Cytokine-induced stromal cell line 주입에 의한 환자 유래 이종 이식편에서의 외인성 사이토 카인의 발현

이 절차의 전반적인 목표는 순환하는 인간 사이토카인을 가진 이종 이식 마우스를 생산하는 것입니다. 이 방법은 암 및 조혈 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 정상 및 악성 림프구 발달에서 특정 사이토카인의 역할은 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 연구자가 실험의 필요에 따라 이종 이식 동물에서 순환 농도의 외인성 사이토카인을 섭취할 수 있다는 것입니다.

따라서 새롭고 값비싼 형질전환 마우스 라인을 생산할 필요가 없습니다. 이 전임상 모델은 임상에서 사용되는 것과 유사한 항암제를 테스트하는 데 사용할 수 있기 때문에 이 기술은 새로운 암 치료법을 연구하는 데 유용할 것입니다. 이 방법은 정상적인 조혈에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 백혈병과 같은 특정 질병을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

저는 정상 및 악성 인간 B세포 생산에서 TSLP 사이토카인의 역할을 평가하기 위해 생체 내 모델이 필요했을 때 이 아이디어를 처음 개발했습니다. 먼저 개별 T25 플라스크에서 5ml의 R-10 배지에 있는 사이토카인 생성 세포의 갓 해동된 대조군 빈 벡터 형질 주입 기질을 도금합니다. 그들의 배양을 위해 섭씨 37도에서 24-48시간 동안 5%의 CO2를

기질이 합류하면 EDTA의 트립산으로 세포를 분리하여 3-4일 동안 T150 배양 플라스크에 다시 도금합니다. 기질이 T150 플라스크에서 합류하면 상층액을 수집하고 섭씨 80도에서 동결하여 나중에 ELISA에 의한 사이토카인 생성을 평가합니다. 그런 다음 각 T150 플라스크 배양을 3개의 새로운 T150 플라스크로 배양하여 합류할 때까지 배양합니다.

적절한 수의 계대 후에 세포를 보관하려면 원심분리를 위해 수확된 세포 현탁액을 원뿔형 튜브로 옮기고 펠릿을 동결 배지에 재현탁탁합니다. 그런 다음 1.5E6 세포 분취액을 액체 질소에 저장하기 위해 장기 저장 튜브로 옮깁니다. 엔지니어링된 기질에서 생성된 상층액을 검증하기 위해 대조군에서 수확한 상등액 샘플을 사이토카인 발현 기질에서 해동하고 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 2E5 세포 농도로 Au-20 배지의 조건별 백혈병 세포주 3웰을 플레이트링합니다.

섭씨 37도에서 2시간 동안 세포를 배양하여 이전 배양으로 인한 인산화가 손실되도록 합니다. 그런 다음 각 웰의 세포를 개별 4 밀리리터 튜브로 옮기고 원심 분리로 세포를 수집합니다. 실험 조건당 펠릿을 600마이크로리터에 재현탁합니다.

각 조건에 대해 웰당 200마이크로리터의 셀을 3회씩 플레이트합니다. 특정 상업용 인화학법에 따라 적절한 기간 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화합니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 phospho-flow cytometry staining을 통해 세포를 라벨링합니다. 그런 다음 표준 유세포 분석 프로토콜을 사용하여 유세포 분석으로 세포를 분석하여 기질 상등액의 사이토카인이 백혈병 세포를 인산화하는지 확인합니다. 최소 3회의 해동 후 계대 후, 수확된 기질 세포 현탁액을 계수를 위해 개별 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 주입을 위해 적절한 부피의 멸균 PBS에 부드럽게 재현탁합니다. 주입 직전까지 세포를 섭씨 4도에서 유지하며, 이 시점에서 현탁액은 최소한 실온으로 가열되어야 합니다. 세포가 준비되면 첫 번째 샘플을 반전으로 부드럽게 혼합하고 세포 200마이크로리터를 투베르쿨린 주사기에 넣습니다.

그런 다음 첫 번째 동물을 제지하고 표준 복강내 주사 기술을 사용하여 세포를 복강에 주입합니다. 말초 혈액 샘플을 채취하려면 먼저 소독된 소형 동물 보호대에 마우스를 부드럽게 넣고 튜브를 고정하여 동물의 움직임을 최소화합니다. 다음으로, 신선한 이소프로필 알코올로 꼬리를 문지른 다음 국소 마취 크림을 바릅니다.

매우 날카로운 수술용 가위를 사용하여 꼬리 끝에서 약 5-1mm를 잘라내고 약 80마이크로리터의 말초 혈액을 헤파린 처리된 모세혈관에 모읍니다. 전구 주사기를 사용하여 혈액 샘플을 라벨이 붙은 칼륨 EDTA 마이크로테이너 튜브로 옮기고 튜브를 20회 뒤집어 응고를 방지합니다. 제조업체의 지침에 따라 채혈 튜브를 원심분리한 후 혈장층을 조심스럽게 채취하고 분취액을 섭씨 20도에서 보관하고 혈장을 분취하여 섭씨 20도에서 보관합니다.

ELISA가 실시되는 날, 동결된 마우스 혈장 샘플을 해동하고 ELISA 표준물질을 120마이크로리터 부피로 연속적으로 희석합니다. 이제 각 표준물질의 40마이크로리터를 ELISA 플레이트의 적절한 웰에 삼중으로 주입한 다음 각 마우스 플라즈마 샘플 40마이크로리터를 적절한 웰에 추가합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석을 완료합니다.

마우스에 방사선을 조사한 후 24시간 후에 이종 이식을 위해 인간 조혈 세포를 준비합니다. 무균 PBS에서 조혈 세포를 재현탁할 때, 이식 중 액체가 엎질러질 경우를 대비하여 약 15-20%를 추가로 준비하는 것이 좋습니다. 이식 전까지 세포를 섭씨 4도로 유지하고 첫 번째 수용 동물을 최소 5분 동안 보온 케이지로 옮겨 꼬리 정맥 확장을 촉진합니다.

이제 세포를 실온으로 데우십시오. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 200마이크로리터를 투베르큘린 주사기에 넣습니다. 마우스를 구속기에 넣고 이소 프로필 알코올로 꼬리를 소독하십시오.

세포를 측면 꼬리 정맥에 주입합니다. 그런 다음 최소 5분 동안 마우스를 모니터링하여 이식과 관련된 부작용이 없는지 확인합니다. 대조군 기질을 주입한 환자 유래 이종 이식 또는 PDX 동물은 마우스 혈장에서 인간 흉선 기질 림프포포이에틴(TSLP) 수치가 ELISA 검출 임계값 미만인 것으로 일관되게 나타났습니다.

TSLP가 형질도입된 기질을 주입한 PDX 마우스에서 인간 TSLP의 혈장 수치는 이전 1-2주 동안 주입된 TSLP 기질 세포의 양에 비례합니다. 단순하게 수행되었음에도 불구하고 수정된 ELISA를 사용한 혈장 TSLP 수치의 주간 평가는 일반적으로 시간이 지남에 따라 일관된 결과를 제공합니다. TSLP는 정상적인 인간 B세포 전구체의 생산을 증가시키는 것으로 나타났습니다.

실제로, B-계통 세포는 B-세포 전구체 단계 초기에 대조군 PDX 동물에 비해 TSLP-plus 마우스에서 현저히 증가하며, 이는 TSLP-plus PDX 동물에서 생산된 인간 TSLP가 표적 세포 집단에 대해 예상되는 생체 내 기능적 효과를 발휘함을 시사합니다. 일단 최적화되면, 이러한 절차는 3-4주 내에 검출 가능한 수준의 인간 사이토카인을 가진 이종 이식 마우스를 생성할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 기질 세포 상층액의 사이토카인 농도를 모니터링하는 것이 중요합니다.

이는 사이토카인 생산이 사이토카인 생성 기질에서 유지되고 대조 기질에는 존재하지 않도록 합니다. PDX 마우스는 전임상 연구에 사용하여 생체 내에서 실험용 사이토카인의 생리학적 수준을 변화시킴으로써 특정 관심 약물의 효능이 어떻게 변경되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 혁신적인 모델은 혈액학 및 종양학 분야의 연구자들이 백혈병의 발병 및 진행에 대한 TSLP의 역할과 정상 조혈에 대한 TSLP의 역할을 연구할 수 있는 새로운 방법을 제공합니다.

사이토카인 형질전환 세포주에 액세스할 수 있는 경우, 이 비디오에서 보여주는 기술을 사용하여 광범위한 면역 결핍 마우스 균주를 사용하는 환자 유래 이종이식 질환 모델에 외인성 사이토카인을 공급할 수 있습니다. 인간 조혈 세포를 대상으로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 체액과 세포를 다루는 동안 혈액 매개 병원체의 전염을 피하기 위해 항상 예방 조치를 취해야 합니다.