Name: Cytokine-induced stromal cell line 주입에 의한 환자 유래 이종 이식편에서의 외인성 사이토 카인의 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 배우세요 사이토카인 유도 기질세포를 주입하여 환자 유래 이종 이식편에서 외인성 사이토카인을 발현하는 방법입니다. 이 기술은 암 연구와 조혈작용 연구에 활용되는 비용 효율적인 전임상 모델을 제공합니다.

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이 연구는 NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, 현대 Hope on Wheels 장학생 Hope Grant, Loma Linda University School of Medicine의 병리학 및 인체 해부학과, 기초 과학과, 건강 격차 및 분자 의학 센터의 지원을 받았으며 Loma Linda University(KJP)의 공동 및 중개 연구를 촉진하기 위한 보조금의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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이 원고는 PDX를 조작하여 외인성 인간 사이토 카인을 발현하는 간단하고 신속하며 상대적으로 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 여기에 설명 된 전략은 인간 사이토 카인, TSLP를 표현하기 위해 형질 도입 된 간질 세포주의 주간 복강 주사에 기초합니다. 여기에 설명 된 방법을 수행하기 전에, 높은 수준의 관심있는 사이토킨 (TSLP)을 발현하도록 조작 된 간질 및 유사하게 조작 된 간질이 생성되었다. 여기에 제시된 프로토콜에서 간질은 배양에서 확장되고 시간이 지남에 따라 (또는 대조 간질의 경우에는 사이토 카인 생산이없는 경우) 안정하고 높은 수준의 사이토 카인 생산을 제공하는 능력에 대해 스크리닝된다. 스트로마 생성 사이토 카인의 활성을 확인하기위한 분석을 수행하고 생체 인체 TSLP (및 인간 TSLP가없는 대조 마우스)를 사용하여 PDX를 생산하기 위해 간질 세포 주입을위한 실험적 타임 라인을 개발했다. 인간 TSLP의 혈장 수준을 모니터링하는 절차 및사이토 카인 반응성 세포 집단에 대한 그의 생체 내 기...

환자 유래 이종 이식편 (PDX)은 &#39;원주민&#39;포유류 환경에서 정상 및 악성 조혈 세포의 생산을 연구하기위한 강력한 생체 내 모델입니다. 대부분 PDX는 사람의 세포를 면역 결핍 마우스에 주사하거나 이식하여 생산됩니다. 정상적인 인간 조혈 줄기 세포를 이용한 PDX의 생성은 정상적인 사람의 혈액과 면역 세포의 생체 내 연구를 가능하게합니다. 백혈병이나 다른 암세포에서 생산 된 PDX는 종양 발생 기전을 연구하고 인간 개체군에 존재하는 유전 적 경관과 돌연변이의 범위에서 효과적인 치료법을 확인하는 것을 가능하게합니다. 결과적으로 PDX는 효과적인 치료 방법을 밝히기위한 병리학 생물 의학 연구의 현재 표준이자 암 진행 메커니즘을 이해하는 데 중요한 도구입니다. PDX 모델은 특정 질병으로 인한 건강 불균형 질환에 대한 연구를 지원하는 필수 도구입니다.<html> 유전 병변, 또는 환자의 유전 적 변이가 종양 발생 및 치료 결과에 실질적으로 기여할 수있는 임의의 질환을 포함한다. 마우스 - 인간 PDX 모델은 많은 마우스 사이토 카인이 인간 세포의 사이토 카인 수용체를 쥐 내부에있는 동안 활성화 시키는데있어서 인간 유사체를 적절히 모방하기 때문에 가능하다. 예를 들어, 인터루킨 -7 (IL-7)은 인간 B 세포 발달에 중대한 신호를 제공합니다. 2 마우스 IL-7은 마우스 사이토 카인이 인간 B 세포 전구체에서 신호 전달 경로를 자극한다는 점에서 인간 IL-7과 충분한 상 동성을 갖는다. 그러나 다른 cytokine (IL-3, 과립구 - macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), 줄기 세포 인자 (SCF)) 중에서 thymic stromal lymphopoietin (TSLP) ,정상 및 악성 인간 조혈 모세포의 생산에있어서 중요하다. 마우스 및 인간 사이토 카인이 낮은 상 동성을 나타내는 경우, 마우스 사이토 카인은 인간 세포상의 각각의 수용체를 활성화시키지 않는다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 많은 전략이 사용되어왔다 PDX 생쥐에서 인간 사이토 카인의 발현을 조작하는 방법으로 재조합 인간 사이토 카인의 주입, DNA의 유체 역학적 주사, 렌티 바이러스 발현, 형질 전환 발현 및 knockin 유전자 교체가 포함된다 .7 이 보고서는 간질 매개 를 통해 인간 사이토 카인을 생산하는 PDX 사이토 카인 전달 ( 그림 1 ). 여기에 설명 된 방법에서 PDX 마우스는 인간 사이토 카인, TSLP를 발현 시키거나 사이토 카인 음성 대조군으로 기능하도록 조작됩니다. TSLP를 발현하는 PDX는 인간 TSLP의 높은 수준을 발현하도록 형질 도입 된 간질 세포를 매주 복강 내 주사함으로써 달성된다.사이토 카인 - 음성 PDX &quot;대조군&quot;마우스도 유사하게 조작된다; 대조 기질은 대조군 벡터로 형질 도입된다. 이 방법은 TSLP + 간질을 주사 한 PDX 마우스에서 인간 TSLP의 정상적인 생리 학적 수준을 달성합니다. 사이토 카인 - 음성 간질을받는 PDX 마우스에서 검출 가능한 TSLP는 관찰되지 않았다. 우리는 연구에서 인간 간질 세포주 HS-27A를 선택했다. 왜냐하면 배양에서 견고하게 성장하고, 공 배양에서 분리 된 전구 세포의 증식을 지원하지 않는 매우 낮은 수준의 사이토 카인 생산을 보여주기 때문이다. 인간 TSLP 발현을 위해 기질은 이전에 기술 된 백본에서 유래 된 선진적인자가 - 비활성화 벡터 lentiviral vector로 형질 도입되었으며 cPPT / cts 요소와 woodguck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE)를 포함하여 도입 유전자 발현을 증가시켰다. 인간 TSLP 유전자는 신장 인자 -1의 조절하에이 벡터에 구축되었다(EF-1) 알파 프로모터를 이용하여 견고하고 구성 적이며 장기적인 발현을 달성 할 수 있습니다. 이 human-cytokine enhanced PDX 모델의 공학은 4 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫째, 형질 전환 된 기질은 체외에서 증식되고 안정되고 높은 수준의 사이토 카인 생산을 위해 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)에 의해 평가된다. 둘째, 형질 감염된 간질 세포에 의해 생성 된 인간 사이토 카인의 활성 (및 대조 간질로부터의 사이토킨 활성의 결핍)이 인 - 흐름 세포 계측법을 사용하여 검증된다. 관심있는 사이토 카인 (이 경우, TSLP)에 반응하는 것으로 알려진 세포주를 간질 세포 상등액과 함께 배양하고 사이토 카인 - 유도 된 인산화를 분석 하였다. 셋째, 마우스에게 형질 도입 된 인간 간질을 주사 한 다음 마우스 혈장을 주 1 회 기준으로 인간 사이토 카인의 수준을 ELISA로 평가한다. 넷째, 인간의 조혈 세포를 이식하고, 인간 사이토 카인의 생체 내 기능적 효과를 알려진 표적에서 평가한다 ( <em&gt; 예. 세포 집단). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> 그림 1 : 마우스에서 외인성 인간 사이토 카인을 생산하도록 설계된 PDX 모델. ( 1A ) 디자인 실험 및 형질 도입 된 인간 간질 세포 획득 ( 1B ) 인간 세포 (조혈 줄기 세포, 백혈병 세포 등 )를 얻어 PDX (환자 유래 이종 이식) 마우스를 만듭니다. ( 2A ) 조작 된 간질을 주입하고 ( 2B ) 인간의 세포를 실험 계획에 따라 면역 결핍 마우스에 이식합니다. ( 3A - B ) 간질 상층 액 및 마우스 혈장의 사이토 카인 농도를 ELISA로 모니터링하십시오. ( 4 ) 인간 세포를 수확하고 PDX에 존재하는 인간 사이토 카인의 생체 내 기능적 효과를 평가한다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오.</a>이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. 간질 세포 를 통한 인간 사이토 카인의 전달은 PDX 마우스에서 인간 사이토 카인 을 전달 / 생산하는 다른 방법과 비교할 때 장점 및 단점을 제공한다. 재조합 인간 사이토 카인의 주입과 비교하여, 간질 매개 전달은 일반적으로 덜 비싸다 (간질 세포 배양 비용은 재조합 시토 킨 비용보다 적음). 노동 집약도 적다 (1 주일에 1 회 주사 대 주당 복수 주사). 간질이 지속적으로 외인성 사이토 카인을 생성하기 때문에 짧은 사이토 카인 반감기의 문제 또한 완화된다. DNA의 유체 역학적 주사를 통한 사이토 카인의 전달 은 간질 을 통한 전달보다 비용이 적게 든다. 그러나, 그것은 일시적이며 간질 매개 전달에 필요한 간단한 주간 복강 주사보다 기술적 인 기술이 필요할 수 있습니다. 마우스에서의 렌티 바이러스 유전자 발현은 더 적은 트랩을 제공 할 수있다사이토 카인 전달의 새로운 방법; 그러나 우리 손에 생리적 인 TSLP 수치는 달성되지 않았습니다. 또한이 방법은 노동 집약적이며 렌티 바이러스 벡터를 지속적으로 생산해야합니다. 트랜스 제닉 또는 노크 - 인 (knock-in) 마우스는 사이토 카인의 장기간 안정한 발현을 제공하며, 조직 특이 적 발현을 위해 조작 될 수있어 이점이 될 수있다. 반면에, PDX 마우스에 필요한 면역 결핍 마우스 배경에서의 인간 사이토 카인 유전자의 형질 전환 발현은 모델의 가치가 확립되기 전에 막대한 자원의 투자를 필요로한다. 또한, 형질 전환 모델은 일반적으로 사이토 카인 개시의시기 또는 생체 내 사이토 카인 생산의 수준을 변화시키는 옵션을 허용하지 않는다. 이들은 간질 세포 주입의 시작 시점 또는 주입 된 간질 세포의 투여 량을 단순히 변경함으로써 간질 매개 전달에 의해 달성 될 수있다. 간질 세포 매개 cytokine delivery meth여기에 자세하게 설명 된 것은 정상 인간 B 세포 발달 4 및 6 및 고위험 B 세포 급성 림프 구성 백혈병에서 TSLP의 역할을 평가하기위한 PDX를 개발하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 TSLP 이외의 인간 사이토 카인으로 유사한 모델을 생성하는데 사용하기위한 대안적인 사이토 카인 전달 방법을 제공한다. 이 모델은 또한 시토 킨 트랜스 제닉 또는 사이토 카인 노크 - 인 PDX 모델의 가치가 상당한 시간과 돈 투자에 합당한지를 결정하는 데 도움이되는 예비 데이터를 생성하는데 유용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>습식 실험실 시약&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc 세포 배양 처리 EasYFlasks, 7 mL 용량,&nbsp; 25cm&sup2; 배양 영역</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL 용량, 75 cm&sup2; 배양 영역 & 통풍 캡</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon 조직 배양 처리 플라스크, 600 mL 용량, 150 cm&sup2; 문화 지역 & 통풍 캡</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학 피펫</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 극저온 바이알, 외부 스레드</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 피펫 팁</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 피펫 팁&nbsp;</td><td>덴빌 사이언티픽</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>멸균 일회용 필터 유닛, SFCA 멤브레인, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' 칼리슘과 마그네슘이 없는 S 인산염 완충 식염수(PBS), 1&times;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3% 아세트산과 메틸렌 블루</td><td>스템셀 기술</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue&nbsp;</td><td>HBSS</td> ThermoFisher 25-053 <td></td> TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P-7949"에서 Corning 25-900-Cl<td></td></tr><tr><td>"Trypsin" 1x 0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> R10" 세포 배양 배지, 총 부피의 % (565 mL 제작)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>RPMI, 88.5% (500 mL)&nbsp;</td><td>미디어테크</td><td>10-040-CV&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9.9%(56mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, 0.99% (5.6 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 0.50% (2.8 mL)&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올, 0.10%(560 &마이크로; 엘)&nbsp;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><강>" R20" 세포 배양 배지, 총 부피의 % (195 mL 제작)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; RPMI, 76.84% (150&nbsp; mL)</td> <td>위</td><td></td> <td>참조</td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; FBS, 20.49%(40mL)</td> <td>위 참조</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2mM L-글루타민, 1.02%(2mL)</td> <td>위</td><td></td> <td>참조</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1 mM Na 피루브산염, 1.02% (2 mL)</td> <td>위</td><td></td> <td>참조</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 페니실린-스트렙토마이신,&nbsp; 0.51 % (1 mL)</td> <td>위</td><td></td> <td>참조</td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2-메르캅토에탄올, 0.10%(0.1m),&nbsp; 0.10% (200 &마이크로; L)</td> <td>위</td><td></td> <td>참조</td></tr><tr><td><강한>" 냉동 매체", 총 부피의 %</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>" R10" 중간, 45%</td> <td>"R10" 레시피</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FBS 참조, 20%</td> <td>위</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 참조, 10%</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-트레할로스 이수화물, 5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catolog Number </td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>"HS-27", HS-27A, 인간 기질주</td>, <td>ATCC</td>, <td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>", "CALL-4", MHH-CALL-4, 세포주, 인간 B 세포 전구체 백혈병,</td><td>DSMZ,</td><td>ACC 337</td><td></td></tr><tr><td>" NSG 마우스" 끄덕이다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, 남성 또는 여성, 6세 &ndash; 8주</td><td>JAX 마우스&nbsp;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>MUTZ-5 세포주, 인간 B 세포 전구체 백혈병</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TSLP 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catolog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Flow cytomery antibodies (clone)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (다른 이름은 IL-7R&alpha;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp; (하이30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD" 고정 생존력 염료&nbsp; eFluor 780&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &kappa; 경쇄 FITC&nbsp; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td><td></td></tr><tr><td>Ig &lambda; 경쇄 FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp; 마우스 anti-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Catolog 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>기타 재료 및 장비& </강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>동물 이식 가능한 나노 트랜스폰더와 캐뉼라</td><td>트로반;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>EMLA 리도카인 마취 크림 (동물 관리 시설을 통해 처방하여 얻음)</td> <td>처방</td><td></td><td></td></tr><tr><td>처방 BD &frac12; cc LO-DOSE U-100 인슐린 주사기 28G&frac12; &nbsp;</td><td>BD#</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>BD 마이크로테이너 튜브와 K2EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Alegra X-15R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand 모세관 (Heparinized)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACS퀀트 분석기 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>마우스 파이 케이지</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>마우스 꼬리 조명기 Restrainer</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>피스톨 그립 임플란터</td><td>트로반&nbsp;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&마이크로; 퀀트&nbsp;</td><td>Bio-Tek Instruments Inc. (바이오 텍 인스트루먼트)</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 유세포 분석 소프트웨어</td><td>FlowJo, LLC</td><td>버전 10</td><td></td></tr><tr><td>*달리 명시되지 않는 한 모든 항체는 항인간적입니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytokine-induced stromal cell line 주입에 의한 환자 유래 이종 이식편에서의 외인성 사이토 카인의 발현

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

환자 유래 이종 이식 (PDX) 마우스는 사람 세포를 면역 결핍 마우스에 이식하여 생산됩니다. 이 모델은 정상 및 악성 조혈의 기전을 연구하는 데 중요한 도구이며 많은 악성 종양에 대한 효과적인 화학 요법을 식별하는 데있어 가장 중요한 표준입니다. PDX 모델은 많은 마우스 사이토 카인이 사람의 세포에도 작용하기 때문에 가능합니다. 그러나 이것은 인간 세포에서 정상 및 악성 조혈을 연구하는 데 중요한 여러 가지를 포함하여 모든 사이토 카인의 경우에는 해당되지 않습니다. 인간 사이토 카인 (형질 전환 및 knock-in 모델)을 생산하기 위해 마우스를 조작하는 기술은 모델의 유용성이 입증되기 전에 상당한 비용을 필요로합니다. 다른 기술은 노동 집약적이며 (재조합 시토 킨이나 렌티 바이러스의 주사), 어떤 경우에는 고도의 전문 기술 (DNA의 유체 역학적 주사)이 필요합니다. 이 보고서는 외인성 cy를 갖는 PDX 마우스를 생성하는 간단한 방법을 설명합니다tokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) 을 매주 복강 내 주사하여 사이토 카인을 과발현시켰다. 이 방법의 사용은 마우스에서 순환하는 인간 사이토 카인의 생리 학적 수준을 달성하는 연속적인 사이토 카인 생산의 생체 내 공급원을 제공한다. 인간 사이토 카인의 혈장 수준은 주입 된 간질 세포의 수에 따라 다양 할 수 있으며, 사이토 카인 생산은 실험의 어느 시점에서 시작될 수있다. 이 방법은 또한 유사하게 생성되지만 대조군 벡터로 형질 도입 된 간질의 복강 내 주사를 통한 사이토 카인 - 음성 대조군 마우스를 포함한다. 우리는 TSLP를 발현하는 PDX로부터 수확 된 백혈병 세포가 대조군 PDX와 비교하여 원래 환자 샘플과 유사한 유전자 발현 패턴을 나타냄을 이전에 입증했다. 이 방법으로 생성 된 cytokine 생성 및 cytokine 음성 PDX 마우스를 함께 사용하면 우리가 성공적으로 연구 한 모델 시스템이 제공됩니다.정상 및 악성 조혈에서 TSLP의 역할.

모델 개요가 그림 1 에 나와 있습니다. 일단 사이토 카인 - 생성 (TSLP + 간질) 및 대조 간질이 수득되면, 이들은 배양 물에서 확대된다. 생쥐에 stroma 주사하기 전에 간질 세포 상등액은 간질에 의해 생산되는 사이토 카인의 활성을 확인하는 데 사용되는 사이토킨 생산 ( 그림 2 )과 인산 흐름 cytometry (프로토콜 # 3)를 확인하기 위해 ELISA에 의해 평가됩니다. 상등액은 세포가 통과 될 때 합류 간질 세포 배양 (대조 간질 및 TSLP + 간질)에서 수집됩니다. ELISA는 초기, 중간 및 후기 단계에서 상등액에서 TSLP의 농도를 적어도 한 번은 모니터하는 데 사용됩니다. 대조 스트로마로부터의 대표적인 데이터가 도 2a 에 도시되어 있다 . TSLP 발현을 보여주는 간질 세포 배양 물 (및 ...

여기에 서술 된 것은 환자 - 유도 된 이종 이식 (PDX) 마우스에서 사이토 카인 - 형질 감염된 간질 세포주의 매주 복강 내 주사를 통해 외인성 사이토킨을 생산하는 방법이다. 이 방법은 PDX의 유용성을 넓히고 다양한 PDX 모델에서 일시적 또는 지속적인 외인성 사이토 카인 전달 옵션을 제공합니다.

Cytokine-induced stromal cell line 주입에 의한 환자 유래 이종 이식편에서의 외인성 사이토 카인의 발현

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 혈중에 인간 사이토카인이 순환하는 제노그라프트(xenograft) 마우스를 제작하는 것입니다. 이 방법은 '정상 및 악성 림프구 발달에서 특정 사이토카인의 역할은 무엇인가?'와 같이 암 및 조혈 작용 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 실험 필요에 따라 제노그라프트 동물의 혈중 외인성 사이토카인 농도를 조절할 수 있다는 점입니다.이를 통해 비용이 많이 드는 새로운 형질전환 마우스 라인을 제작할 필요가 없어집니다. 이 전임상 모델은 임상에서 사용되는 것과 유사하게 항암제를 테스트하는 데 활용될 수 있으므로, 새로운 암 치료법을 연구하는 데 유용할 것입니다. 또한, 이 방법은 정상적인 조혈 작용에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 백혈병과 같은 특정 질환을 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다.저는 정상 및 악성 인간 B 세포 생성에서 TSLP 사이토카인의 역할을 평가하기 위한 in vivo 모델이 필요했을 때 이 아이디어를 처음 개발했습니다. 우선, 최근에 해동한 대조군 공벡터-형질도입 기질 세포와 사이토카인 생성 세포를 각각의 T25 플라스크에 5 mL의 R-10 배지와 함께 분주하십시오. 이후 37 °C, 5% CO2 조건에서 24~48시간 동안 배양합니다.기질 세포가 단층으로 꽉 찼을 때(confluent), EDTA가 포함된 Trypsan으로 세포를 떼어내어 T150 배양 플라스크에 옮겨 3~4일 동안 재배양합니다. T150 플라스크에서 기질 세포가 단층을 형성하면, 상층액을 수집하여 -80 °C에서 냉동 보관하며, 이후 ELISA를 통해 사이토카인 생성량을 평가합니다. 그 다음, 각 T150 플라스크 배양물을 3개의 새로운 T150 플라스크로 계대 배양하여 세포가 단층을 형성할 때까지 배양합니다.적절한 횟수의 계대 배양 후 세포를 보관하려면, 수확한 세포 현탁액을 원심 분리용 코니컬 튜브로 옮겨 원심 분리하고 펠릿을 동결 보존액으로 재현탁합니다. 그런 다음 1.5E6개의 세포 분주량을 장기 보관 튜브에 옮겨 액체 질소에 보관합니다. 엔지니어링된 기질에서 생성된 상청액을 검증하려면, 대조군 및 사이토카인 발현 기질에서 수확한 상청액 샘플을 해동하고, 조건당 3개의 웰에 백혈병 세포주를 Au-20 배지에서 웰당 2E5개의 세포 농도로 96-웰 조직 배양 플레이트에 분주합니다.이전 배양 과정에서 발생한 인산화를 제거하기 위해 세포를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰의 세포를 개별 4 mL 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 실험 조건당 600 µL의 용액으로 펠릿을 재부유시킵니다.각 조건당 3회 반복하여 웰당 200 microliters의 세포를 분주합니다. 특정 상용 phosphoassay의 지침에 따라 적절한 기간 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다.제조사의 프로토콜에 따라 phospho-flow cytometry 염색을 통해 세포를 라벨링하십시오. 그런 다음, 표준 flow cytometric 분석 프로토콜을 사용하여 flow cytometry로 세포를 분석하여 스트로마 상층액 내의 사이토카인이 백혈병 세포를 인산화하는지 확인하십시오. 해동 후 최소 3회 계대 배양한 뒤, 수확한 스트로마 세포 현탁액을 세포 수 측정을 위해 개별 원심관(conical tube)으로 옮기십시오.원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 주입에 적합한 부피의 멸균 PBS에 부드럽게 재부유합니다. 세포를 4 °C에서 보관하며, 주입 직전에 현탁액을 최소 실온까지 가온합니다. 세포 준비가 완료되면, 첫 번째 샘플을 반전시켜 부드럽게 혼합하고 200 µL의 세포를 투베르쿨린 주사기로 흡입합니다.그런 다음 첫 번째 동물을 보정한 후, 표준 복강 내 주사법을 사용하여 세포를 복강 내로 주입합니다. 말초 혈액 샘플을 채취하려면, 먼저 소독된 소동물 보정기에 마우스를 조심스럽게 위치시키고 튜브를 고정하여 동물의 움직임을 최소화합니다. 다음으로, 신선한 isopropyl alcohol로 꼬리를 닦아낸 후 국소 마취 크림을 도포합니다.매우 날카로운 수술용 가위를 사용하여 꼬리 끝에서 약 5~1mm 부분을 자르고, 헤파린 처리된 모세관 튜브에 말초혈액 약 80 µL를 수집합니다. 벌브 시린지를 사용하여 혈액 샘플을 라벨이 부착된 potassium EDTA 마이크로테이너 튜브로 옮기고, 응고를 방지하기 위해 튜브를 20회 반전시킵니다. 제조사의 지침에 따라 혈액 수집 튜브를 원심분리한 후, 혈장 층을 조심스럽게 수집하여 분주하고 -20 °C에서 보관합니다.ELISA 수행 당일에 냉동된 마우스 혈장 샘플을 해동하고, ELISA 표준 물질을 120 µL 부피로 단계 희석합니다. 이제 각 표준 물질 40 µL를 ELISA 플레이트의 해당 웰에 3반복으로 분주한 후, 각 마우스 혈장 샘플 40 µL를 해당 웰에 추가합니다. 그 다음 제조사의 지침에 따라 ELISA 분석을 완료합니다.마우스를 조사한 24시간 후에 제노그라프트 이식을 위한 인간 조혈모세포를 준비합니다. 조혈모세포를 멸균 PBS에 재현탁할 때, 이식 중 유실될 가능성에 대비하여 약 15~20% 정도 여유 있게 준비하는 것이 좋습니다. 이식 전까지 세포를 4°C에서 보관하고, 첫 번째 수 recipient 동물을 꼬리 정맥 확장을 용이하게 하기 위해 최소 5분 동안 가온 케이지로 옮겨 둡니다.이제 세포를 실온으로 가온합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 섞은 후 투베르쿨린 주사기로 200 µL를 흡입합니다. 마우스를 보정기에 넣고 꼬리를 이소프로필 알코올로 소독합니다.세포를 꼬리 측면 정맥에 주입합니다. 그 후 최소 5분 동안 마우스를 관찰하여 이식과 관련된 부작용이 없는지 확인합니다. 대조군 기질을 주입한 환자 유래 이종이식(PDX) 동물은 마우스 혈장 내 인간 흉선 기질 림프구 생성 촉진 인자(TSLP) 수치가 ELISA 검출 한계 미만임을 일관되게 보여줍니다.TSLP가 형질전환된 기질 세포가 주입된 PDX 마우스의 인간 TSLP 혈장 농도는 이전 1~2주 동안 주입된 TSLP 기질 세포의 양에 비례합니다. 단일 시료로 수행되었음에도 불구하고, 수정된 ELISA를 이용한 이 매주 혈장 TSLP 농도 측정 결과는 일반적으로 시간이 지나도 일관되게 나타납니다. TSLP는 정상 인간 B세포 전구체의 생성을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다.실제로 TSLP-plus 마우스에서는 대조군 PDX 동물과 비교하여 B-세포 전구 단계부터 B-계열 세포가 유의하게 증가하며, 이는 TSLP-plus PDX 동물에서 생성된 인간 TSLP가 표적 세포 집단에 대해 예상되는 생체 내 기능적 효과를 나타냄을 시사합니다. 최적화가 완료되면, 이 절차를 통해 3~4주 만에 검출 가능한 수준의 인간 사이토카인을 보유한 제노그라프트 마우스를 생성할 수 있습니다. 시간이 경과함에 따라 기질 세포 상층액 내의 사이토카인 농도를 모니터링하는 것이 중요합니다.이를 통해 사이토카인 생성 기질에서는 사이토카인 생성이 지속되고, 대조군 기질에서는 생성되지 않음을 보장할 수 있습니다. PDX 마우스는 "관심 있는 특정 약물의 효능이 생체 내(in vivo)에서 실험 대상 사이토카인의 생리학적 수준 변화에 따라 어떻게 달라지는가?"와 같은 추가적인 질문에 답하기 위한 전임상 연구에 활용될 수 있습니다. 이 혁신적인 모델은 혈액학 및 종양학 분야의 연구자들이 정상 조혈 작용뿐만 아니라 백혈병의 발생 및 진행 과정에서 TSLP의 역할을 연구할 수 있는 새로운 방법을 제공합니다.사이토카인이 형질도입된 세포주를 사용할 수 있다면, 이 비디오에서 시연된 기술을 이용하여 다양한 면역 결핍 마우스 계통을 사용하는 환자 유래 이종이식 질환 모델에 임의의 외인성 사이토카인을 공급할 수 있습니다. 인간 조혈 세포를 다루는 것은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이러한 체액 및 세포를 다룰 때는 혈액 매개 병원균의 전염을 방지하기 위해 항상 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Bryostatin의 1/Ionomycin에 의해 종양 반응 T 세포의 생체내 전 확장 및 일반 감마 체인 크린 시토킨 제제

손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는...

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

이 기사는 T 세포에서 인터페론-감마 또는 IFN-감마 및 종양 괴사 인자-알파 또는 TNF-알파와 같은 사이토카인의 세포 내 농도를 증가시키기 위한 생체 외 T 세포 자극 기술에 대해 설명합니다. 이러한 사이토카인은 효과적인 항종양 반응을 매개하며 종양에서 치료 역할을 할 수 있습니다.

췌장 종양에서의 생체 외 T 세포 자극: T 세포에서 사이토카인 생산을 증가시키는 방법

이 비디오는 백혈병 세포에서 단백질의 기질 사이토카인 유도 세포 내 인산화의 평가를 보여줍니다. 이러한 세포 내 인산화된 단백질은 phospho-flow cytometry 기술을 사용하여 정량화됩니다.

Phospho-Flow Cytometry를 사용한 Stromal Cytokine-Induced intracellular protein phosphorylation 평가

우리는 형광 활성화 세포 선별에 의한 인간 육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 자극하는 세포의 분리를 위한 상세한 프로토콜을 설명하고, 인간 백혈구 항원-1(HLA-1)을 음성 마커로 사용하고, 추가검증및 이러한 HLA-1 음성 종양 을 자극 하는 세포의 특성.

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.

디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

이 연구는 배아 줄기 세포에서 면역 자극 과립 대세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외약 농축 세포 소포를 분리하는 방법을 설명합니다.

배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리

여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포의 단핵 세포 유래 사이토카인 유도 CD3+CD56+ 킬러 세포의 격리 및 확장을 수행하는 프로토콜을 제시하고 시험관 내 진단 유세포 분석 시스템을 사용하여 혈액학적 및 고체 암 세포에 대한 그들의 세포 독성 효과를 예시한다.

암 치료를 위한 사이토카인 유발 킬러 T 세포의 격리 및 확장

이 프로토콜은 정형 외과 췌장 종양의 외과 생성 및 갓 단송된 뮤린 췌장 종양의 급속한 소화를 기술합니다. 소화 후, 실행 가능한 면역 세포 집단은 유세포 세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 검출을 위한 T 세포의 생체내 자극을 포함하는 추가하류 분석을 위해 사용될 수 있다.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

본 프로토콜은 비비만 당뇨병(NOD)-scid 인터루킨-2 감마사슬 수용체(NSG) 마우스에 인간 피부를 이식하는 방법을 설명합니다. 이식을 위한 인간 피부의 준비, 이식을 위한 마우스의 준비, 분할 두께의 인간 피부의 이식 및 이식 후 회복 절차에 대한 자세한 설명이 보고서에 포함되어 있습니다.

생체 내에서 인간 면역 반응을 조작하기 위한 이종이식 피부 모델

배우세요 사이토카인 유도 기질세포를 주입하여 환자 유래 이종 이식편에서 외인성 사이토카인을 발현하는 방법입니다. 이 기술은 암 연구와 조혈작용 연구에 활용되는 비용 효율적인 전임상 모델을 제공합니다.

Cytokine-induced stromal cell line 주입에 의한 환자 유래 이종 이식편에서의 외인성 사이토 카인의 발현

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