절단합니다. 내부 귀 기관에 대한 액세스를 제공하기 위해 이전 컷 사이의 연골 조각을 제거합니다. </li><li> 단계 3.8을에서 컷 사이의 연골을 풀어 들어 올립니다차 3.9과 귀 캡슐에서 멀리 잘라. 이 조치는 추가 조작에 대한 핸들로 사용 될 수있는 가장 가까운 반원의 운하를 벌인. </li><li> sacculus를 만지지 않도록주의하면서 뇌신경 번째 VIII을 절단. </li><li> 가장 가까운 반원형 운하의 팽대부를 잡으십시오. 조심스럽게 남아있는 두 개의 반원형 운하를 노출 내이을 돌립니다. 각 운하를 노출되면, 그것을 절단. </li><li> 신경 또는 반원형 운하 팽대부를 잡고 머리에서 내 귀를 추출하고 냉장 산소 인공 외 림프 가득 접시에 넣습니다. 내이의 제거는 반원형 운하가 한 번 통과 한 측두골 (그림 1D) 내의 통로의 시각화를 허용합니다. 참고 : 두 번째 귀를 추출하기 위해이 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 하나의 챔버 준비 <ol><li> sacculus의 분리 <ol><li> 대형 엉를 식별하여 sacculus를 찾습니다전자 이석의 질량과 그 꼭대기에 놓여 주머니 모양 신경 (그림 1E). 물리적 주머니 모양 머리 셀의 무결성을 유지하기 위해 다음 단계 중 sacculus를 상처를 입히다 않도록주의. </li><li> 내이 조종 렌더링하는 반원의 운하를 낸다. </li><li> sacculus의 신경 측 위에 놓인 perilymphatic 탱크를 제거합니다. 수조의 둘레 부드러운 컷을 확인합니다. 다음은 sacculus의 신경 측에 탱크의 멤브레인을 연결 조직의 작은 기둥을 절단. </li><li> lagena 및 관련 신경을 제거합니다. </li><li> 주머니 모양 신경 잡고 부드럽게 sacculus을 들어 올려 otoconial 낭의 얇은 막을 통해 절단. 낭 중 이석 유출 된 바와 같이, 그 둘레 절단하여 sacculus 무료. 참고 : 원하는 경우 sacculus을 분리 한 후, 나머지 내부 귀 기관이 저장 될 수 있습니다. sacculus 제거와 같은 다른 구조의 식별을 용이양서류와 기저 용의자. </li><li> 조심스럽게 sacculus에 남아있는 이석을 닦아 가위 또는 집게를 사용합니다. 이 과정에서 sacculus를 만지지 않도록주의하십시오. </li><li> sacculus &#39;가장자리에서 남아있는 otoconial 골목 막 트림. 이 멤브레인은 플라스틱 및 유리 표면에 부착하는 경향과 그 제거는 조직을 취급 문제를 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 남아있는 이석 (그림 1 층)을 제거하기 위해 파스퇴르 피펫으로 sacculus를 통해 식염수 흐름. 참고 : 첫 번째의 미러 이미지 인 제 2 sacculus에 대해이 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 소화 및 설치 <ol><li> 고장의 팁 파스퇴르 피펫의 백엔드를 사용하여, 인공 외 림프 67 mg의 ∙ L -1 프로테아제 XXIV의 3 ㎖을 함유하는 페트리 접시에 절연 sacculi 옮긴다. 참고 :이 프로테아제 처리는 otolithic 각 kinociliary 전구를 테 더링의 링크를 소화막 감각 모발 다발을 손상시키지 않고 막 제거를 가능하게한다. </li><li> 22 ° C (또는 21 ° C에서 35 분)에서 30 분의 조직을 품어. 오픈 직면 실험 챔버에 각각 소화 sacculus를 전송하고 자기 핀 조직을 고정합니다. </li><li> 주머니 모양 황반 직접 otolithic 막 아래에 거짓말과 유모 세포를 포함하는 sacculus의 부분이다. 그것을 확인하고 조심스럽게 주머니 모양 황반를 만지지 않도록주의하면서 좋은 속눈썹을 사용하여 상부 otolithic 막을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 5. 두 개의 챔버 준비 <ol><li> sacculus의 분리 <ol><li> 4.1 절에서와 같이 내부 귀 기관에서 sacculus을 분리합니다. </li></ol></li><li> 설치 및 소화 <ol><li> 진공의 두 점을 이용하여, 인공 외 림프로 장착 블록 (보조 파일 3)를 채우고 하나의 개구부에 뚫린 알루미늄 포일을 배치제자리에 고정하고 약한 시일을 형성 그리스. </li><li> 전송 한 호일에 sacculus 및 아래로 향하게 황반과 위를 향하도록 신경 밑둥에 구멍의 상단에 중심. </li><li> 트위스트 조직의 조각으로 sacculus 주변의 염분을 제거합니다. sacculus을 둘러싼 알루미늄 광장의 표면을 건조 할 수있는 생리 식염수를 심지. </li><li> sacculus의 가장자리와 알루미늄 평방 사이의 경계를 따라 단단한 시일을 형성하는 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용하기 위해 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 어플리케이터를 사용한다. sacculus의 전체 둘레는 접착제로 피복되어 있는지 확인합니다. 참고 : 너무 느리게 진행하는 시아 노 아크릴 레이트 접착제가 sacculus의 신경 측면을 통해 크리프 결국 그것을 커버 할 수 있습니다. 신속하게이 작업을 완료하는 것이 필수적이다. </li><li> 접착제를 치료하기 위해 장착 된 조직의 위에 생리 식염수의 드롭 놓습니다. 접착제의 박막 식염수 드롭의 상부에 형성 할 수 있고; 집게로 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 t 제거그는 장착 블록에서 호일. sacculus의 황반면이 위를 향하도록 위에 장착 된 조직 플립과 인공 외 림프 채워진 페트리 접시에 떠. </li><li> 황반의 상단에 단백질 분해 효소 XXIV 용액 한 방울을 추가하고 22 ° C (또는 21 ° C에서 35 분)에서 30 분 동안 품어. 중앙 챔버 주위에 외 림프와 장소 진공 그리스와 두 개의 챔버 장치 (보조 파일 2)의 하부 운하를 입력합니다. </li><li> 챔버의면에 대향하는 신경과 하부 챔버에 호일 장착 sacculus를 놓습니다. 호일의 둘레 그리스를 추가합니다. </li><li> 진공 그리스와 완벽한 밀봉을 형성하도록주의하면서 호일에 준비의 상부 챔버 (보충 파일 1)을 놓습니다. 버블 인공 림프와 상부 챔버를 입력하고 부드럽게 속눈썹으로 otolithic 막을 제거합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Adult+Mouse+Utricle+and+Adenovirus-mediated+Supporting-cell+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).</li>
<li>Howard, J., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compliance+of+the+hair+bundle+associated+with+gating+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+the+bullfrog%27s+saccular+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell.</a> Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).</li>
<li>Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+hair+cell%27s+transduction+channels+at+the+hair+bundle%27s+top+by+iontophoretic+application+of+a+channel+blocker%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker.</a> Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).</li>
<li>Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+adaptation+and+active+bundle+movement+in+bullfrog+saccular+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).</li>
<li>Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-bundle+stiffness+dominates+the+elastic+reactance+to+otolithic-membrane+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear.</a> Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).</li>
<li>Martin, P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+hair-bundle+movements+can+amplify+a+hair+cell%27s+response+to+oscillatory+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).</li>
<li>Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+hair+bundle%27s+mechanosensory+function+by+its+mechanical+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).</li>
<li>Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Oscillation+by+Hair+Bundles+of+the+Bullfrog%27s+Sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus.</a> Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. , (1988).</li>
<li>Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+electrical+resonance+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging electrical resonance in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).</li>
<li>Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-selective+exocytosis+by+ribbon+synapses+of+hair+cells+in+the+bullfrog%27s+amphibian+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).</li>
<li>Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+bundleless+hair+cells+and+subsequent+bundle+replacement+in+the+bullfrog%27s+saccule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule.</a> Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).</li>
<li>Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoelectrical+transduction+by+hair+cells+of+the+bullfrog%27s+sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus.</a> Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).</li>
<li>Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+active+process+of+hair+cells+with+cochlear+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integrating the active process of hair cells with cochlear function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).</li>
<li>Corey, D. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+latency+of+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Response latency of vertebrate hair cells.</a> Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).</li>
<li>Cheung, E. L. M., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2BChanges+the+Force+Sensitivity+of+the+Hair-Cell+Transduction+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel.</a> Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).</li>
<li>Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+amplification+of+hair-bundle+motion+by+cyclical+binding+of+Ca2%2B+to+mechanoelectrical-transduction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).</li>
<li>Assad, J. A., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+motor+model+for+adaptation+by+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells.</a> Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).</li>
<li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+adaptation+of+transducer+currents+in+turtle+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 405-434 (1989).</li>
<li>Howard, J., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+relaxation+of+the+hair+bundle+mediates+adaptation+in+mechanoelectrical+transduction+by+the+bullfrog%27s+saccular+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).</li>
<li>Purves, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+drugs+from+iontophoretic+pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">The release of drugs from iontophoretic pipettes.</a> Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).</li>
<li>Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unifying+the+various+incarnations+of+active+hair-bundle+motility+by+the+vertebrate+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell.</a> Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).</li>
<li>Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+effects+of+mechanical+loading+on+active+hair+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).</li>
<li>Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation+by+mammalian+hair+bundles+supports+a+role+in+cochlear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification.</a> Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).</li>
<li>van Netten, S. M., Khanna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+changes+of+the+cupula+associated+with+the+mechanics+of+hair+cells+in+the+fish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).</li>
<li>Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+channels%27+gating+can+control+friction+on+vibrating+hair-cell+bundles+in+the+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).</li>
<li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actions+of+calcium+on+the+mechano-electrical+transducer+current+of+turtle+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 369-398 (1991).</li>
<li>Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+motion+of+stereocilia+assures+the+concerted+gating+of+hair-cell+transduction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels.</a> Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+free+Ca2%2B+concentration+in+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia.</a> Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).</li>
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저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

황소 개구리의 sacculus 내에서 수천 쉽게 접근 감각 유모 세포를 거짓말. 여기에서 우리는 단일 및 두 개의 챔버 녹음을 위해 추출 및 sacculus의 준비를 보여줍니다. 이 두 제제는 유모 세포 및 관련 번들 모두 마이크로 기계 및 전기 생리 연구를 허용합니다. 조직이 산소 식염수의 잦은 교체와 함께 몇 시간 동안 생존 할 수 있기 때문에 실험은 오랜 기간 지속될 수 있습니다. 머리 번들 추출 후 최대 24 시간 동안 자발적으로 진동하면서 이러한 준비에 머리 세포는 일반적으로 절개 후 최대 6 시간 동안 미세 전극 기록에 가능한 남아있다. sacculus 성공적으로 추출 및 장착은 몇 가지 일반적인 문제를 극복에 달려있다. 첫째, 주머니 모양 황반의 혀끝의 표면과 직접 접촉은 준비 절차를 통해 피해야한다. 주머니 모양 신경 안전 manipu에 편리한 핸들을 제공합니다sacculus의 LATION. 내부 귀 기관의 나머지 부분에서 해방되면, sacculus 유체에 침지 남아있는 그 감각 상피에 기계적인 손상을 방지하면서 큰 구멍 피펫을 사용하여 전송해야합니다. 황반 표면에서 이석의 제거는 유모 세포에 기계적 손상없이 완료해야합니다. 이석은 황반 위에 직접 놓여 있기 때문에, 헤어 세포를 해부 도구와 이석을 제거하는 동안 otolithic 막 사이의 우발적 접촉에 의해 손상 될 수 있습니다. 손상을 방지하기 위해, 우리는 이석의 젤라틴 물질이 황반에서 멀리 떨어진 위치에서 개최 한 덩어리로 제거하는 것이 좋습니다. 이 개별적으로 추출 될 각각의 여러 클러스터에 otoconial 질량의 단편화를 방지 할 수 있습니다. 이석의 작은 클러스터가 남아있는 경우 그들은 파스퇴르 피펫에 의해 전달 완만 액압으로 제거 될 수있다. 마지막 과제는의 sacculus 알루미늄 장착 광장 사이에 꽉 밀봉의 형성을 포함한다두 개의 챔버 준비. 100㎛ 정도 sacculus 주변 알루미늄 허가 조직을 완전히 실링 사이의 오버랩을 허용하기에 충분히 작은 천공 사각을 채용. 접착제 타이트한 밀봉을 형성하기 위해 약 100 μm의 황반의 둘레 주머니 모양의 조직과 접촉한다. 자유 칼슘의 농도 2+ 유모 세포의 연구에서 중요한 고려 사항이다. 칼슘 따라서 자발적 번들 모션 8 (23)를 포함하는 mechanotransduction 장치의 동역학 모발 다발의 활성 프로세스 현상의 특성을 결정하고, 빠르고 느린 적응을 모두 조절한다. 생체 내 림프 칼슘 따라서 대부분의 생리 학적으로 관련 역학이 농도 (Maunsell JHR, R. 제이콥스와 AJ Hudspeth에서 평가됩니다, 250 μM 존재한다. Unpublis을 Hed 관찰 16). 그러나 유모 세포에서 미세 전극 기록은 미세 전극 주위의 세포막의 적절한 밀봉을 위해 2 밀리미터를 초과하는 외부 칼슘 농도를 필요로한다. 이들 실험을 위해 높은 칼슘 염을 사용하는 것이 필수적이다. 마지막으로, 하나는 칼슘 농도의 다양한 사용에 따라 외부 mechanotransduction 칼슘의 영향을 연구해도된다. 이러한 경우는 일반적으로 팁 링크 파열 전달 (28)의 불가역 손실을 초래할 1 μM 이하 칼슘 농도를 기억하는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 두 가지 실험 준비는 유모 세포에 생물 물리학 적 측정의 범위를 허용합니다. 그러나, 추가 측정이 준비에 약간의 수정을 할 수있다. 접힌 주머니 모양 준비, 머리 번들은 측면 시각입니다. 이 관점에서 영상 헤어 번들 운동은 일관된 경구를 계시모두 짧고 키가 stereocilia (29)의 이온. 여기서, 주머니 모양 황반 먼저 그 하부 조직으로부터 분리하고,이어서 모발 다발 바깥면과 측 방향으로 주름에 가시화되도록 상기 주머니 모양 신경에 의해 정의 된 축을 따라 접혀. 제 2 변형은, 모발 세포 해리는 머리 셀의 다발과 소마 양자의 연구를 가능하게한다. 모세포 기계적 이미징 및 전기 생리 학적 기록 (30)을 유리 슬라이드 상에 분해된다. 최종적으로, 모발 세포는 유사한 분리 프로토콜에 따라하지만 기계적 분리 단계없이 상피로부터 압출 할 수있다. 기계적 손상을 최소화하면서 서서히 전기 생리 레코딩을위한 기저 액세스를 제공 상피 밖으로 돌출 머리 셀이 처리 결과. 이러한 제제 및 그들의 다양한 변형이 생물 물리학위한 모델 시스템으로 개구리 sacculus의 다양성을 보여감각 유모 세포의 연구.

포유 동물의 acousticolateralis 기관은 복잡한 구조를 가지고 접근하기가 어려울 수 있습니다 해부학 틈새 시장 내에서 거짓말. 예를 들어, 포유 동물은 달팽이관 나선형 미로를 포함하고 두께 측두골 내에 포함된다. 달팽이관의 분리는 종종 그 안에 누워있는 감각 세포에 기계적인 손상이 발생하기 때문에 어려운 작업 일 것으로 입증되었습니다. 신경 과학자 따라서 더 쉽게 귀에의 서재에서 추출하는 시스템을 모델링되어있다. 이 모델 시스템 중 하나 인 미국의 황소 개구리 (모이 catesbeiana)의 sacculus은 수십 년이 청각 및 전정 기관의 기능에 일반화 통찰력을 산출하기위한 있습니다. sacculus 낮은 주파수의 청력과 지진 감각 모두에서 감각 역할이 혼합 된 기능의 기관이다. sacculus의 감각 세포는 머리카락 세포, 기계적 에너지로 변환 전문 변환기입니다우리의 청각 및 전정 기관 내에서 전기 신호로. 각 머리 셀의 혀끝의 표면에서 돌출하는 stereocilia라고 확대 미세 융모의 등급 술을 포함하는 mechanosensitive 머리 번들입니다. 인접 stereocilia의 팁 사상 팁 링크 단백질에 의해 상호 연결되는 기계적 게이트 이온 채널 기계적 자극 2, 3에 대응한다. 청각 및 전정 기관이 자극의 종류에 대응하지만, 이들은 공통의 검출기구를 공유한다. 이 공통점은 황소 개구리의 sacculus의 연구를 통해 헤어 셀 mechanotransduction에 얻은 많은 통찰의 기초. 예를 들어, 모발 세포의 활성화 과정이 장기 4, 5, 6, 7에서 광범위하게 연구되었으며, 모발 다발 기계적 생산하는 에너지 소비 프로세스를 채용작업. 뿐만 아니라 그 유모 세포가 활성 일 (6)를 생성하는 것이 도시되어 있지만, 고유 활성 프로세스 기전 및 머리 셀의 튜닝 특성 장기 acousticolateralis 황소 개구리의 연구를 통해 발표되고있다. 이들은 양서류 유두에서 헤어 셀의 리본 시냅스 (12)의 활성 헤어 번들 운동 8 헤어 셀 전기 공명 (9), (10), sacculus 11 및 주파수 선택성을 포함한다. 황소 개구리의 sacculus 수많은 이유 감각 신경 과학자에 호소. 포유류의 달팽이관과는 달리,이 기관은 쉽게 접근 귀 캡슐 내에 자리 잡고 있습니다. 둘째,이 기관 내 머리 셀 (14)은 적절한 조건하에 13 시간 동안 몇 건강한 남아있을 수있다. 이 experimentat 허용자신의 포유 동물의 대응에 상대적으로 긴 시간 척도를 통해 이들 세포에 이온. 셋째, 기관은 쉬운 조작을 허용, 작은 곡률을 맺는다. 넷째, 각 기관은 높은 처리량과 주어진 실험 머리 셀들의 적절한 세트 위치의 높은 가능성을 모두 제공 천개 이상의 모발 전지 (15)를 포함한다. 마지막으로, 황소 개구리의 sacculus 용이 인해 머리카락이 셀 기관과 큰 사이즈의 박형으로 가시화된다. 이러한 속성은 황소 개구리의 sacculus 내 감각 세포의 연구를위한 훌륭한 기능성을 제공한다. 손의 질문에 따라 여러 실험 제제 중 하나는 sacculus로부터 얻을 수있다. 이들 중 가장 간단한 하나의 챔버 제제이다. 여기 sacculus 인공 외 림프, 나트륨이 풍부한 높은 칼슘 식염수로 채워진 챔버에 고정된다. 이 혼합물은 머리 셀 전류 및 염기성 모발 다발 역학 연구있게. 두 번째 구성에, 2 실 제제, 자연 모발 다발의 움직임을 연구하는데 사용될 수있다. 기저 외측 측이 인공 외 림프에 목욕 반면 다음은 유모 세포의 꼭대기면이 칼륨이 풍부한 칼슘이 부족한 염분에 노출되어, 인공 림프 불린다. 이러한 두 구획 식염수의 생체 배열을 모방하고 모발 다발 자발적으로 진동 할 수있는 환경을 제공한다. 우리는이 논문에서의 감각 유모 세포의 생물 물리학 연구의 황소 개구리의 sacculus의 준비에 대해 설명합니다. 우리는 먼저 개구리의 내이에서이 기관의 분리에 대한 자세한 묘사를 제공합니다. 우리는 그 다음 단일 및 두 챔버 모두 실험 준비를 설명하고 각 구성에 대한 대표적인 결과를 포함한다.

<table><tbody><tr><td>두 제제에 공통</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo-dissection microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>다른 소스는</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>E10521</td>을 <td>사용할 수 있습니다 다른 소스는 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>금속 pithing rod</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pypps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫 및 전구(x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘에 장착된 가는 속눈썹</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-557-172</td><td></td></tr><tr><td>Dow-corning 진공 그리스</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td></td></tr><tr><td>진공용 주사기 그리스</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>기타 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시 (x2 - 3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Micropipette 풀러</td><td>Sutter</td><td>P-97 또는 P-2000</td><td></td></tr><tr><td>120 V 솔레노이드 풀러</td><td></td><td></td><td>홈메이드, 부품 목록 참조</td></tr><tr><td>스퍼터 코터</td><td>Anatech USA</td><td>Hummer 6.2</td><td></td></tr><tr><td>이온 영동을위한 전류 소스</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>압전 액추에이터</td><td>압전 액추에이터 Jena</td><td>P-150-00</td><td></td></tr><tr><td>증폭기 압전 액추에이터</td><td>Piezosystem Jena</td><td>ENV800</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>1 챔버 준비용</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 증폭기</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>이온 영동 및 미세 전극 기록에 동시에 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>자기 핀 (x2)</td><td></td><td></td><td>집에서 만든, 부품 목록 참조</td></tr><tr>마그네틱 시트<td></td><td></td><td>가 있는 개방형 상부 챔버</td><td>홈메이드, 부품 목록 참조</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2챔버 준비용</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upper chamber</td><td></td><td></td><td>보충 파일 1</td></tr><tr><td>쓰루 하부 챔버</td><td></td><td></td><td>보충 파일 2</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>기타 소스 사용 가능</td></tr><tr><td>마운팅 블록</td><td></td><td></td><td>보충 파일 3</td></tr><tr><td>나무 애플리케이터 스틱</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>기타 소스 사용 가능</td></tr><tr><td>테프론 시트</td><td>McMaster-Carr</td><td>8545K12</td><td>테프론 어플리케이터용</td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>실험실 티슈(Kimwipes)</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>겐타마이신 설페이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>빠른 설정 에폭시</td><td>McMaster-Carr</td><td>7605A18</td><td></td></tr><tr><td>18mm 유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-546</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다<</td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Saline components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td>다른 소스를 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>다른 소스를 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>D-(+)-포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>다른 소스를 사용할</td></tr> <tr><td>수 있습니다Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td> Partss lists for home-made equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solenoid puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solenoid</td><td>Guardian Electric</td><td>A420-065426-00</td><td>다른 소스를 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>풋 페달 스위치</td><td>Linemaster</td><td>T-51-SC36</td><td>다른 소스를 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>피펫 홀더</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH900R</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>거친 매니퓰레이터</td><td>Narishige Group</td><td>MM-3</td><td>다른 소스를 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>백금 와이어</td><td>Alfa Aesar</td><td>25093</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Leica</td><td>Z050-261</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Magnetic pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>McMaster-Carr</td><td>7556A33</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>1mm 두께의 알루미늄</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Open-top magnetic 챔버 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>유연한 마그네틱 스트립</td><td>McMaster-Carr</td><td>5759K75</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>1mm 두께의 알루미늄</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>다른 소스를 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

미국 황소 개구리의 sacculus (헤어 세포의 생리 준비<em&gt; 모이 catesbeiana</em&gt;)

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

청각과 균형의 연구는 모델 시스템의 생물 물리학 연구에서 도출 통찰력에 달려있다. 하나의 모델, 미국 황소 개구리의 sacculus는 청각 및 전정 연구의 주류가되었다. 이 기관의 연구에 적극적으로 환경으로부터 신호를 검출 할 수있는 방법 감각 세포 머리 밝혀졌다. 이러한 연구로 인해, 이제 더 기계적 게이팅 및 머리 셀의 전달 채널들, 기계적 적응 칼슘의 역할 지역화, 헤어 셀 전류의 신원을 이해한다. 이 고도로 접근 할 기관은 유모 세포의 동작에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 여기에서 우리는 유모 세포에 생물 물리학 연구의 황소 개구리의 sacculus의 준비에 대해 설명합니다. 우리는 완전한 박리 과정을 포함하는 특정 상황에서 sacculus의 제조를위한 특정 프로토콜을 제공한다. 우리는 추가의 계산을 포함하여이 준비를 사용하는 대표적인 결과를 포함헤어 번들의 순간적인 힘 - 변위 관계와 번들의 자연 진동의 측정.

황소 개구리의 sacculus의 감각 상피 유모 세포의 생리 프로브 다양한 구성으로 이용 될 수있다. 조직이 비교적 평탄하기 때문에, 단일 및 두 제제 모두 챔버 내에 장착 될 수있다. 하나의 챔버 구성은 유모 세포의 전기 생리 및 마이크로 기계식 녹음을위한 간단한 설정을 제공합니다. 두 개의 챔버 준비 대신 림프와 유모 세포의 각각 혀끝과 기저 측면에 perilymphatic 구획을 모두 시뮬레이션합니다. 이 구획 함께 머리 세포의 mechanotransduction의 연구에 대한 생리 학적으로 관련 환경을 제공합니다. 유모 세포의 민감도 및 전달 특성 기계적 자극에 대한 전기적 응답을 그 기초. 이러한 기능을 조사하기 위해, 우리는 동시에 개인의 머리에서 기록 된 것은 그 번들의 ​​위치를 ​​셀과세포의 수용체 전위 (그림 2). 우리는 제 1 힘 펄스를 적용하는 모발 다발의 kinociliary 전구 유연한 유리 섬유를 부착. 그런 다음 듀얼 다이오드 시스템 (2) (도 2A)을 사용하여 모발 다발의 변위를 측정 하였다. 우리는 동시에 날카로운 미세 전극과 셀을 찌르는하여 머리 세포의 잠재력을 인수했다. 우리는 머리카락 묶음의 해당 변위 (도 2B)에 대한 각각의 기계적 자극에 의해 유도 피크 전압 응답을 플로팅함으로써 용량 - 반응 곡선을 획득. 머리 셀의 전기 응답은 모두 포지티브 및 네거티브 변위 극값 대한 포화. 음의 변위 단계를 막 전위의 감소는 mechanotransduction 전류 안쪽 휴식의 존재를 나타냅니다. 이 휴지 전류가 모두 빠르고 느린 적응 17에 칼슘 이온의 작용에 의해 변조되고 18, 19, 20, 21. 헤어 셀의 동작은 그것의 전기적 특성에 따라, 또한 그 감각 모발 다발의 마이크로 메카닉에 단지 의존한다. 두 챔버 구성 모방 모발 다발의 역학 연구를위한 이상적인 조건을 제공하는 생체 외 림프 및 림프의 분리. 이러한 조건에서 제거 otolithic 막을 모발 다발 자발적 6 요동 할 수있다. 여기에서 우리는 각 번들의 마이크로 메카닉을 평가하기 위해 두 개의 챔버 준비를 고용했다. 우리는 듀얼 광 다이오드 변위 모니터 (그림 3)에 그 그림자를 주조하여 머리 번들의 자연 진동을 기록했다. mechanotransduction에 아미노 글리코 사이드 항생제 겐타 마이신의 역할을 평가하기 위해, 이온 삼투 rele<html> 머리 번들에 직접 겐타 마이신을 ased (그림 3). 릴리스 겐타 마이신의 농도는 마이크로 피펫을 통과 한 전류에 비례하여 상승한다. 겐타 마이신은 머리 번들의 진동을 억제하고 키가 큰 쪽을 향해 번들의 오프셋 (offset) 정적을 유도한다. 이러한 효과는 투과 구멍을 차단하면서 mechanotransduction 채널의 개방 상태를 유지하고 개방 채널 차단제로서 겐타 마이신의 역할을 반영한다. 충전 화학 물질의 이온 토 포레 시스는 현지화 및 유체 유동에 의한 기계적 장애의 부재에 다양한 농도에서 화학 물질의 정량 방출 따라서 이상적으로 이러한 모발 다발 (22)로 mechanosensitive 세포 기관의 연구에 적합 허용합니다. 헤어 번들의 자발적인 운동, 적응과 비선형 번들 강성 (7) 사이의 상호 작용에서 발생외부 참조 &quot;&gt; 8, 23, 24.이 자발 운동 점성 저항을 극복하기 위해 기계적 일로 신호 에너지 변환 모발 다발의 활성 프로세스의 서명이다. 모발 다발 전정이 청각 비선형 순간 강도를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (25), 및 측면 라인 시스템 (26). 우리는 직접 황소 개구리의 sacculus (도 4)에서 개별 모발 다발의 순간 강도를 측정 하였다. 이를 달성하기 위해, 모발 다발의 kinociliary 전구 (도 4a)에 유연한 유리 섬유의 선단을 결합. 우리는 섬유의 기반을 변위에 의해 머리 번들로 힘을 전달했다. 자극 섬유가 모발 다발에 가해지는 힘은 섬유의 BAS의 변위의 차이에 대응E 및 팁은 섬유의 강성이 27 곱한. 힘의 범위에서 펄스를 전달하면 번들 번들의 계속되는 변위에 가해지는 힘의 관계를 보여준다. 이 힘 - 변위 관계의 기울기는 머리카락 묶음의 순간 강도 (도 4a)에 상당한다. 이 방법은 미국이 편향 (도 4b)의 함수로서 각각의 번들의 순간 강도를 측정 할 수 있었다. 순간 힘 - 변위 곡선은 정지 위치의 주위에 약 20 nm의 범위 번들의 비선형 강성을 공개, 비선형 관계를 표시합니다. 이 범위 밖에서, 머리 번들은 Hookean 재료처럼, 강성은 큰 크기의 처짐에 대한 선형 동작합니다. 이러한 결과는 demonst머리 세포 생리학의 연구에서 황소 개구리의 sacculus의 다양성을 평가. 이들 및 다른 제제를 사용하여, 하나는 뇌 향해 번들로부터의 정보의 전송의 여러 단계에서 mechanotransduction를 탐색 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig1.jpg" /> 그림 1 : 황소 개구리의 내이의 해부. 그것의 복부 측면에서 황소 개구리의 상부 미각보기 (A)는 이관 (원)의 식별을 허용합니다. 상부 입천장의 우측을 덮는 피부의 측면 반사 내이 (점선 박스)의 위치를 ​​알 수있다. 개구리의 측두골의 복부 측면에있는 연골의 (B) 제거는 귀 캡슐 (점선)를 엽니 다. 표시 (C)는 귀 캡슐의 고배율 이미지이며, 이는 sacculus, lagena, CN VIII 및 SACC에서<html> 울라 신경 쉽게 식별 할 수 있습니다. (D) 내부 귀 기관의 제거 후 귀의 캡슐의보기는 반원형 운하의 위치를 알 수있다. 뇌 신경 (CN VIII) 번째 고립 내이의 sacculus, lagena 및 VIII의 제거 후 (E)를 쉽게 식별 할 수 있습니다. (F)는 분리 된 sacculus는 주머니 모양 신경과 감각 상피 꼭대기 거짓말 otolithic 멤브레인의 짧은 그루터기를 보유하고있다. 라벨 (II) lagena, (ⅲ) CN VIII (IV)의 주머니 모양 신경 및 (V) otolithic 막을 상기 (I)에 대응 sacculus. 축 P 레이블 A는 후방 및 전방 방향에 각각 해당합니다. 스케일 바는 1cm (A, B), 1mm (C, D, E), 및 400 ㎛의 (F)을 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 의 &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 벡터 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig2.jpg" /> 그림 2 : 단일 헤어 셀에 대한 변위 응답 곡선. (A) 유리 섬유 자극의 선단이 kinociliary 모발 다발의 섬유 전구의베이스에 결합시켜 후속 아홉 이산 단계에 걸쳐 변위 하였다. 번들의 위치는 이중 다이오드 시스템에서 추적하고, 그 수용체 전위를 동시에 출력이 브리지 모드에서 증폭기를 통과 한 미세 전극을 이용하여 측정 하였다. 전극의 끝 저항은 95 MΩ이고 번들의 휴식 막 잠재력이었다 -47 MV. (B)의 변위의 함수로서 번들의 수용체 전위의 플롯 번들의 반응과 그 사이의 비선형 관계를 보여위치. 각 점은 기계적 자극의 발병 후 2.5 밀리 시작, 2.5 밀리 초 시간 창을 통해 평균 잠재력과 의미 변위에 해당합니다. 각각의 컬러가 동일한 변위 펄스에 대응하는 시계열의 집합을 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure2_Xd_Xc_Vm_version4.eps" target="_blank">이 그림의 벡터 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig3.jpg" /> 그림 3 : 자연스러운 헤어 번들 진동에 겐타 마이신의 효과. 두 챔버 준비 모발 다발의 자발적인 운동 듀얼 다이오드 시스템을 사용하여 기록 하였다. 젠타 마이신 이온 영동 분리의 부재 (0 NA)에서는, 머리번들은 대칭 진동을 표시합니다. 전류의 크기는 겐타 마이신 황산염의 성장에 500 밀리미터 (10 nA의 20 NA), 헤어 번들 여행의 주파수 용량 의존적으로 폭포와 번들이 이상 자사의 높이 가장자리쪽으로 오프셋 가득 이온 영동 피펫을 통과으로 시간의 기간. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure3_GentaSpontOsc_version2.eps" target="_blank">이 그림의 벡터 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig4.jpg" /> 그림 4. 헤어 번들의 순간 강성을 계산. 강성 K F의 (A) 자극 광 (적색) t 연결된다ㅇ 개별 머리 번들 (노란색)의 (갈색)를 kinociliary 전구입니다. 섬유의베이스를 변위 공지 거리 X F는 거리 X의 B를 이동 번들시킨다. 힘 자극 섬유 F F로 다발에 작용하는 섬유 다발의 변위 사이의 차이에 비례한다. 힘의 범위에 걸쳐 이것을 반복하면 순간적으로 힘 - 변위 관계 (오른쪽), 슬로프있는 모발 다발의 순시 강도에 대응를 산출한다. (B)는 각각의 번들 펄스 발병 (청색 점)을 측정 한 후 첫 50 밀리 초 내에서 증가하는 크기와 변위 펄스를 강제로 하였다. 여기서, 모발 다발은 정지 위치 주위에 약 20 nm의 범위에 걸쳐 비선형 순간 강도를 표시한다. * Z - 60 * Z의 * (1 / (1 + 특급 (- 빨간색 곡선의 관계 F = K * X에 적합에 해당<html> (X - X 0) F는 번들에 적용되는 힘있는 / (K B 형 *의 T))) + F 0, X는 번들의 변위를 k = 790 ± 51 μN은 m -1 번들의 일정 ∙ 강성 모든 채널이 폐쇄 또는 개방 중 하나이며, Z = 0.43 ± 0.04 PN은 하나의 게이트 스프링의 힘, X 0 = 2 ± 1.9 nm의이 채널의 50 %가 개방되는 번들의 위치이며, K B는 볼츠만입니다 상수, T는 온도이며, F = 0 11.7 ± 1.3 PN 오프셋이 힘이다. 착용감 0.98 결정 계수를 갖는다. 자극 섬유 (107) μN의 강성 m의 -1 ∙했다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 에스 / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 벡터 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 용질 </td><td rowspan="2"> 화학 식량 (g / mol)의 </td><td colspan="2"> 1 L에 추가 </td></tr><tr><td> 인공 외 림프 </td><td> 인공 림프 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.4 </td><td> 6.54 g </td><td> 0.117 g </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 0.149 </td><td> 0.149 g </td><td> 8.62 g </td></tr><tr><td> CaCl2를 ⦁ 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 1 M CaCl2를 재고 2 mL의 </td><td> 1 M CaCl2를 주식의 250 μL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 238.3 </td><td> 1.19 g </td><td> 1.19 g </td></tr><tr><td> D - (+) - 글루코스 </td><td> 180.2 </td><td> 0.541 g </td><td> 0 541g </td></tr></tbody></table> 해부와 실험 준비 표 1. 솔루션. 인공 외 림프 및 해부과 1 또는 2 실 준비에 사용되는 인공 림프 솔루션에 대한 조리법이 테이블에 표시됩니다. 솔루션은 pH를 7.2로 가져해야합니다 - 7.4 수산화 나트륨 (외 림프) 또는 2 mL의 KOH (림프)의 약 2 mL로. 삼투 강도는 약 230 밀리몰을 읽어야 · kg -1 불완전한 이온 성 해리로 인해.

미국 황소 개구리의 (모이 catesbeiana) sacculus 머리 세포 생리학의 직접 검사를 허용합니다. 여기에 해부 및 생물 물리학 연구의 황소 개구리의 sacculus의 준비를 설명한다. 우리는 자발적인 운동의 번들의 힘 - 변위 관계의 계산과 측정을 포함하여이 유모 세포에서 대표적인 실험을 보여줍니다.

미국 황소 개구리의 Sacculus (헤어 세포의 생리 준비<em&gt; 모이 catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 마이크로-기계적 및 생물물리학적 연구 모두를 위해 황소개구리의 구형낭(sacculus)을 준비하는 것입니다. 이 방법은 감각 신경과학 분야의 핵심 질문인 '청각 및 전정 유모세포는 어떻게 적응하는가?'에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.모 bundle의 자발적 진동을 일으키는 원인은 무엇이며, 유모세포가 기계적 자극에 어떻게 능동적으로 반응하는지 알아봅니다. 이 기술은 수 시간 동안 건강한 상태를 유지하는 유모세포에 쉽게 접근할 수 있는 방법을 제공합니다. 유모세포는 취약하고 기계적 자극에 민감하므로, 이러한 과정 중에 세포의 무결성을 유지하는 것이 어려울 수 있습니다.여기에서 이 방법의 시각적 시연을 제공하여, 다른 연구자들이 적절한 조직 처리 기술을 구현하고 내이의 생물물리학적 연구에서 성공을 거둘 수 있도록 합니다. 먼저 갓 머리를 절단한 황소개구리 머리를 멸균된 해부 현미경 아래에 놓으십시오. 이 이미지의 점선 상자는 내이의 위치를 나타냅니다.메스를 사용하여 서골치(vomerine teeth)부터 조직의 가장 후단까지 구개 조직을 따라 중앙선을 절개합니다. 다음으로, 메스로 수평 절개를 가해 구개 조직 아래에 있는 모든 근육을 절단하고 제거하여 후방 연골을 노출시킵니다. 근육을 제거한 후, 이낭(otic capsule)의 경계를 형성하는 측두 연골의 롤리팝 모양을 관찰합니다.이소골의 columella를 otic capsule 연골과 접촉하는 지점에서 절단하십시오. 그런 다음 연골을 통해 얕은 수평 절개를 반복적으로 수행하여 얇은 층을 여러 번 깎아냅니다. 내이 기관의 손상을 방지하기 위해 깊게 절개하지 않도록 주의하십시오.이 이미지에서 보는 것과 같이, 측두 연골의 롤리팝 구조 내에 있는 이포(otic capsule)가 열리고 내이 기관이 보이면 면도를 중단하십시오. 다음으로, 내이 기관이 손상되지 않도록 주의하며 이포의 후방 및 외측 가장자리를 다듬으십시오. 해부 과정 전반에 걸쳐 내이 기관이 잠겨 있고 수분이 유지될 수 있도록 식염수를 빈번하게 흘려주십시오.이제 연골의 내측 연결부와 중앙선 사이에 위치한 측두골의 두 원형 개구부를 찾습니다. 가장 내측에 있는 개구부를 통해 아래쪽으로 절개하여 측두골을 파열시킵니다. 그런 다음, 이개낭의 후외측 가장자리를 통해 두 번째 하향 절개를 실시합니다.내이 기관에 접근하기 위해 이전 절개 부위와 이번 절개 부위 사이의 연골 조각을 들어 올립니다. 이 과정에서 가장 가까운 반고리관이 절단되며, 이를 이후 조작을 위한 손잡이로 사용할 수 있습니다. 다음으로, 구형낭을 건드리지 않도록 주의하면서 스카르파 신경절(Scarpa's ganglion) 수준에서 라게나(lagena)와 제8 뇌신경을 절단합니다.가장 가까운 반고리관의 팽대부를 잡고 내이를 부드럽게 회전시켜 나머지 두 개의 반고리관을 절단합니다. 신경이나 반고리관 팽대부를 잡고 머리에서 내이를 추출하여 냉각된 산소 공급 인공 외림프액이 채워진 접시에 넣습니다. 내이를 제거하면 이전에 반고리관이 통과했던 측두골 내부의 통로를 시각화할 수 있습니다.표면에 있는 크고 넓은 이석 덩어리와 구낭 신경을 통해 구낭을 식별합니다. 구낭을 확인한 후, 내이를 더 쉽게 다룰 수 있도록 반고리관을 절단합니다. 다음으로, 구낭의 신경측 위에 있는 외림프 낭의 주변부를 조심스럽게 절개합니다.시스터나(cistern)의 막과 소낭(sacculus)의 신경측을 연결하는 작은 조직 기둥들을 절단하고 시스터나를 제거합니다. 다음으로, 난형낭-라게나(utriculus lagena)로 이어지는 신경과 라게나 신경을 제거합니다. 그 후, 소낭 신경을 잡은 상태에서 소낭을 조심스럽게 들어 올리고 이석낭(otoconia sac)의 얇은 막을 절개합니다. 이석(otoconia)이 낭에서 쏟아져 나오면, 소낭의 주변부를 절단하여 소낭을 분리합니다.가위나 포셉을 사용하여 sacculus에 남아 있는 otoconia를 조심스럽게 닦아냅니다. 이 과정에서 sacculus를 건드리지 않도록 주의하십시오. 이제 막(membrane)이 플라스틱 및 유리 표면에 달라붙는 것을 방지하기 위해 sacculus 가장자리에서 남아 있는 otoconia sac membrane을 다듬어 제거합니다.마지막으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 식염수를 구형낭 위로 부드럽게 흘려보내 남아 있는 이석을 모두 제거합니다. 여기에서는 단독으로 분리된 구형낭의 상세 모습이 제시되어 있습니다. 점선은 이석막의 위치와 모세포를 포함하는 하부의 감각 반고리斑(macula) 영역을 나타냅니다.팁을 제거한 파스퇴르 피펫의 뒷부분을 사용하여, 분리된 sacculus를 Proteus 24 Solution이 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 그 다음 조직을 22 degree celsius에서 30분 동안 배양합니다. 소화된 각 sacculus를 개방형 실험 챔버로 옮기고, 자석 핀으로 조직을 고정합니다.그런 다음 미세한 속눈썹 핀셋을 사용하여 상단의 이석막을 제거하고 모세포가 포함된 구형낭 반고리관을 노출시킵니다. 구형낭을 분리한 후, 마운팅 블록을 인공 외림프액으로 채웁니다. 그다음 한쪽 개구부에 진공 그리스를 두 군데 찍어 바르고, 그 위에 타공 알루미늄을 올려 느슨하게 밀봉합니다.그 후 sacculus를 호일로 옮기고, macula가 아래를 향하고 신경 그루터기가 위를 향하도록 구멍 중앙에 배치합니다. 꼬인 조직 조각을 사용하여 마운팅 챔버의 반대편에서 식염수를 끌어당김으로써 sacculus와 마운팅 호일 사이에 밀착된 씰을 형성합니다. 알루미늄 사각형 표면에서 sacculus 주변의 식염수를 닦아냅니다.폴리테트라플루오로에틸렌 어플리케이터를 사용하여 sacculus의 가장자리와 알루미늄 사각형 사이의 경계를 따라 시아노아크릴레이트 접착제를 빠르게 도포합니다. sacculus의 전체 둘레에 접착제가 도포되었는지 확인하십시오. 시아노아크릴레이트 접착제를 도포할 때는 조직의 가장자리에 직접 닿지 않도록 어플리케이터를 사용하여 접착제를 유도하십시오.목표는 내림프 및 외림프 구획을 격리하기 위해 완전한 밀봉을 달성하는 것입니다. 접착제가 조직의 뒷면으로 흘러넘치는 것을 방지하기 위해 신속하게 진행하십시오. 고정된 조직 위에 식염수 한 방울을 떨어뜨려 접착제를 경화시키십시오.생리식염수 방울 위에 얇은 접착제 막이 형성될 수 있으며, 이 경우 핀셋으로 제거하십시오. 마운팅 블록에서 포일을 조심스럽게 제거하십시오. 마운트된 조직을 뒤집어 구형낭(sacculus)의 반고리관(macula) 측이 위를 향하게 한 뒤, 인공 외림프액이 채워진 페트리 접시에 띄우십시오.Proteus 24 Solution 한 방울을 황반(macula) 위에 떨어뜨리고 22 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 2챔버 장치의 하단 관에 외림프액(perilymph)을 채우고 중앙 챔버 주변에 진공 그리스를 바릅니다. 포일에 고정된 구형낭(sacculus)의 신경이 챔버 표면을 향하도록 하여 하단 챔버에 배치합니다.호일의 주변부에 그리스를 바릅니다. 진공 그리스로 완전히 밀봉되도록 주의하며 준비된 상부 챔버를 호일 위에 놓습니다. 상부 챔버를 기포가 섞인 인공 내림프액으로 채운 다음, 속눈썹 털을 이용해 이석막을 조심스럽게 제거하여 유모세포가 포함된 구형낭 매질을 노출시킵니다.이 이미지는 불연속적인 단계에 따른 모다발 변위의 결과를 보여줍니다. 모다발 변위는 날카로운 미세전극을 이용한 수용체 전위의 동시 측정과 듀얼 포토다이오드 시스템을 사용하여 추적되었습니다. 모다발의 변위에 따른 수용체 전위 그래프는 모다발의 반응과 위치 사이에 비선형 관계가 있음을 보여줍니다.각 색상은 동일한 변위 펄스에 해당하는 시계열 세트를 나타냅니다. 위에서 보았을 때, 2실 준비물 내의 유모다발은 자발적으로 진동합니다. 이온영동법을 통한 젠타마이신 방출이 없을 때, 유모다발은 대칭적인 진동을 보입니다.그 다음, 500 mM gentamycin sulfate가 채워진 이온도입 파이펫을 통해 흐르는 전류의 크기가 증가함에 따라, 유모다발의 편위 빈도가 용량 의존적인 방식으로 감소하며 다발이 긴 쪽 가장자리로 치우친 상태가 더 오랜 시간 지속됩니다. 이 기술을 숙달하면 75분 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 전기생리학 및 기계적 부하 클래핑(mechanical load clapping)과 같은 실험 방법을 통해 유모세포의 능동적 기전을 탐구할 수 있습니다.이 기술은 감각 신경과학 분야의 연구자들에게 길을 열어주었습니다. 척추동물의 청각 및 평형 감각 메커니즘을 탐구하기 위함입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 모세포 생리학의 생물물리학적 탐구를 위해 황소개구리 난형낭(sacculus)을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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신경과학

포유류의 달팽이관에있는 내부 헤어 셀 리본 버렸네에서 청각 신경 섬유 dendrites에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음.

달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의​​해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

이 동영상의 목적은 성인 zebrafish의 내부 귀 기관에서 건강 손상 세포를 획득하고 자신의 전압 개폐 채널의 biophysical 속성을 특성화하기위한 패치 클램프 연구를 위해 사용에 대한 절차를 설명하는 것입니다.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

전정 헤어 세포 기능의 분석은 두개골, 추체 측두골의 가장 어려운 부분 깊은 곳의 위치가 복잡합니다. 대부분의 기능 모발 세포 연구는 심하게 고립 된 유모 세포를 사용했습니다. 여기에서 우리는 전기 생리학 및 2 광자 현미경 연구를위한 마우스 전정 상피 세포의 반 그대로 준비에 대해 설명합니다.

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

쥐, 귀, 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말끝의 피침형 말단의 기계적 자극으로 인한 구심성 방전을 기록하는 간단하고 새로운 기술이 제시됩니다.

마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록

이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

배우세요 미국 황소개구리의 sacculus를 분리하여 모발세포 생리학 연구를 위한 생물물리학적 실험을 수행하는 방법을. 이 기법은 감각신경과학에서 청각 및 평형감각 메커니즘을 탐구하는 데 활용됩니다.

미국 황소 개구리의 Sacculus (헤어 세포의 생리 준비

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