표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

이 간단하면서도 효과적인 절차의 전반적인 목표는 표현형 및 기능 분석을 위해 자성 나노 입자를 사용하여 인간 말초 혈액에서 희귀 항원 결합 B 세포를 분리하고 농축하는 것입니다. 이 방법은 생체 내 항원 만남 전후에 희귀 항원 결합 B 세포의 표현형 및 생물학에 관한 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 특히 스티렌 플레이트나 큰 비드를 사용할 때 형상과 관련된 문제를 없애준다는 것입니다.

또한 상당히 큰 시작 세포 집단에서 희귀 세포를 분리하기 위해 유세포 분석으로 세포를 분리할 때 유속과 관련된 문제를 제거합니다. 30-50ml의 전혈을 헤파린 처리된 채혈 튜브에 모은 직후, 혈액을 멸균된 실온의 마그네슘 및 칼슘이 없는 PBS와 1:1 비율로 혼합합니다. 다음으로, 느리고 일정한 피펫 트리거 압력을 사용하여 멸균 50ml 원추형 튜브에 있는 10ml의 실온 밀도 구배 용액에 혈액 혼합물을 층을 이룹니다.

원심분리로 세포를 분리합니다. 혈장과 혈소판이 함유된 상층을 버리고 멸균 피펫을 사용하여 단핵 세포 용기 버피 코트를 새로운 멸균 50ml 튜브로 옮깁니다. 원심분리로 단핵 세포를 세척하기 위해 튜브에 최대 50ml의 PBS를 채웁니다.

그런 다음 계수를 위해 펠릿을 10ml의 새 PBS에 재현탁하고 얼음 위의 신선한 PBS에서 밀리리터당 1x10^7 세포 농도로 세포를 재현탁합니다. 마그네틱 비드 결합을 위해 세포를 염색하려면 먼저 1-2x10^6 세포 분취량을 각 형광 보상 및 형광 마이너스 원 대조군에 대해 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 적절하게 전송합니다. 다음으로, 원심분리를 통해 나머지 세포 샘플을 수집하고 펠릿을 멸균 여과된 저온 FACS 완충액에서 밀리리터당 3-6x10^7 세포 농도로 재현탁합니다.

세포 용액을 얼음 위의 4개의 FACS 튜브로 균등하게 분할하고 이 4개의 실험 샘플 분획에 인간 Fcgamma 수용체 차단 리앤트를 추가합니다. 비특이적 결합 차단 배양이 끝나면 적절한 형광 접합 세포 표면 염색 항체를 4개의 샘플 분획 모두의 세포에 추가합니다. 그런 다음, 분획 A와 D에 적절한 비오틴화 항원을 첨가한 다음, 분획 B에 충분한 부피의 표지되지 않은 항원을 첨가하여 적어도 1x10^6 어금니의 친화도를 가진 대부분의 수용체가 차단되도록 합니다.

모든 샘플을 얼음에서 30분 동안 배양한 후 적절한 비오틴화 항원으로 분획 B를 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 5x10^7 세포당 1ml의 얼음처럼 차가운 FACS 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다. 그리고 펠릿을 5x10^7 세포당 2%포름알데히드 1밀리리터에 얼음 위의 어둠 속에서 5분 동안 재현탁시킵니다.

고정 후 방금 시연된 것처럼 세포를 두 번 더 세척합니다. 그리고 펠릿을 5x10^7 세포당 1밀리리터의 신선한 얼음처럼 차가운 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 그런 다음 얼음 위에서 어두운 곳에서 20분 동안 적절한 2차 Streptavidin Conjugated Antibody를 1-2마이크로그램으로 세포에 표시하고 세포를 두 번 더 세척합니다.

자기 나노입자 기반 농축을 위해 A, B 및 C 세포 분획을 5x10^7 세포당 1ml의 저온 분리 버퍼에 재현탁하고 개별 40마이크로리터 스트레이너를 통해 세포를 여과하여 덩어리를 제거합니다. 다음으로, 형광 염료 나노 입자를 적절한 농도로 섭씨 4도의 어둠 속에서 10분 동안 회전시키며 첨가하고 샘플을 1ml의 차가운 분리 버퍼에서 2회 세척합니다. 펠릿을 5x10^7 세포당 1ml의 저온 분리 버퍼에 재현탁합니다.

그런 다음 적절한 크기의 자석에 있는 3개의 자기 컬럼을 각각 3ml의 분리 버퍼로 평형을 이루어 전체 부피의 분리 버퍼가 각 컬럼을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 합니다. 이제 각 열 아래에 15ml 원추형 튜브라고 표시된 하나의 튜브를 놓고 해당 열에 레이블이 지정된 자성 입자 셀을 추가합니다. 각 세포 분획의 전체 부피가 각 컬럼을 통과하면 각 컬럼의 상단에 3ml의 신선한 얼음처럼 차가운 분리 버퍼를 추가하여 라벨이 지정된 튜브의 폐수를 수집합니다.

두 번째 세척이 컬럼을 통해 완전히 배수된 후 각 분획에서 음적으로 선택된 세포의 튜브를 얼음 위에 놓고 컬럼을 각 분획에 대해 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다. 각 컬럼에 약 6ml의 새로운 분리 버퍼를 채우고 즉시 컬럼을 통해 버퍼를 밀어 넣어 자기적으로 결합된 셀을 수집합니다. 그런 다음 원심분리를 통해 positive 및 negative cell fraction을 모두 수집하고 계획된 downstream 분석을 위해 적절한 용액에 pellet을 재현탁합니다.

이 그래프에서, 10여 년 전에 마지막으로 파상풍 백신을 접종한 개인의 파상풍-톡소이드 반응성 B 세포의 빈도는 이 방법이 약 4%의 순도로 파상풍-톡소이드 결합 세포를 약 7배 농축하는 데 사용할 수 있는 이 방법의 능력을 보여줍니다.채혈 약 3년 전에 백신을 접종한 피험자의 세포에 표지되지 않은 파상풍 톡소이드를 50배 초과 첨가합니다. 비오틴화된 항원을 첨가하기 전에 파상풍-톡소이드 결합이 83% 감소하여 항원 결합의 특이성을 입증합니다. 비오틴화된 항원이 시술에서 생략될 때, B 세포의 0.2%만이 여전히 결합하는데, 이는 아마도 흡수제에 있는 일부 비파상풍 항원의 결합을 반영하는 것으로 보입니다.

이 그래프는 건강한 피험자의 부스터 백신 접종 후 7일 후에 채취한 혈액 샘플에서 파상풍 톡소이드 특이적 미접촉 B 세포의 빈도가 부스터 접종 후 84%에서 64%로 감소하는 방법을 보여줍니다. 기억 개체군과 플라즈마아세포 개체군의 비율은 각각 16%에서 36%로, 0에서 40%로 증가합니다. 또한, 건강한 피험자로부터 부스트 후 7일 후에 얻은 말초 혈액 샘플의 대표적인 ELISPOT 데이터는 분리된 파상풍-톡소이드 결합 B 세포에서 관찰된 파상풍-톡소이드 항체 분비 세포 빈도의 4배 농축을 보여줍니다.

일단 숙달되면이 기술은 모든 적절한 컨트롤을 사용하여 약 3-4 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 이 방법은 2차 분석법과 결합할 수 있으며, 예를 들어 세포의 운명 및 기능에 대한 후속 연구를 위해 세포를 채택된 수용자로 이식할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 적절한 대조군을 사용하여 인간 말초 혈액에서 희귀 항원 결합 B 세포를 분리하고 농축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.