Name: Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 다광자 현미경을 이용해 생체 내 혈관 형성을 실시간으로 시각화하는 방법을. 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 스캐폴드를 사용하여 쥐 두개골 결손 모델에서 혈관 신생을 관찰하고 조직 재생 연구에 활용합니다.

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이 연구는 심천 공작 프로그램, 중국 (No. 110811003586331), 심천 기본 연구 프로그램 (제에 의해 지원 되었다 JCYJ20150401150223631, 호 JCYJ20150401145529020, 및 번호 JCYJ20160331190714896), 광 동 공공 연구 및 용량 건물 특별 프로그램 (No. 2015A020212030), 중국 (No. 81501893)의 국가 자연과학 기초, 중국 (2013CB945503)의 국가 주요 기본 연구 프로그램 그리고 민 혁신 프로그램 우수 젊은 연구자 (Y5G010).

동물 보호 관리 및 사용의 실험실 동물의 광 동성에 대 한 가이드 준수 했다. 모든 절차는 감독 및 동물 연구, 심천 연구소의 첨단 기술, 과학의 중국 아카데미에 대 한 윤리 위원회의 승인 아래 수행 했다.
 1. lentiviral (LV) 생산 Spe를 사용 하 여 세포 발기인의 하류 <ol><li>lentiviral 식 벡터 (pLenti6/5-eGFP 또는 LV eGFP)에 사용자 지정 다중 복제에 pdgf b cDNA 클론 사이트 나 고 샐 내가 pLenti6/5-PDGFB-eGFP 플라스 미드 (LV-pdgfb) 25 구성 제한 사이트.</li>
	<li>공동 바이러스 포장 플라스 미드 (pLP1, pLP2, 및 pVSV G)와 transfecting에 의해 HEK 293 피트 셀에서 lentiviral 입자 (LV-pdgfb)을 생산 클로로퀸과 인산 칼슘 표준 방법을 사용 하 여 (최종 농도: 25 µ M) 25.</li> <li>transfection의 48 h 후 수확 하 고 포함 하는 바이러스의 500 mL 필터링 필터 (0.45 μ m)와 표면에 뜨는. 그 후, ultracentrifugation 89000 x g 2 h. Resuspend 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), aliquot의 200 µ L에 대 한에 의해 바이러스 성 입자를 집중 하 고-80에서 저장 ° c.</li>
	<li>Lentivirus titer를 확인 하려면 24 시간 연속적으로 희석 lentiviral 솔루션 HEK293T 셀을 품 어 하 고 앞에서 설명한 25 lentiviral titer 계산.</li>
</ol> 2. 3D 인쇄 PLGA/nHAp 건설 기계 및 동원 정지 LV의 제조 균질 솔루션 1, 4-dioxane의 20 ml에서 <ol>(폴 리 D, L-lactide-co-glycolide) PLGA의 분해 20 g <li>소재. Nanosized 우연 (나노-hydroxyapatide) 파우더 (nHAp)의 2 세대 솔루션을 추가 합니다; PLGA: nHAp 비율 10:1 (w/w) 이어야 합니다.</li>
	<li>혼합된 솔루션을 적극적으로 저 어 (교 반 속도: 1500 rpm) 16 h 유니폼 붙여넣기를 형성 하는 자력을 사용 하 여 실내 온도에. 미리 디자인 된 모델 26;에 따라 붙여넣기 레이어, 레이어, 하단 맨 위로, 예금 전산화 노즐 3 차원 낮은 온도 프린터를 사용 하는 다공성 PLGA/nHAp 건설 기계에 그것을 조작합니다 기 공 크기는 장비의 범위는 200에서 400 µ m.</li>
	<li>진공 freeze-dry 용 매를 가능한 한 완전히 제거 하 48 h에 대 한 건설 기계. 살 균에 대 한 1 시간을 위한 75% 에탄올 솔루션에는 건설 기계를 흡수 하 고 중립, 무 균 건설 기계를 얻으려면 lyophilize. 
	참고: 진공 동결에 대 한 주요 매개 변수 포함 응축 온도 (° C) 및 진공도 (Pa). 45의 진공도 따라 Pa, PLGA/nHAp 건설 기계 진공 48 h 철저 하 게 용 매를 제거를 위한-78 ° C에서 동결된 했다.</li>
	<li>LV 입자의 추가 10 µ L (4.5 x 10 5) PLGA/nHAp 각 하 (4 m m x 2 m m x 4) 발판 및 흡착 수 있도록 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한 건설 기계를 품 어.</li>
	<li>Immobilization, 후 린스 언바운드 LV 입자를 제거 하는 PBS로 두번 건설 기계. 스냅-액체 질소에 LV 입자 코팅 건설 기계를 동결, 다시, lyophilize 및 나중에 사용-80 ° C에 저장.</li>
</ol> 3. 생체 외에서 건설 기계 및 LV 변환 활동 분석 결과에서 LV 입자 방출의 속도 론 <ol><li>품 3D 건설 (4 m m x 2 m m x 4) 기계 운반 LV 녹색 형광 단백질 (LV-eGFP, 10 5 LV 입자 x 4.5) 2.0 mL 극저온에서 완전 한 DMEM 1 mL에 5 일 동안 떨고와 37 ° C에서 튜브.</li>
	<li>1 mL 샘플 마다 12 h 12 h에서 120 h 후 부 화를 하 고 매체를 대체. 각 시간 지점에서 추가 대신 인큐베이션 매체의 1 mL 신선한 매체의 1 mL.</li>
	<li>수집 된 미디어를 사용 하 여 48 h. 흐름 cytometry 27에 의해 세포 GFP-긍정적인 HEK293T의 수를 결정 하 여 생리 LV 입자 수 측정에 대 한 공동 배양 하 여 HEK293T 셀 transduce.
	<li><ol>HEK293T 셀을 시험 하기 전에 문화 매체를 제거 하 고 두 번 PBS와 HEK293T 세포를 씻어. Lentivirus를 포함 하는 수집 된 미디어 (1 mL/음) 잘 하는 건설 기계에서 발표 추가 하 고 37 ° c 습도 인큐베이터에서 48 h에 대 한 HEK293T 셀으로 문화.</li>
	</ol></li></ol> 4. 생체 외에서 골 수 파생 된 MSC (BMSC) 마이그레이션 평가 <ol><li>마이그레이션 분석 결과 전에 준비 BMSCs 토마토 형광 단백질 (BMSCs T)와 PDGF BB 단백질 (BMSCs P) 28.</li>
	<li>Boyden 챔버 8 µ m의 기 공 크기는 24-잘 접시와 폴 리 카보 네이트 필터를 사용 하 여 BMSC 마이그레이션 분석 결과 수행.
	<ol><li>장소 BMSCs의 0.5 mL (5 x 10 4) 위 약 실에서 토마토 형광 단백질 (BMSCs T)를 표현 하는 LV와 페. BMSCs의 0.5 mL를 배치 (2 x 10 5) 더 낮은 약 실에서 PDGF BB 단백질 (BMSCs-P)를 표현 하는 LV와 페.</li>
	</ol></li> <li>이 실험에서 6 개 그룹을 포함 하 고 각의 더 낮은 구획에 500 µ L을 추가. 
	A. 빈 제어, 혈 청 무료 중간만 B. FBS 제어, 중간 10% 보충 FBS C. PDGF BB 제어, 혈 청 무료 매체에서 4 ng/mL PDGF BB D. PDGF BB 압류 그룹, PDGF BB (4 ng/mL)와 안티-PDGF-BB (4 ng/mL)에 polyclonal 항 체 혈 청 무료 매체 E. BMSC 그룹, 혈 청 무료 매체에서 2 x 10 5 BMSCs F. BMSCs-P 그룹, 2 x 10 5 BMSCs-P 세럼 무료 매체.</li>
	<li>5% CO 2와 37 ° C 습도 인큐베이터에서 48 h에 품 어. 나중에, 낮은 챔버에 마이그레이션된 셀을 제거 하 고 cytometry에 의해 그들을 BMSCs-T의 수의 정량화에 대 한 수집.
	<li>제거 낮은 챔버에 마이그레이션된 셀 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 측면 및 2 mL PBS의 마이그레이션된 셀 resuspend <ol>. 교류 cytometry 29에 의해 마이그레이션된 BMSCs-T 수를 계량.</li>
	</ol></li></ol> 5. Murine Calvarial 중요 한 뼈 결함 모델 및 비 계 이식의 설립 참고: 남성 BALB/c 마우스 (7 주 이전) 광 동 의료 실험실 동물 센터 (광 동, 중국)에서 구입 했다.
Calvarial 뼈 결함에 대 한 <ol><li>등록 42의 총 남성 쥐 실험. 다음과 같은 치료를 수신 하는 각 그룹에서 14와 3 그룹으로 쥐를 무작위로 분할: 그룹 A, 임 플 란 트; 그룹 B, PH 건설 기계 이식 (PLGA/nHAp); 그리고 그룹 C, PHp 건설 기계 이식 (PLGA/nHAp/LV-pdgfb).</li>
	<li>Anesthetize 나트륨 pentobarbital (50 mg/kg)의 복 관리와 동물. Depilatory 붙여 털을 제거 하 고 첫 번째 절 개를 하기 전에 75% 알코올 솔루션으로 머리 피부를 청소. 아직도 수술 동안 계속 정위 적 악기와 함께 각 마우스의 머리를 해결.</li>
	<li>메스와 초기 절 개 하 고 재치 확대1 cm 선형 피부 절 개를 만드는 h가 위. 멸 균 면봉을 사용 하 여 두개골의 뼈 표면을 두개골의 뼈에서과 다쳤어요.</li>
	<li>판형 버를 사용 하 여 calvaria 30의 왼쪽에 4 m m 직경 임계 크기 결함을 만들. 뼈의 결함 사이트에 발판을 이식. 
	참고: 중요 한 크기 결함 (CSDs) 원래로 정의 된 &#34; intraosseous 가장 작은 크기는 특정 뼈와 동물의 수명 기간 동안 자발적으로 치료를 하지 것입니다 동물의 종에 상처 &#34;이 실험, 4 mm 직경 결함에 중요 한 크기 뼈 결함에 따라는 이전 연구 31 , 32.</li>
	<li>안과 집게를 사용 하 여 외과 사이트를 커버 하기에과 다시 부드럽게 이동. Cm 당 3 개의 바늘으로 베인된 피부 봉합.</li>
	<li>는 post-operational 치료를 수행합니다. 통증을 완화 하 고 진통 buprenorphine (0.1 mg/kg)를 관리 합니다. 동물 깨어난다 때까지 열 패드와 체온을 유지 한다. 연속적으로, 음식 및 물 동물 먹이 그리고 매일 테스트의 끝까지 그들의 활동을 기록. 참고: 이전에 절차에 따라 당신의 현지 동물 보호 위원회 지침. 관리할 수 진통</li></ol> 6. Vivo에서 신생 내에 뼈 같이 결함이 MPM의 이미징 참고: FITC 활용 250 kD dextran (10mg/mL) 식 염 수에 높은 SNR (신호 대 잡음 비율) 새로운 혈관의 이미지를 쥐에 주입 정 맥 했다 33 이전 연구 따르면. 참고로이 생존 절차입니다. <ol><li>2 광 양자 흥분된 형광 (TPEF)와 두 번째 고조파 생성 (SHG) 신호 이미징 multiphoton 현미경 (MPM) 시스템 조립.</li>
	<li>는 Pentobarbital 나트륨 (50 mg/kg)의 복 주입으로 동물을 anaesthetize 하 고 동물 실험을 통해 37 ° C에서 체온을 유지 하기 위해가 열 플레이트에 고정. 100% 산소에서 3.0 %isoflurane 가스를 사용 하 여 이미징 프로세스 동안 만족 스러운 마 취와 무 통을 유지. Intraperitoneally 염 분 (200 µ L/동물) 이미징 하기 전에 탈수를 방지 하기 위해 주입.</li>
	<li>조정 860에 펨 티타늄 사파이어 레이저 nm. Galvo 거울의 쌍을 검색 하 여 512 x 512 µ m 샘플링 영역을 만들고 사용 하 여 focusthe 여기 광속 NA1.0 물 침수 렌즈 샘플에 backscattered TPEF/SHG 신호를 수집. 
	참고:는 이미지는 홈-빌드 multiphoton 현미경 이미징 시스템 (MPM)에서 수행 되었다. 이미징, 동안 펨 티타늄 사파이어 레이저 860 조정 최적의 여기 파장으로 nm. 레이저 빔 래스터 검 류 계 거울의 쌍을 사용 하 여 샘플 평면에 걸쳐 스캔 했다. 685의 dichroic 거울을 통과 후 nm, 빔 20 X NA1.0 목표에는 표본에 집중 했다. 유도 TPEF SHG 신호는 동일한 목적에 의해 수집 되었다. 신호는 위에서 언급 한 고 680 nm 짧은 패스 필터에 의해 순화 dichroic 거울에 의해 여기 레이저에서 분리 했다. TPEF 및 SHG 신호 섬유 번들에 의해 수집 된 되었고 한 분을 실시. 검출기에는 분 광 전 증폭 관 관 (Pmt)의 선형 배열 했다. 400에서 16 연속 스펙트럼 대역에 신호를 기록 하는 기능을 제공 하는 분 및 선형 배열 Pmt의 조합 600 nm nm, 12.5 nm 간격. 따라서, TPEF 및 SHG 신호는 동시에 감지 되었고 스펙트럼 도메인에서 분리. 또한, 3D 영상에 대 한 축 모터 이미징 깊이 제어 하 사용 되었다. 각 이미지의 영역 512 x 512 µ m로 설정 했다 고 깊이 간격 2 µ m (제어 그룹, 5 µ m)로 설정 되었습니다. 특히, 각 결함에 5 사이트 통계적 데이터를 수집 하는 몇 군데 했다 하 고 선택 된 이미징 사이트 결함에 따라 균등 하 게 하 고 무작위로 배포 했다.</li>
	<li>혈관 형성을 측정 하기 위해 통계적으로 중요 한 데이터를 수집 하려면 각 결함에 스캔 5 사이트.
	<ol><li>사용 검색 사이트는 결함에 따라 균등 하 게 무작위로 배포. 컨트롤 그룹에 대 한 필드의 원래 뼈 지역 및 결함의 가장자리 (FOV) 커버를 볼 하지만 PH 및 PHp 그룹에 대 한 FOV 이식된 발판에.</li>
		<li>메스를 사용 하 여 1 cm 선형 피부 절 개를 하 고 이식 사이트를 공개를 고정에 열려 피부를 봉합 합니다. 한 방울의 물 찍기 렌즈와 물 유리를 이식 사이 주사기를 사용 하 여.</li>
	</ol></li> <li>취득 이미지 스택 모든 12 기간 이미징 2 h 이상 s. 표시 및 사용자 지정 MATLAB 프로그램을 사용 하 여 체적 데이터를 분석 하 고 계량 ImageJ 소프트웨어 34 , 35와 혈관 영역.</li>
</ol> 7. Pdgf b와 실시간 정량 Pcr에 의해 신생 관련 유전자의 유전자 표정 분석 참고: 일반적인 단계 PCR 수행: 95 ° C 30에 대 한 s, 5 95 ° C의 40 주기 들, 그리고 30 s. 포스트 PCR 용 해를 위한 60 ° C 곡선 확인 단일 대상 확대의 특이성 그리고 β-말라 상대적인 관심사의 유전자의 배 변경 결정 했다. 각 샘플에 대 한 반응이 세 번 테스트를 했다.
<ol><li>수확 건설 기계와 2, 4, 및 8 주 후 작업 36에서 실험 쥐에서 조직 이식; 제어 그룹 샘플 (n = 4), 인접 한 뼈 조직에서 해야한다 같은 시간 지점에서 촬영. 
	참고: 각 시간 시점에서 (2, 4, 8 주), CO 2 흡입와 쥐 안락사. 해 부는 calvaria, 그 후, 제거 하 고는 calvaria에서 이식된 건설 기계 수확.</li>
	<li>상업용 시 약을 사용 하 여 제조 업체에 따라 각 샘플에서 총 RNA 추출을 &#39; s 프로토콜. 역방향 전송 키트를 사용 하 여 역방향-cDNA 제조 업체 다음으로 RNA 녹음 &#39; s 프로토콜.</li>
	<li>SYBR 녹색 탐지 시스템;를 사용 하 여 수행 양적 실시간 PCR 뇌관 표 1에 나열 됩니다.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td colspan="8"> Primer(5&#39;&#8211;3&#39;)</td></tr> <tr><td colspan="2" rowspan="1"> 유전자</td>
			<td colspan="2" rowspan="1"> 앞으로</td>
			<td colspan="4" rowspan="1"> 리버스</td></tr>
		<tr><td>pdgfb</td> <td colspan="3"> CATCCGCTCCTTTGATGATCTT</td> <td colspan="4"> GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT</td></tr>
		<tr><td>vWF</td> <td colspan="3"> CTCTTTGGGGACGACTTCATC</td> <td colspan="4"> TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC</td></tr>
		<tr><td>VEGFR2</td> <td colspan="3"> GAAATGACACTGGAGCCTACA AG</td> <td colspan="4"> TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G</td></tr>
		<tr><td>β-말라</td> <td colspan="3"> GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG</td> <td colspan="4"> GCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT</td></tr></tbody>
</table> 표 1: Pimer 세트.
 8. 뼈 재생의 MicroCT 분석 <ol><li>8 주 후 작업에 CO 2 흡입와 Euthanize 쥐. 통풍이 잘되는 환경에서 부드럽게 각 마우스 청소 마우스 케이지로 놓고 anaesthetize는 안락사 하기 전에 마우스를 케이지로 CO 2 가스 펌프.</li>
	<li>뼈 결함 영역의 microCT 이미징 두개골 해 부. 사용자는 다음과 같은 실험에서 매개 변수 검색: 9 µ m 해상도, 알 0.5 m m 필터, 50 kV 전압 및 현재 142 µ A.</li>
	<li>정찰구조체 상용 소프트웨어를 사용 하 여 모든 영상 데이터는 회사에 의해 제공. CTAn 소프트웨어의 보정 기능을 사용 하 여 스캔 보정. 
	주: 각 검사에 쥐에서 Hounsfield 단위 (HU) 두고.</li>
</ol>

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

뼈는 지속적으로 치유 하 고 개별1의 일생 내내 개장 독특한 용량 매우 vascularized 조직 이다. Vascularization의 레벨은 골 및 결함 수리를 위해 중요 하다. 낮은 vascularization 조직 공학 뼈의 넓은 임상 응용 프로그램을 제한합니다. 건설 biomimetics의 이론에 따르면 매우 vascularized 조직 공학 뼈 큰 세그먼트 뼈 결함을 복구 하기 위한 도구가 되고있다. 장비의 다양 한 종류는 비교적 작은 뼈가 있는 결함을 수리에 성공적으로 적용 되었습니다. 그러나, 중요 한 뼈 결함, 아직도 얼굴 장애물, 복구 장비의 응용 프로그램에 대 한 부족 한 혈액 때문에 주로 공급 결함 수리에 대 한. 따라서, 큰 뼈 결함 복구의 과정에서 혈액 공급을 개선 조직 공학의 주요 문제 중 하나입니다.
수 있는 자극, 모집, chemotaxis, 차별화, 그리고 에 있는 neov...

뼈는 개별1의 수명 기간 동안 개장 하 고 매우 vascularized 조직 이다. 큰 뼈 결함 없앤 외상, 종양 절제, 또는 craniofacial 기형 발생의 신속 하 고 효과적인 뼈 재생 복잡 한 생리 적 과정 이다. 뼈 결함 수리를 위해 사용 하는 전통적인 치료 접근 포함 autograft와 이식 이식, 하지만 그들의 사용을 포함 여러 문제 및 제한 사항, 제한 된 가용성, 중요 한 기증자 사이트 병 적 상태, 감염의 위험이 높은 고 면역 거부2,3호스트. 그러나, 인공 뼈 이식 이러한 제한을 완화 하는 효율적인 대안을 제공 합니다. 그들은 생 분해성 소재로 만들어질 수 있다, 적당 한 기 공 크기, 조작 하기 쉬운 하 고 유전자 변형된4,5일 수 있다.
현재, 다양 한 조직 엔지니어링 건설 기계 조직 공학 뼈6,7의 개발에 고용 되었다 있다. 뼈 수리 및 재생을 보다 효과적으로 유도 하기 위해 설계 된 바이오 성장 인자와 함께 등장 있고 달성 좋은 결과8,9. 불행 하 게도, 짧은 반감기, 잃게 쉬운 활동 및 치료 효능에 대 한 성장 인자의 supraphysiological 복용량 그들의 임상 응용 프로그램10을 제한합니다. 이러한 문제를 해결 하려면 대신 성장 인자 성장 인자 유전자의 뼈가 있는 결함과 질병11,12의 치료에 대 한 bioactivity를 유지 하는 효과적인 방법으로 입증 되었습니다. 바이러스 성 벡터는 유망한 납품 효율성13를 표현 하는 그들의 높은 인해 조직 재생에 대 한 도구.
성장 요인 중 혈소판 파생 된 성장 인자 (PDGF-BB)에서 선정 되었다이 연구는 물질과 엽 고 osteogenic 셀, chemoattractant 뿐만 아니라 신생14,15 에 대 한 자극 제 이기 때문에 . 이전 전 임상 및 임상 연구는 PDGF BB 홍보할 수 있는 안전 하 고 효과적으로 잇 몸 뼈가 있는 결함16,17뼈 수리 했다. 최근 연구 PDGF BB 동기 부여 내 피 세포 이동과 확산 vivo에서18,19신생을 자극 한다는 것을 밝혔다. 또한, PDGF BB 렌더링할 수 있습니다 또한 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 내 피 세포20, 그리고이 더 하이라이트에 neovascularization에서 MSCs의 잠재적인 역할을 차별화 할 수 있습니다. 따라서, 맥 관 구조 건설 기계 PDGF BB와에 드 노 보 형성 유도 뼈 조직 공학에서 공중 발판으로 성장 하는 조직의 수리를 위해 중요 한 단계입니다.
뼈 결함 치유 조정된 골 및 신생 수리 위치21에서 요구 하는 동적 조직 전체적 프로세스입니다. 이식된 조직 설계 건설 기계에 Neoangiogenesis 영양분 및 산소 성장 및 생존 및 변화 낭비를 제거 하기 위한 세포 공급에 대 한 필수적인 전제입니다. 일반적으로 사용 하는 이미징 방법, 엑스레이 포함 하 여 마이크로-계산 단층 (microCT), 자기 공명 영상 (MRI), 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 그리고 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 대신 적용 됩니다. 신생 정보22,23를 조직학 검사. 그러나, 이러한 방법을 시각화 및 뼈 조직 공학에서 3D 건설 기계에 neovasculature 측정에 다양 한 장애물의 얼굴. Multiphoton 현미경 (MPM)는 동시에 세포, 세포 외 기질, 시각화 및 주변 혈관 네트워크의 뚜렷한 장점이 비교적 새로운 바이오 이미징 기술 vivo에서. 그것은 깊은 조직 침투에 대 한 고유의 3 차원 이미징 능력을 소유 하 고 낮은 photodamage 발생. 따라서, 지난 10 년간, MPM 생물 의학 연구24, 신경 과학, 면역학, 줄기 세포 역학 등에서 많은 관심을 얻고 있다. 그러나, 그것은 거의 정형 외과 연구에 사용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA)</td><td>Sigma</td><td>P1941</td><td>L/G 비율 75:25, MW 66000-107000</td></tr><tr><td>하이드록시아파타이트 나노입자</td><td>시그마</td><td>702153</td><td>평균 직경 < 200 nm</td></tr><tr><td>클로로퀸 디포스페이트 염</td><td>시그마</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated 250-kD 덱스트란</td><td>시그마</td><td>FD250S</td><td></td></tr><tr><td>1,4-디옥산</td><td>링펑, 상하이</td><td></td><td>0.45 미크론</td></tr><tr><td>Stericup 필터</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB Cdna</td><td>Sino Biological, Inc</td><td>MZ50801-G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDGF-BB 마우스 다클론 항체</td><td>&nbsp; BioVision, Inc</td><td>5489-30T</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB 재조합 단백질</td><td></td><td>4489-50</td><td></td></tr><tr><td>칼슘-인산염 형질주입 솔루션</td><td>Promega Corporation</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>L-DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15140122 FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Transwell&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>남성 BALB/c 마우스</td><td>Guangdong Medical Laboratory Animal Center&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소듐 펜토바르비탈&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1063180500</td><td></td></tr><tr><td>다광자 현미경 이</td><td></td><td></td>광자 여기 <td>형광(TPEF) 및 2차 고조파 발생 신호(SHG)를 감지하기 위해 Shenzhen Institutes of Advanced Technology에서 만든 홈메이드입니다.</td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Keyuan, Shandong</td><td>401750169</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT 마스터 믹스 (Perfect Real Time)</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 및 eosin</td><td>Beyotime</td><td>C0105</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Leica& 주의;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 OPtima L-100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>저온 프린터&nbsp;</td><td>칭화 대학교</td><td></td> 집에서 <td>만든 Tsinghua 대학교</td></tr><tr><td>LightCycler 480 기기&nbsp;</td><td>로슈</td><td>5815916001</td><td></td></tr><tr><td>microCT</td><td>Bruker</td><td>1176</td><td></td></tr><tr><td>상용 소프트웨어</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 vivo에서 유전자 변형 3d-plga/nhap 비 계에 의해 신생 시각화

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

비판적으로 크기의 뼈 결함의 재건 복구, 충분 한 혈액 공급의 부족 하 고 새로운 조직의 괴 사를 일으키는 동안 가난한 신생 조직 엔지니어링 건설 기계 내에서 인해 심각한 임상 문제 남아 있다. 신속한 vascularization 새로운 조직의 생존 및 기존 호스트 조직 통합에 대 한 중요 한 전제 조건입니다. 맥 관 구조 건설 기계에서의 드 노 보 세대 뼈 재생 좀 더 효율적인, 수 있도록 복구를 발판으로 성장 하는 조직에서 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 이 문제를 해결 하려면 소재 비 계의 유전 수정 골 신생을 촉진 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 시각화 및 추적 vivo에서 실시간으로 3 차원 (3D) 건설 기계 또는 새로운 뼈 조직에 혈관 형성은 여전히 뼈 조직 공학에 대 한 장애물. Multiphoton 현미경 (MPM) 고해상도 및 최소한-침략 적 방식으로 생물학 구조에서 체적 데이터를 취득할 수 있는 새로운 바이오 이미징 양식 적임 이다. 이 연구의 목적은 multiphoton 현미경에 vivo에서 calvarial 중요 한 뼈 결함 수리에 대 한 유전자 변형된 3D-PLGA/nHAp 비 계에 신생을 시각화 했다. PLGA/nHAp 건설 기계 했다 공업화 신생을 촉진 하 고 뼈 재생을 향상 하려면 lentiviral 벡터 (LV-pdgfb)를 들고 성장 인자 pdgf b 유전자의 지속적인된 납품에 대 한. 비 계 이식 calvarial 중요 한 뼈에서 마우스 모델을 결함, PHp 건설 기계에서 혈관 영역 (BVAs) PH 건설 기계에서 보다 훨씬 더 높은 했다. 또한, pdgf b 와 신생 관련 유전자, vWF 및 VEGFR2의 식을 대응 하 게 증가 했다. MicroCT 분석 새로운 뼈 형성을 극적으로 향상 PHp 그룹에서 다른 그룹에 비해 표시. 우리의 지식, 이것은 multiphoton 현미경 조사는 3 차원 생물 분해성 scaffold에서 vivo에서 및 실시간으로 신생 뼈 조직 공학에 사용 되었다 처음으로.

원통형 다공성 PLGA/nHAp 투어 높이 0.6 m m와 4mm 직경에서 3D 프린터 조작 했다. 장비의 형태학 스캐닝 전자 현미경과 microCT를 통해 분석 되었다. 그림 1A 이식된 발판의 사진을 보여줍니다. MicroCT 검색 공개 숨 구멍의 85% 이상 크기 200에서 400 µ m (그림 1B)에 배열 했다. Sem의 영상 시연 발판의 표면 (그림 1의 D-F) 건설 기계 내부 상호 micropores (직경 약 5-10 µ m)와 거친 microtopography 했다. 코팅된 LV eGFP 입자의 총 금액의 약 40% (4.5 x 105) 24 시간 이내 초기 버스트 효과 함께 시작 PLGA/nHAp 건설 기계에서 발표. 출시 LV 바이러스의 bioactivity 24 시간에 정상을 도달 하 고 지속적으로 감소, 1...

여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

본 실험의 전반적인 목표는 다광자 현미경을 이용하여 3차원 스캐폴드 내의 생체 내(in vivo) 혈관 형성을 실시간으로 시각화하는 것입니다. 이러한 측정은 3차원 스캐폴드 내의 생체 내 혈관 형성을 실시간으로 중화하고 유도하는 방법과 같이 골 재생 분야의 핵심적인 질문들입니다. 이 기술의 한 가지 장점은 생체 내에서 CERES, 세포외 기질 및 주변 분자 네트워크를 동시에 중화할 수 있다는 점입니다.먼저, 20 g의 PLGA와 20 mL의 1, 4 dioxane을 포함하는 균질한 용액을 준비합니다. 그런 다음, 분말 형태의 nHAP 2 g을 해당 용액에 첨가합니다. 마그네틱 교반기를 사용하여 상온에서 1500 rpm으로 16시간 동안 현탁액을 격렬하게 혼합하여, 다공성 PLGA NHAP 스캐폴드 프린팅에 사용할 균일한 페이스트를 형성합니다.출력 후, 모든 용매를 완전히 제거하기 위해 지지체를 48시간 동안 동결 건조합니다. 그 다음 75% 에탄올에서 1시간 동안 멸균합니다. 이후 다시 한번 동결 건조하여 중성 및 무균 상태의 재료를 얻습니다.다음으로, 각 스캐폴드에 4.5 × 10⁵개의 렌티바이러스 입자를 첨가하고 37 °C로 유지되는 습윤 인큐베이터에서 2시간 동안 입자가 흡수되도록 둡니다. 렌티바이러스 입자가 스캐폴드에 흡수되면, 결합되지 않은 잔여물을 제거하기 위해 2 mL의 PBS로 스캐폴드를 두 번 세척합니다. 세척된 스캐폴드를 액체 질소에 넣어 급속 냉동합니다.다시 한번 동결건조한 후, 추후 연구를 위해 -80 °C에서 보관하십시오. GFP(green fluorescent protein)를 함유한 렌티바이러스 입자 4.5 × 10⁵개로 미리 코팅된 3D 스캐폴드를 1 mL의 완전 DMEM이 채워진 2.0 mL 냉동 보관 튜브로 옮기고, 37 °C에서 흔들어주며 5일 동안 배양하십시오. 배양 12시간마다 스캐폴드에서 방출된 렌티바이러스 입자가 포함된 배지를 1 mL씩 수집하고, 이를 1 mL의 신선한 배지로 교체하십시오.HEK293T 세포를 형질전환시키기 위해, 먼저 12-well 플레이트에서 배양된 HEK293T 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음, 세척된 HEK293T 세포에 이전에 수집한 배지 1 mL를 첨가하고 가습 배양기에서 37 °C로 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 48시간의 배양 후, 유세포 분석법으로 GFB 양성 HEK293T 세포의 수를 측정하여 생물학적 활성 렌티바이러스 입자의 수를 결정합니다.먼저, C57 black six 마우스를 대조군, PH군, PHp군의 세 가지 처리군으로 각각 14마리씩 무작위로 나눕니다. 마취된 마우스의 머리 피부를 삭모하고, 요오드 팅크와 75% 알코올 용액으로 표면을 소독합니다. 마우스의 머리를 정위 고정 기구에 고정하고, 메스로 피부의 크기를 조절한 다음 가위를 사용하여 1cm 길이의 선상 절개를 만듭니다.멸균된 면봉을 사용하여 두개골의 골막을 긁어내어 표면을 드러냅니다. 그런 다음, 두개골의 왼쪽에 트레핀 버(trephine bur)를 사용하여 직경 4mm의 임계 크기 결손(critical size defect)을 만듭니다. 골 결손 부위에 스캐폴드를 이식합니다.안과용 포셉을 사용하여 수술 부위를 골막으로 조심스럽게 덮습니다. 그 후, 절개선 1cm당 3개의 봉합사를 사용하여 상처를 폐쇄합니다. 마지막으로, 수술 후 통증을 조절하기 위해 진통제인 buprenorphine을 투여하고, 동물이 깨어날 때까지 가열 패드 위에 두어 체온을 유지합니다.마우스가 의식을 회복하면 먹이와 물을 제공하고 실험 종료 시까지 일상 활동을 관찰합니다. TPEF 및 SHG 이미징을 위한 다광자 현미경 시스템을 조립한 후, 펨토초 티타늄 사파이어 레이저를 860 nanometers로 조정합니다. 새로 형성된 혈관을 시각화하기 위해, 생리식염수에 녹인 10 mg/mL dextran 용액 200 µL를 마우스에 정맥 주사한 다음, 정위 고정 장치를 사용하여 마취된 동물을 가열판 위에 고정하여 체온을 37 °C로 유지합니다.탈수를 방지하기 위해 생리식염수 200 µL를 마우스의 복강 내로 주입합니다. 마지막으로, 영상 촬영 동안 충분한 마취 및 진통 상태를 유지하기 위해 100% 산소에 3% 이소플루란이 혼합된 가스를 동물에게 공급합니다. 영상 촬영을 시작하려면, 갈바노 미러 한 쌍을 스캔하여 512 by 512 µm의 샘플링 영역을 생성합니다.그 다음, NA 1.0 수침 대물렌즈를 사용하여 여기 빔을 시료에 초점을 맞추고 후방 산란 TPEF HSG 신호를 수집합니다. 대조군의 경우 시야(field of view)가 정상 골 영역과 결손부 가장자리를 포함하도록 설정하고, PH 또는 PHp 군의 동물을 이미징할 때는 이식된 스캐폴드만 포함하도록 설정합니다. 그런 다음, 결손부의 서로 다른 다섯 곳을 스캔합니다.2시간의 이미징 기간 동안 12초마다 이미지 스택을 획득합니다. 여기 제시된 것은 3D 프린팅 기술로 제작된 스캐폴드의 사진이며, 제작된 재료의 전체적인 기공률을 보여주는 마이크로-CT 이미지입니다. 스캐폴드의 미세 다공성 구조는 5000배 배율로 획득한 SEM 이미지에 나타나 있습니다.그림에서 보듯이, 스캐폴드에서 방출된 렌티바이러스 입자가 포함된 배지로 처리한 HEK293T 세포는 녹색 형광 단백질을 효율적으로 발현하였습니다. 유세포 분석으로 추정한 결과, 방출된 입자의 총 수는 약 40%에 달했습니다. 가장 강력한 방출 효과는 연구 시작 후 첫 24시간 이내에 관찰되었으며 시간이 지남에 따라 점차 감소하였으며, 이는 스캐폴드에 코팅된 렌티바이러스 입자가 최대 96시간까지 생물학적 활성을 유지함을 확인시켜 줍니다.두개골 결손 부위 내에 형성된 혈관의 생체 내 분석 결과, 대조군 생쥐에서는 새로운 혈관이 검출되지 않은 반면, 스캐폴드 이식 8주 후 PH 및 PHp 그룹 모두에서 새로운 혈관이 뚜렷하게 관찰되었습니다. 또한, PH 및 PHp 그룹 모두에서 많은 콜라겐 침착 부위가 검출되었으나, PHp 그룹에서만 스캐폴드 내부로 성장하는 작은 혈관의 수가 증가하는 것이 관찰되었으며, 전체 혈관 면적 또한 유의미한 차이를 보였습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 스캔 중 아티팩트가 발생하는 것을 방지하기 위해 마우스의 머리를 고정하여 움직이지 않게 하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 광음향 영상과 같은 다른 방법을 수행하여 심부 조직 영상과 같은 추가 데이터를 제공할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 골 재생 분야의 연구자들은 이식물의 혈관 신생을 조사할 수 있는 길을 열게 되었습니다.이 영상을 시청한 후면, 3D 스캐폴드 내의 생체 내(in vivo) 플라스마 형성 과정을 실시간으로 시각화하는 방법과 마이크로포톤 현미경(microphoton microscopy)에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

visualizing-angiogenesis-multiphoton-microscopy-vivo-genetically

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

소설 고해상도<em&gt; 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기&gt; 이미징 기술

혈관은 성공적인 조직 공학의 접근 방법의 핵심입니다. 따라서, 신뢰성있는 기술은 조직 구조에서의 혈관 망의 발달을 평가하기 위해 필요하다. 여기서 우리는 시각화 및 생체 내에서 혈관 생성을 정량화하기 위해 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시한다.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

자가 및 동종 골 이식의 주입은 주요 두개 안면 뼈 손실을 치료하는 방법을 받아 구성한다. 그러나 혈관 신생, 세포 분화 및 골 형성 간의 상호 작용에 그래프트 조성물의 효과는 불분명하다. 우리는 이식 근접에서 혈관 신생 골 형성의 상호 의존성을 규명하는 것을 목표로 멀티 모달 이미징 프로토콜을 제시한다.

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 - 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

엔지니어링 플랩은 통합된 기능적 혈관 네트워크가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 계층 적 혈관 네트워크와 쥐 대퇴 동맥에 대한 직접적인 미세 외과 적 해부학을 포함하는 3D 인쇄 된 조직 플랩을 제작하는 방법을 제시합니다.

3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

골수 혈관 틈새의 시험관 내 모델은 중간엽 및 내피 세포를 프리캐스트 3D PEG 하이드로겔에 파종하여 설정됩니다. 틈새의 내피 네트워크, ECM 성분 및 ALP 활성은 사용된 성장 인자에 따라 다릅니다. 이 플랫폼은 진행된 암 모델에 사용할 수 있습니다.

이미징 마이크로플레이트에서 프리캐스트 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 하이드로겔을 사용하여 혈관화된 골수 틈새의 간단한 설정

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

생체 내 현미경 검사를 통해 조직 재생 및 종양 발달과 같은 동적 생물학적 과정을 연구할 수 있습니다. 매우 역동적인 조직인 calvarial bone marrow는 조혈과 혈관 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 생체 적합성 3D 프린팅 머리 고정 임플란트를 사용하면 반복적인 종방향 이미징이 가능하여 조직 역학 및 종양 미세환경에 대한 이해가 향상됩니다.

Intravital Longitudinal Imaging of Vascular Dynamics in the Calvarial Bone Marrow(갈바리골수에서 혈관 역학의 생체 내 종단 영상)

발아 및 질병의 기본이 되는 발아 혈관 신생은 복잡한 분자 및 기계적 과정을 포함합니다. 우리는 돼지 경동맥에서 발아하는 세포를 분석하여 강성 의존적 혈관 신생과 뚜렷한 리더-추종자 세포 역학을 밝히는 다재다능한 2.5D 생체 외 모델을 제시합니다. 이 모델은 조직 공학 전략 및 암 치료 접근 방식을 발전시키는 데 도움이 됩니다.

2.5D 모델: 생체 조직에서 발아 혈관 형성의 생체 외 기계적 특성화를 위한 모델

배우세요 다광자 현미경을 이용해 생체 내 혈관 형성을 실시간으로 시각화하는 방법을. 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 스캐폴드를 사용하여 쥐 두개골 결손 모델에서 혈관 신생을 관찰하고 조직 재생 연구에 활용합니다.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

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