Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화
2017년 9월 7일
여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.
이 실험의 전반적인 목표는 다광자 현미경을 통해 3차원 골격에서 In Vivo 혈관 형성을 실시간으로 시각화하는 것입니다. 이렇게 측정된 것은 뼈 생성 분야의 핵심 질문으로, 3차원 골격에서 실시간으로 생체 내 혈관 형성을 중화하고 속이는 방법과 같은 것입니다. 이 기술의 한 가지 장점은 생체 내에서 CERES, 세포 외 측정 및 주변 분자 네트워크를 동시에 중화할 수 있다는 것입니다.
먼저 20g의 PLGA와 20ml의 1, 4 다이옥산을 포함하는 균질한 용액을 준비합니다. 그런 다음 용액에 분말 nHAP 2g을 추가합니다. 자기 교반기를 사용하여 실온에서 1500rpm으로 16시간 동안 현탁액을 격렬하게 혼합하여 다공성 PLGA NHAP 스캐폴드 인쇄에 사용할 균일한 페이스트를 만듭니다.
인쇄가 완료되면 골격을 48시간 동안 동결 건조하여 용매를 완전히 제거합니다. 그런 다음 75% 에탄올로 1시간 동안 살균합니다. 그 후, 중성 방부제 물질을 얻기 위해 한 번 더 lifalyze하십시오.
다음으로, 각 골격에 렌티바이러스 입자의 5분의 1에 4점을 곱한 값을 추가하고 입자가 2시간 동안 섭씨 37도를 유지하는 가습 인큐베이터에서 흡수되도록 합니다. 이제 렌티바이러스 입자가 골격에 흡수되었으므로 2밀리리터의 PBS로 골격을 두 번 세척하여 결합되지 않은 잔류물을 제거합니다. 세척된 골격을 액체 질소로 스냅 동결합니다.
그리고 다시 한 번 lifalyzing 후 추가 연구를 위해 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 녹색 형광 단백질을 운반하는 4점 5배 10으로 코팅된 3D 골격을 1mL의 완전한 DMEM으로 채워진 2점 0밀리리터 극저온 바이알에 담아 이전에 코팅된 3D 골격을 전사하고 5일 동안 진탕하면서 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양 12시간마다 골격에서 방출된 렌티바이러스 입자가 포함된 배지의 1ml 샘플을 수집하고 1ml의 새 배지로 교체합니다.
HEK293T 세포를 형질도입하려면 먼저 12웰 플레이트에서 배양된 HEK293T 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 이전에 수집된 배지 1ml를 세척된 HEK293T 세포에 추가하고 가습된 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 48시간 배양 후 유세포 분석으로 GFB 양성 HEK293T 세포의 수를 측정하여 생체 활성 렌티바이러스 입자의 수를 측정합니다.
먼저 C57 블랙 6마리 마우스를 각각 14마리의 대조군, PH 및 PHp의 세 가지 치료 그룹으로 무작위로 나눕니다. 마취된 쥐의 머리 피부를 면도하고 요오드 팅크제와 75% 알코올 용액으로 표면을 소독합니다. 마우스의 머리를 정위 도구에 놓고 메스로 피부 크기를 조정 한 다음 가위를 사용하여 1cm 직선으로 자릅니다.
멸균 면봉을 사용하여 두개골 뼈에서 골막을 긁어내어 표면을 드러냅니다. 그런 다음 두개골의 왼쪽에 트레핀 버로 직경 4mm의 임계 크기 결함을 만듭니다. 골격을 뼈 결손의 측면에 이식합니다.
안과 겸자를 사용하여 수술 부위를 골막으로 부드럽게 덮습니다. 그런 다음 절개 부위당 3바늘을 꿰매어 상처를 봉합합니다. 마지막으로, 진통제인 부프레노르핀을 투여하여 수술 후 통증을 조절하고 동물이 깨어날 때까지 체온을 유지하기 위해 발열 패드에 동물을 유지합니다.
생쥐가 의식을 되찾으면 음식과 물을 주고 실험이 끝날 때까지 생쥐의 일상 생활을 모니터링한다. TPEF 및 SHG 이미징을 위한 다중 광자 현미경 시스템을 조립한 후 펨토초 티타늄 사파이어 레이저를 860나노미터로 조정합니다. 새로 형성된 혈관을 시각화하기 위해 식염수에 10밀리그램 덱스트란 용액 200마이크로리터를 마우스에 정맥 주사한 다음 정위 도구를 사용하여 마취된 동물을 가열판에 고정시켜 체온을 섭씨 37도로 유지합니다.
탈수를 방지하기 위해 마우스에 200마이크로리터의 식염수를 복강내로 주입합니다. 마지막으로, 이미징 중에 충분한 마취와 진통제를 유지하기 위해 100% 산소에 3%의 이소플루란 혼합물을 동물에게 제공합니다. 이미징을 시작하려면 한 쌍의 갈보 미러를 스캔하여 512 x 512 마이크로미터 샘플링 영역을 만듭니다.
그런 다음 NA one point O Water Immersion 대물 렌즈를 사용하여 여기 빔을 샘플에 초점을 맞추고 후방 산란 TPEF HSG 신호를 수집합니다. 대조군의 정상적인 뼈 영역과 결함의 가장자리를 덮도록 시야를 설정하되, PH 또는 PHp 그룹에서 동물을 이미징할 때 이식된 골격만 덮도록 설정합니다. 그런 다음 결함의 5개 다른 부위를 스캔합니다.
2시간의 이미징 기간 동안 12초마다 이미지 스택을 획득합니다. 여기에 제시된 것은 3D 프린팅 기술로 준비된 스캐폴드의 사진과 준비된 재료의 전반적인 다공성을 보여주는 마이크로 CT 이미지입니다. 스캐폴드의 미세 다공성 구조는 5000배 배율로 획득한 SEM 이미지에 표시됩니다.
위에서 살펴본 바와 같이, 골격에서 방출된 렌티바이러스 입자를 함유한 배지로 처리된 HEK293T세포는 녹색 형광 단백질을 효율적으로 발현시켰습니다. 유세포 분석으로 추정한 바와 같이, 방출된 입자의 총 수는 약 40%에 달했습니다. 가장 강력한 방출 효과는 연구 시작 후 처음 24시간 이내에 관찰되었으며 시간이 지남에 따라 점차 감소하여 골격에 코팅된 렌티바이러스 입자가 최대 96시간 동안 생물학적 활성을 유지하는 것을 확인했습니다.
종골 결손 내에서 형성된 혈관에 대한 생체 내 분석은 새로운 혈관이 마우스의 대조군에서는 검출되지 않았지만 골격 이식 후 8주 후에 PH와 PHp 그룹 모두에서 명확하게 볼 수 있음을 보여주었습니다. 또한, PH와 PHp 그룹 모두에서 많은 콜라겐 침착 부위가 검출되었지만, PHP 그룹에서만 골격으로 성장하는 작은 혈관의 수가 증가하고 전체 혈관 면적이 크게 달랐습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 아티팩트를 피하기 위해 스캔하는 동안 마우스 머리를 움직이지 않도록 고정하여 가만히 두는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 심층 조직 이미지와 같은 추가 데이터를 제공하기 위해 광음향 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 뼈 재생 분야의 연구자들이 이식의 혈관 신생을 조사할 수 있는 길을 열었습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 3D 지지체에서 생체 내 플라즈마 형성을 실시간으로 시각화하는 방법과 미광자 현미경 검사를 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 연구는 3D 스캐폴드 내에서 다중광자 현미경을 사용하여 생체 내 및 실시간으로 혈관 형성을 시각화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 연구는 마우스 두개골 임계 골 결손 모델 내의 유전자 변형 스캐폴드에서 혈관신생에 초점을 맞추며, 대조군에 비해 치료군에서 더 많은 수의 새로운 혈관이 형성되는 것을 보여줍니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 혈관신생
배경
- 혈관 형성은 조직 공학 및 재생 의학에 매우 중요합니다.
- 혈관신생을 이해하면 골 재생 전략을 개선할 수 있습니다.
- 다중광자 현미경을 사용하면 혈관 역학을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.
- 유전자 변형 스캐폴드는 혈관신생 반응에 영향을 줄 수 있습니다.
연구 목적
- 3D 스캐폴드 내에서 생체 내 혈관 형성을 시각화하기 위함입니다.
- 유전자 변형 스캐폴드가 혈관신생에 미치는 영향을 평가하기 위함입니다.
- 혈관 발달의 실시간 이미징을 위해 다중광자 현미경을 활용하기 위함입니다.
사용된 방법
- PLGA 및 nHAP의 균질 용액 준비.
- 스캐폴드 인쇄를 위한 균일한 페이스트를 만들기 위한 자기 교반기의 사용.
- 실시간 시각화를 위한 다중광자 현미경의 구현.
- 치료군과 대조군 간의 혈관 형성 비교.
주요 결과
- 치료군에서 혈관 형성의 증가가 관찰되었습니다.
- 실시간 이미징은 혈관신생 과정에 대한 통찰력을 제공했습니다.
- 프로토콜은 스캐폴드의 효과를 성공적으로 입증했습니다.
- 연구 결과는 조직 공학에서의 혈관화 이해에 기여합니다.
결론
- 이 연구는 고급 이미징 기술을 사용하여 생체 내 혈관신생을 성공적으로 시각화했습니다.
- 유전자 변형 스캐폴드는 혈관 형성의 증가를 보여주었습니다.
- 이 접근 방식은 골 재생 및 조직 공학 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Real-time visualization of angiogenesis within 3D biomaterial scaffolds addresses a critical bottleneck in bone tissue engineering by enabling direct assessment of vascular integration and scaffold performance. Multiphoton microscopy provides high-resolution, minimally invasive imaging to support predictive confidence in scaffold-driven bone regeneration. This capability informs early-stage portfolio decisions and de-risks translational advancement of engineered constructs for critical defect repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of angiogenic response to genetic scaffold modifications in vivo.
- Supports biological de-risking by visualizing vascular integration at the tissue–scaffold interface.
- Facilitates predictive confidence in scaffold design for regenerative applications.
Screening & Assay Development
- Provides a validated 3D in vivo system for quantifying blood vessel formation in response to scaffold modifications.
- Enables reproducible, quantitative imaging outputs for comparative assessment of scaffold candidates.
- Supports standardization of angiogenesis assays for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold performance with disease-relevant vascularization endpoints in preclinical bone defect models.
- Enables continuity from discovery-stage scaffold optimization to preclinical validation of regenerative efficacy.
- Supports risk-adjusted advancement of scaffold technologies based on real-time vascularization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This multiphoton microscopy-based workflow bridges early discovery, scaffold optimization, and preclinical validation for bone regeneration programs.
- Discovery Biology: Visualizes and quantifies in vivo angiogenesis to clarify scaffold–host interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for candidate scaffold evaluation.
- Analytics: Provides volumetric and temporal data on blood vessel formation for comparative analysis.
- Translational Research: Connects scaffold design to preclinical vascularization and bone regeneration outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse tissue engineering and regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in scaffold-driven angiogenesis and bone repair.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging and quantification of vascularization in 3D scaffolds.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for scaffold advancement based on real-time biological integration.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of scaffold technologies for critical defect repair.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiphoton microscopy and in vivo imaging protocols.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and animal surgical facilities.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification parameters.
- Adaptation may be needed for different scaffold materials or defect models.
- Imaging artifacts can arise from animal movement, requiring careful immobilization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Scaffold Preparation
7:00
Results: 3D Scaffolds Promote Angiogenesis in Bone Defects
8:33
Conclusion
3:51
Crtitical Bone Defect Model and Scaffold Transplantation
5:21
In Vivo Imaging of Angiogenesis within the Bone Defect
2:30
Lentivirus Particle Release and Transduction Capacity
