Name: Aβ의 절대 정량 1-42 CSF의 질량 분석 참조 측정 절차를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 인간 뇌척수액에서 Aβ1-42의 절대 정량을 위한 질량 분석 참조 측정 절차를 사용하는 방법을. 이 기술은 알츠하이머병 바이오마커 표준화와 임상시험 컷오프 수준 도입을 지원합니다.

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이 작업은 CSF 단백질에 대한 국제 임상 화학 연맹 실무 그룹을 대신하여 수행되었으며, 구성은 다음과 같습니다 : Kaj Blennow (의장) 및 Henrik Zetterberg, 스웨덴 예테보리 대학; Les Shaw 및 Magdalena Korecka, 미국 펜실베니아 주 필라델피아 대학교; Ingrid Zegers, 벨기에 Geel, Reference Materials and Measurements; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, 독일; 및 Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, 미국 미주리주 워싱턴 대학교; 및 H Vanderstichele, Innogenetics NV, 겐트, 벨기에. 이 작업은 또한 알츠하이머 협회 의료 및 과학 관계 선임 이사인 Maria C. Carrillo, Ph.D.가 이끄는 Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group을 위한 글로벌 컨소시엄의 일부였습니다. 이 연구는 스웨덴 연구 위원회(보조금 #14002, #521-2011-4709 및 #2013-2546)의 지원을 받았습니다. 크누트와 앨리스 발렌베리 재단; Demensförbundet; Emil과 Wera Cornell, Aina Wallström과 Mary-Ann Sjöblom, Gun과 Bertil Stohne, Magnus Bergvall, Gamla Tjänarinnor의 재단.

주 :이 프로토콜은 출발 물질로서 각각 Aβ 펩타이드를 50㎍ / ㎖의 농도에서 50 μL의 분취 량을 필요로한다. Aβ 펩타이드의 탈 이온수 중 20 % 아세토 니트릴 (ACN) 및 4 % 진한 암모니아 용액 (V / V)에 용해시키고, 80 ℃에서 보관해야한다. 주의 : 안전 정보는 표 1을 참조하십시오. 솔루션 1. 준비 <ol><li> ACN 20㎖의 탈 이온수에서 농축 암모니아 4 ㎖ (~ 25 %)을 희석하여 20 % ACN과 4 % 100 ㎖를 탈 이온수 (v / v)로 농축 암모니아 용액을 제조 하였다. 탈 이온수 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. 신선한 매일 확인합니다. </li><li> 50 ㎖의 최종 부피의 탈 이온수에 구아니딘 염산염 26.08 g을 용해하여 5 M 구아니딘 히드로 클로라이드 50 ㎖를 준비한다. 20 ° C에서 보관하고 신선한 매월합니다. </li><li> (탈 이온수 4 % 인산 200㎖를 준비 V /V)의 탈 이온수에서 농축 인산 (~ 85 %) 9.4 mL로 희석. 탈 이온수 200 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. 냉장고에 저장하고 신선한 주간을합니다. </li><li> ACN 37.5 mL의 탈 이온수에서 농축 암모니아 5 ㎖ (~ 25 %)를 희석하여, 탈 이온수 50 75 % ACN ㎖의 10 % 진한 암모니아 용액 (V / V)를 준비한다. 탈 이온수로 50 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. 신선한 매일 확인합니다. </li><li> 일상적인 임상 분석 드 식별 남은 샘플에서 얻은 교정기, 인간 CSF의 적어도 2.5 mL로 녹여. </li><li> 150 mM의 나트륨, 3.0 mM의 K, 1.4 mM의 CA, 0.8mm의 마그네슘, 1.0 mM의 P, 및 탈 이온수 155 mM의 CL을 포함하는 인공 CSF를 준비하여 4 mg / ml의 최종 농도로 우 혈청 알부민을 추가한다. 단 1 mL의 향후 사용을 위해 분취 량을, 저장, 분석 당 필요하지만, 많은 양을 준비한다. </li></ol> 구경 2. 준비 <ol><li> 4 μg의 0.5 mL의 준비 / mL의 10.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 20 % ACN과 4 % 진한 암모니아 용액을 0.46 / ㎖ 15 142 NAβ 50 μg의 40 μL를 첨가하여 5 NAβ 1-42 펩티드. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다. </li><li> 2 ML의 microcentrifuge 관에서 20 % ACN과 4 % 진한 암모니아 1.95 mL의 4 μg의 / ㎖ 15 NAβ 142 50 μL를 첨가하여 100 NG / ㎖ 15 NAβ 1-42 펩티드이 용액을 준비한다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다. </li><li> 표 2에 나타낸 각각의 용액의 양을 혼합하여 용액 여섯 교정기 (AF)를 준비한다. 0.5, 1.5, 2 ML의의 microcentrifuge 튜브를 사용합니다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다. </li><li> 해당 교정 솔루션 및 1 분을위한 와류 믹서 표 3. 믹스에 따라 인간의 CSF를 추가하여 0.5 ML의의 microcentrifuge 튜브 (중복)에 최종 교정기를 준비합니다. </li></ol> 내부 표준 3. 준비 <ol><li> 2 ML의 microcentrifuge 관에서 20 % ACN 4 % 농축 암모니아 1.968 mL의 / mL의 13 CAβ (142) 50 μg의 32 μL를 추가하여 / mL의 13 CAβ 1-42 펩타이드 0.8 μg의 2 용액을 준비합니다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다. </li><li> 5 ML의 microcentrifuge 관에서 20 % ACN과 4 % 진한 암모니아 용액 4.9 μg의 0.8 / mL의 0.1 mL를 첨가하여 16 NG / ㎖ 13 CAβ 1-42 펩티드 5 ㎖를 준비한다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다. </li></ol> 응답 인자 샘플 4. 준비 참고 : 응답 팩터 (RF) 결정은 교정 (15 NAβ 1-42)에 사용되는 표지 된 펩타이드의 농도를 결정하기 위해 수행된다. 이것은 천연 Aβ 1-42 펩티드의 농도는 아미노산 분석 (AAA)를 사용하여 측정 된 것을 필요로한다. 따라서, 체적 고유 Aβ 1-42 펩티드 분취 농도AAA의 요구 사항을 충족해야합니다. <ol><li> 0.5 ML의 microcentrifuge 관에서 20 % ACN 4 % 농축 암모니아 0.46 mL의 / mL의 기본 Aβ 1-42 50 μg의 40 μL를 추가하여 (레이블이 지정되지 않은) 4 μg의 / ML의 기본 Aβ 1-42 0.5 mL로 준비합니다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다. </li><li> 20 %의 1.96 mL의 4 μg의의 / mL의 기본 Aβ 1-42 및 4μg 20 μL / mL의 15 NAβ 1-42을 20 μL를 추가하여 기본 15 NAβ 1-42의 2 mL의 40 NG / ML의 믹스를 준비 ACN과 4 %는 2 ML의 microcentrifuge 관 암모니아를 농축시켰다. 1 분 동안 와동 혼합기에서 혼합한다. </li><li> 0.5 ML의 microcentrifuge 관에서 인공 CSF의 0.38 mL의 40 NG / ML의 믹스의 20 μL를 추가합니다. 중복을 준비하고 1 분 동안 와류 믹서에 혼합한다. </li></ol> 5. 샘플 준비 주의 : 샘플을 해동은 롤러 실온에서 측정한다. <ol><li>그림 1 항에있어서, 1 mL의 단백질 96 깊은 웰 플레이트에 각 교정기, 응답 계수, 및 (사용 된 경우 품질 관리 [QC] 샘플 포함) 미지 시료의 0.18 mL를 넣고 (전체 판을 가정하는 데 사용됩니다). 에 샘플을 추가해야하거나, 우물의 바닥에 근접합니다. </li><li> 각 웰 (즉, 교정기, 응답 인자, QCS, 그리고 미지수)에 내부 표준의 20 μL를 추가; 이는 피펫 팁을 침지하지 않고 시료 표면에 충분히 가까운 측의 방울을 방출하는 것이 중요하다. </li><li> 각 웰에 0.2 ㎖의 5 M 구아니딘 염산염을 추가합니다. </li><li> 마이크로 통에 샘플 플레이트를 배치하고 1,100 rpm에서 45 분 동안 샘플을 섞는다. 최적의 주파수는 기기에 따라 다를 수 있습니다. 혼합기의 주파수 및 진폭을 설정 용액 철저히 혼합하고, 내부 표준 또는 CSF의 어떠한 방울을 웰의 측면에 섞이지 남지 않도록. </li><li> 4 % 인산 0.2 mL를 넣고또한 각. 소용돌이 간략하게 섞는다. </li></ol> 6. 고체 단계 추출 참고 : 모든 세척,로드 및 용출 단계에서는 솔루션을 추가 한 후 가장 낮은 진공을 적용하고로드하거나 솔루션을 용출 필요에 따라 점차적으로 증가한다. 각각의로드 및 용출 단계 사이의 진공을 해제합니다. <ol><li> 혼합 모드에서 폐기물 저장소 트레이를 넣고 추출 플레이트 매니 폴드 챔버 내에서 양이온 교환, 96 웰 고체상 추출 (SPE) 판. </li><li> 각 웰에 0.2 ㎖의 메탄올을 첨가하여 SPE 흡착제를 조정. </li><li> 각 웰에 4 % 인산 0.2 mL를 첨가하여 흡착 평형. </li><li> 특수 목적 판에 깊은 웰 플레이트에서 모든 샘플 (각 웰 약 0.62 ㎖)에 전송합니다. 특수 목적 판에 깊은 웰 플레이트에서 샘플을 전송할 때 8 채널 피펫을 사용하여; 샘플이 인턴 포함 이래로, 모든 시료의 전체 또는 같은 부피를 전송하는 것이 중요하지 않다변화를 보상합니다 알 표준입니다. </li><li> 샘플을 각 웰에 4 % 인산 0.2 mL를 첨가하여 통과 한 후 흡착제를 세척한다. </li><li> 세정 용매 흡착제에서 용출 한 후, 컬렉션 플레이트 또는 튜브 저수지 트레이를 교체합니다. </li><li> 배 75 % ACN / 10 % 농축 암모니아 50 μL를 첨가하여 흡착제로부터 시료를 용출하고,이 용액이 흡착제를 통과하는 매우 낮은 진공을 요구주의. 각 추가 사이의 진공을 해제해야합니다. <ol><li> 선택 사항 : 컬렉션 플레이트 또는 튜브를 밀봉하고 -80 ° C에서 그들을 고정. 6.8.2 단계로 진행하기 전에 수집 판 또는 튜브에서 씰을 제거합니다. </li><li> (열을 가하지 않고) 진공 원심 분리를 이용하여 용출액을 건조; 이것은 진공 원심 분리기에 따라 몇 시간이 하나로부터 취할 수있다. </li><li> 용기를 밀봉하고 -80 ° C에서 그들을 고정. </li></ol></li></ol> 7. 액체 크로마토 그래피에그래피로 <ol><li> , 바늘 세척 (50 % ACN (ACN [V / V]에서 4 % 탈 이온수와 0.1 % 농축 암모니아), B (탈 이온수 [V / V] 5 % ACN 0.3 % 농축 암모니아) 모바일 A 상을 준비 4 %가 탈 물에 암모니아를 집중 [V / V]). <ol><li> 이동상 A의 500 ㎖를 들어, ACN 25 mL의 탈 이온수에 집중 암모니아 1.5 mL를 넣어. 탈 이온수 500 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 이동상 B의 500 ㎖를 들어, 진한 암모니아 500 μL와 ACN을 증류수 25 mL를 첨가. ACN 500 mL의에 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> ACN 120 mL의 탈 이온수에 집중 암모니아 10 ㎖를 추가하여 바늘 세척 250 mL로 준비합니다. 탈 이온수 250 mL의에 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 액정 시스템을 사용하기 전에 20 분 동안 초음파 욕조에서 열린 이동상 A와 B와 바늘 세척 병을 넣어 </li></ol></li><li> 25 μL 집중하고 % ACN 20 %의 4 각 샘플을 녹여테드 암모니아 용액을 20 분 동안 진탕에 배치합니다. 샘플 아래 원심 분리기 및 자동 시료 주입기에 배치 (7 ° C로 유지). </li><li> 50 ° C로 유지 된 1 × 250mm이 폴리스티렌 - 디 비닐 벤젠 (역상) 모노리스 컬럼 시료 20 μL를 주입한다. <ol><li> 0.3 mL / 분의 유속으로 표 4에 나타낸 LC 구배를 사용한다. 질량 분광계 오염을 감소시키기위한 전환 밸브를 사용하여 (이후 열) 낭비 처음 두 개의 지난 5 분 전환. </li></ol></li></ol> 8. 질량 분석 주의 : 이러한 파라미터 aheated 전기 분무 이온화 소스를 구비 한 하이브리드 orbitrap 극자 질량 분광계를 사용 하였다. <ol><li> 표 5에 따라 이온 소스의 매개 변수를 설정합니다. </li><li> (네이티브 Aβ 1-42의 4+ 충전 상태를 분리 1,129.48 질량을 MS 악기를 설정2.5 m / z의 분리 폭을 갖는 사중 극 질량 분석 장치에 충전 비율 [의 m / z), 1-42 15 NAβ (1,143.00 m / z), 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z). </li><li> 17.0의 충돌 에너지 정규화 (NCE)에 충돌 셀의 격리 펩타이드 조각. (예를 들면, 삼중 사중 MS와 같은 악기의 다른 형태를 사용하여, 특히 경우)에도 동일한 형태의 이것은 각 기기 조율 할 필요가 있습니다. </li><li> 2 × 5 요금 자동 이득 제어 대상 및 250 ms의 최대 분사 시간과, 17.500의 해상도 단편 스펙트럼을 기록한다. </li></ol> 9. 데이터 처리 <ol><li> 각 펩티드에 대한 크로마토 그래피 영역을 계산하기 표 6 (± 250 밀리 질량 부 [MMU]의 질량 공차) 생성물 이온의 합을 사용한다. 이온의 종류와 숫자가 네이티브 Aβ에 대해 표시되어 있습니다 <suB&gt; 1-42 산물 이온들은 NAβ 15 1-42 13 CAβ 1-42 모두 동일하기 때문이다. </li><li> 천연 Aβ 1-42의 곡선 아래 영역 (15) NAβ 1-42 곡선 (크로마토 그래피 피크) 아래의 영역을 분할하여 두 응답 인자 샘플들의 평균 응답 인자를 결정한다. </li><li> 단계 9.2에서 계산 된 반응 인자를 곱하여 보정에 사용 된 15 NAβ 1-42의 농도를 조정한다. </li><li> 농도 대 구경 두 세트에서 13 CAβ 1-42에 NAβ 1-42 (15)의 면적비를 플로팅하여 교정 곡선을 구축. </li><li> 선형 회귀를 사용하여 보정 곡선의 기울기 및 절편을 계산한다. </li><li> 해제에 대한 내부 표준 (13 CAβ 1-42) 네이티브 Aβ 1-42의 면적 비율을 계산알려진 샘플. </li><li> 단계 9.5에서 얻어진 기울기 및 절편을 이용하여 검량선으로부터 미지 시료의 농도를 추정. </li></ol>

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JP와 EP는 공개를 보고하지 않습니다. HZ는 Roche Diagnostics, Eli Lilly 및 Pharmasum Therapeutics의 자문 위원회에서 활동했습니다. KB는 Fujirebio Europe, IBL International 및 Roche Diagnostics의 컨설턴트 또는 자문 위원회에서 활동했습니다. HZ와 KB는 예테보리 대학의 GU 벤처 기반 플랫폼 회사인 예테보리 AB에 있는 Brain Biomarker Solutions의 공동 창립자입니다.

상술 한 방법 대신 대용 행렬을 이용하여, 우리는 인간 CSF의 교정을 가능하게 대리 분석 방법 13, 14, 15, 16을 사용 하였다. 대리 분석 방법은 두 가지 동위 원소 표지 된 표준을 포함한다. 또 (13 CAβ 142) 내부 표준으로 사용되는 동안 온 (15 NAβ 142), 인간 CSF의 보정 곡선을 생성하는데 사용된다. 교정 곡선이 계산 내인성 Aβ 13분의 142 CAβ (142)의 비율로 15 NAβ 13분의 142 CAβ 142 비율을 사용하여 구성에서 알 수없는 내인...

알츠하이머 병 (AD)은 치매의 가장 흔한 형태이며, 전 세계적으로 한 약 35 만명에 영향을 미친다. 널리 AD의 발병 기전의 핵심 거짓말을 믿고 병의 신경 병리학 적 특징은 집계 아밀로이드 - 베타 (Aβ) 펩타이드 3 구성된 hyperphosphorylated 타우 단백질이 세포 내 신경 섬유 엉킴 및 세포 외 플라크 있습니다. 이에 맞춰, 바이오 마커에 의해 생체 내에서 플라크 병리의 평가는 최근에 AD 4에 대한 연구 진단 기준에 포함되었습니다. Aβ 1-42의 CSF 측정을 위해 여러 가지 면역 사용할 수 있으며 많은 임상 실험실 (5)에 사용됩니다. CSF에서 Aβ 1-42의 농도는 BR에 플라크의 펩티드의 침착을 반영인지 정상 노인보다 AD 환자의 약 50 % 낮다아인 (6, 7). 이러한 생체는 주로 면역 (예를 들어, 항체 - 기반 기술)을 사용하여 분석하지만, 이러한 분석은 매트릭스의 효과 (8)에 의해 영향을받을 수있다. 다른 기술 플랫폼의 면역 분석 및 표준화 9의 부재의 사용은 10 11 12 어려운 글로벌 컷오프 농도로 도입한다. 해석 적 검증 RMP는 이상적으로 분석 플랫폼에서 더 나은 비교와 전체 측정 변동에 기여하는 요인의 더 나은 제어의 결과로, 다른 분석 플랫폼의 균일 보정을 허용합니다. 현상 된 LC-MS / MS 방법을 사용하여 Aβ 1-42의 절대 정량 항체 기반 TECHN와 관련된 많은 문제들을 극복iques. 실험 의약 추적을위한 합동위원회 (JCTLM 데이터베이스 식별 번호 C11RMP9)에 의해 RMP로 나열있어서, CSF Aβ 한 조화하는 인증 표준 물질 (CRM)에서 Aβ 1-42의 절대 농도를 결정하는 데 사용될 기술 및 분석 플랫폼에서 -42 측정. 설명 된 워크 플로는 의학의 다른 영역에서 펩타이드 및 단백질 후보 참조 방법의 개발을위한 관련이 있어야한다.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Protein LoBind 마이크로 원심분리기 튜브, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind 마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind 마이크로 원심분리기 튜브, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind 마이크로 원심분리기 튜브, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0.75 mL 폴리프로필렌 튜브, V-bottom</td><td>Micronic</td><td>MPW32071BC3</td><td>Tube는 SPE 용출액을 수집하는 데 사용되지만, 96-well plates와 같은 다른 집취 장치도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>96 ind. 튜브용 Micronic Split TPE Capcluster</td><td>Micronic 튜브용</td> <td>Micronic</td><td>MP53026</td> 캡.</tr><tr><td>Micronic Loborack-96 화이트 w 하이 커버 바 코드</td><td>Micronic 튜브 용</td> <td>Micronic</td><td>MPW51015BC3</td> 홀더.</tr><tr><td>Biohit Optifit 팁 1.2mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>LoBind 딥웰 플레이트(96-well)의 바닥까지 도달하는 데 사용됩니다. 다른 좁은 팁도 작동할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Waters Oasis MCX 96-웰 &마이크로; 용출 플레이트</td><td>워터스</td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Waters 플레이트 매니폴드 저수지 트레이</td><td>Waters</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Waters 추출 플레이트 매니폴드 오아시스 96웰 플레이트용</td><td>Waters</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액, puriss. PA, REAG. ISO, 재조정. Ph. Eur., ~25% NH3 기초</td><td>시그마-알드리치</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, 원자외선 HPLC 그라디언트 등급, 2.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>오르토 인산 85%, ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>구아니딘 염산염, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap 질량분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>번들 Dionex Ultimate 3000 LC 및 자동시료주입기 포함.</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H 모놀리식 컬럼 (1.0 x 250mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 동결 건조 분말, (분자 생물학용), 비아세틸화</td><td>시그마-알드리치</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>베타-아밀로이드(1-42), 초순수, TFA</td><td>r펩타이드</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N 베타-아밀로이드(1-42), 균일 라벨링된</td><td>r펩타이드</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C 베타-아밀로이드(1-42), 균일하게 라벨링된</td><td>r펩타이드</td><td>A-1106-2</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 셰이커, TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml; 흘러</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

aβ의 절대 정량<sub&gt; 1-42</sub&gt; csf의 질량 분석 참조 측정 절차를 사용하여

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

알츠하이머병(AD)은 노인들 사이에서 가장 흔한 신경퇴행성 질환으로 모든 치매 사례의 60-80%를 차지합니다. 현재 알츠하이머병의 진단은 인지 검사와 정신 상태 검사를 기반으로 하고 있지만, 뇌척수액(CSF)의 펩타이드 아밀로이드-베타(Aβ)는 임상시험 및 환경에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 대부분의 단백질 및 펩타이드 바이오마커의 경우, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)과 같은 항체 기반 기술을 사용하여 정량화를 수행합니다. 그러나 이러한 분석의 실험실 내 및 실험실 간 변동성은 임상 루틴에서 진단 마커로 사용하는 데 방해가 됩니다.
고체상 추출(SPE) 및 액체 크로마토그래피(LC)-탠덤 질량 분석법(MS/MS)을 기반으로 항체 독립적 참조 측정 절차(RMP)가 개발되었으며, 여기서 안정적인 동위원소 표지 Aβ 펩타이드를 내부 표준물질로 사용하여 절대 정량화가 가능했습니다. 측정에는 고분해능 사중극자-오비트랩 하이브리드 기기가 사용되었습니다. 이 방법을 사용하면 150-4,000pg/mL 사이에서 CSF Aβ1-42를 정량화할 수 있습니다.

그림 1의 판 설치 샘플의 전체 판에 사용됩니다. 이하 미지 시료를 분석 할 경우, 제 교정기는 RF 및 QC 세트는 미지 시료의 전반부 뒤에 배치한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 구경이 낮은 표준 편차와, 회귀 직선에 가깝다. 이 방법은 150 pg / ml 인 4,000 pg / ml 인의 정량의 상위 레벨의 정량의 낮은 수준을 보유하고 있습니다. 교정의 잔존 표준 편차는 물론 가능한 한 낮아야한다. 보정이 비선형 인 경우, 런 (정도)에 따라 폐기되어야하고, 편차 때문에 구경 희석 잘못된 피펫 기술 및 / 또는 오류 가능성이있다. 복제의 변동 (CV)의 계수가 20 % 이하이지만, 바람직하게는 10 % 미만이어야한다. <p class="jove_content" fo:keep-t<htm...

고체상 추출 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법을 기반으로 한 인간 CSF에서Aβ 1-42의 절대 정량화를 위한 참조 측정 절차에 대해 설명합니다.

Aβ의 절대 정량<sub&gt; 1-42</sub&gt; CSF의 질량 분석 참조 측정 절차를 사용하여

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

이 표준 측정 절차의 전반적인 목표는 인간 뇌척수액(CSF) 내 beta의 측정을 표준화하는 것입니다. 이 방법은 중추 아밀로이드 병증의 바이오마커이자 알츠하이머병의 신경병리학적 특징인 CSF a beta 42 측정 분석법을 표준화하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 철저히 검증되었으며, AVR 142의 정량을 위해 항체를 사용하지 않는다는 점입니다.이 기술의 함의는 알츠하이머병 치료로까지 확장되는데, 이는 분석법을 표준화하고 임상 시험에서 일반적인 컷오프 수준의 도입을 용이하게 하는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 이 방법은 인간의 아밀로이드 병리에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 형질 전환 마우스 및 비인간 영장류와 같은 다른 포유류 생물에도 적용하여 새로운 약물을 개발하는 데 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 AVR 142가 매우 소수성이라 피펫 팁이나 튜브와 같은 표면에 쉽게 달라붙기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.먼저, 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 20% acetonitrile과 4% concentrated ammonia 0.46 mL를 넣고 N15 a beta peptide 40 µL를 추가합니다. 볼텍스 믹서로 펩타이드 용액을 1분 동안 혼합합니다. 2 mL 마이크로원심분리 튜브에 20% acetonitrile과 4% concentrated ammonia 1.95 mL를 넣고, 여기에 펩타이드 용액 50 µL를 추가합니다.펩타이드 용액을 볼텍스 믹서로 1분간 혼합합니다. 다음으로, 마이크로원심분리 튜브에 각 용액의 적절한 부피를 혼합하여 6개의 교정액을 준비합니다. 교정액을 혼합한 후, 해당 교정액과 인간 CSF의 적절한 부피를 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 혼합하여 최종 교정액을 이중으로 준비합니다.각 용액을 볼텍스 믹서로 1분 동안 혼합합니다. 내부 표준물질을 준비하려면, 먼저 2 mL 마이크로원심분리 튜브에 20% acetonitrile 및 4% concentrated ammonia 1.968 mL를 넣고 13C a beta peptide 32 µL를 추가합니다. 펩타이드 용액을 볼텍스 믹서로 1분 동안 혼합합니다.다음으로, 5 mL 마이크로원심분리 튜브에 20% acetonitrile 및 4% concentrated ammonia 4.9 mL를 넣고, 여기에 펩타이드 용액 0.1 mL를 추가합니다. 볼텍스 믹서로 펩타이드 용액을 1분 동안 혼합합니다. 반응 계수 샘플을 준비하려면, 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 20% acetonitrile 및 4% concentrated ammonia 0.46 mL를 넣고, 여기에 native a beta peptide 40 µL를 추가합니다.혼합 후, 2 mL 마이크로원심분리 튜브에 20 µL의 펩타이드 용액과 4 µg/mL의 15N a beta 펩타이드 20 µL를 20% acetonitrile 및 4% 농축 암모니아 1.96 mL에 첨가합니다. 볼텍스 믹서를 사용하여 펩타이드 용액을 1분 동안 혼합합니다. 그 후, 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 들어있는 0.38 mL의 인공 CSF에 펩타이드 용액 20 µL를 첨가합니다.중복 시료를 준비한 후, 각 용액을 볼텍스 믹서로 1분 동안 혼합합니다. 롤러에서 샘플을 해동한 후, 각 교정물, 반응 계수 및 미지 샘플 0.18 milliliters를 1 milliliter 단백질 96 딥웰 플레이트에 분주하며, 이때 샘플이 웰의 바닥 또는 바닥 근처에 추가되도록 합니다. 이제 피펫 팁을 담그지 말고 샘플 표면 근처의 웰 벽면에 표준 물질 한 방울을 떨어뜨려 각 웰에 내부 표준 물질 20 microliters를 추가합니다.그 다음, 각 웰에 5 M guanadine hydrochloride 0.2 milliliters를 첨가합니다. 샘플 플레이트를 마이크로플레이트 쉐이커에 놓고 1100 rpm에서 45분 동안 샘플을 혼합합니다. 혼합 후, 각 웰에 4% phosphoric acid 0.2 milliliters를 첨가합니다.그 다음, 샘플 플레이트를 마이크로플레이트 셰이커에 올리고 1000 rpm에서 짧게 혼합합니다. 추출 플레이트 매니폴드 챔버 내의 혼합 모드 양이온 교환 96웰 고체상 추출(SPE) 플레이트 아래에 폐액 수거용 리저버 트레이를 배치합니다. 이어서, 각 웰에 0.2 milliliters의 메탄올을 첨가하여 SPE 흡착제를 컨디셔닝합니다.그런 다음, 각 웰에 4% 인산을 0.2 milliliters 추가하여 흡착제를 평형화합니다. 8채널 피펫을 사용하여 딥 웰 플레이트의 모든 샘플을 SPE 플레이트로 옮깁니다. 이어서, 샘플이 통과한 후 각 웰에 4% 인산을 0.2 milliliters 추가하여 흡착제를 두 번 세척합니다.세척 용매가 흡착제에서 용출된 후, 리저버 트레이를 튜브로 교체하십시오. 이제 75% acetonitrile과 10% concentrated ammonia 혼합액 50 µL를 두 번 나누어 가하여 흡착제로부터 시료를 용출시키십시오. 이때, 이 용액이 흡착제를 통과하려면 매우 낮은 진공도가 필요하다는 점에 유의하십시오. 가열하지 않은 상태에서 진공 원심분리기를 사용하여 용출액을 건조하십시오.마지막으로, 튜브를 밀봉하고 분석 시까지 -80 °C에서 냉동 보관합니다. 캘리브레이터는 낮은 표준 편차와 함께 회귀선에 근접해야 합니다. 캘리브레이션이 비선형인 경우 해당 런은 폐기해야 하며, 이러한 편차는 주로 잘못된 피펫팅 기술 및/또는 캘리브레이터 희석 오류로 인해 발생합니다.반복 측정값의 변동 계수는 가급적 10% 미만이어야 합니다. 천연 15N 및 13C a beta는 LC 컬럼에서 거의 대칭적인 피크를 형성하며 유의미한 테일링 없이 동시에 용출됩니다. 각 피크에 대해 최소 10회의 측정이 수행되어야 하며, 이는 분석법의 최대 주입 시간으로 조정할 수 있습니다. 분석법의 감도가 최적이지 않은 경우가 아니라면, MS 분석 중에 펩타이드들을 동시에 측정할 수 있으며, 감도가 낮은 경우에는 매 주입 시 관심 펩타이드만 측정해야 합니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 펩타이드 용액을 옮기기 전에 항상 피펫 팁을 충분히 적셔야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, dead volume이 최대한 적은 튜브를 사용하는 것이 중요합니다.이 기술은 개발 이후, 알츠하이머병 분야의 연구자들이 아밀로이드 PET 영상과 같은 다른 방법들과의 일치성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 또한, CSF 기반 표준 물질에 베타 142 농도를 할당하는 데에도 사용되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 인간 CSF 내의 교정 물질을 준비하는 방법과 샘플 내 베타 142의 절대 농도를 측정하기 위해 LCMS 분석 전 고상 추출법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.인체 뇌척수액(CSF)을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑, 보호 안경 및 기타 안전 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Samuels, D. J. 외 황 색포도상구균의 대사물 분석을 위한 액체 크로마토그래피-질량분석법 기반 탠덤 접근법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 액체 크로마토그래피-질량분석법을 사용하여 S. aureus의 세포 내 대사산물을 식별하고 정량하는 방법을 보여줍니다. 대사물 추출, 펩타이드 정규화, 액체 크로마토그래피, 질량분석에 포함된 단계를 개괄합니다.

S. aureus의 대사산물 분석을 위한 액체 크로마토그래피–질량분석법 기반 접근법

이 논문은 생리 학적으로 정의 된 생물 표본의 세포 이하의 해상도에서 총 칼슘 함량과 분포의 정량적 측정에 cryoanalytical 전자 현미경의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

전자관 X-선 마이크로 분석에 의한 뉴런의 총 칼슘의 측정

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

미세조류 배양과 산업용 연도 가스의 통합은 궁극적으로 중금속 및 기타 무기 화합물을 성장 배지에 도입할 것입니다. 이 연구는 광생물반응기에서 자란 Nannochloropsis salina의 성장에 대한 중금속 및 무기 오염 물질의 최종 운명과 영향을 결정하는 데 사용되는 절차를 제시합니다.

중금속과 미세 조류의 생산성에 다른 무기 오염 물질의 정량화

이 프로토콜은 선택된 반응 모니터링을 사용하여 복잡한 생물학적 샘플 내 표적 단백질의 절대 정량화 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 마우스 대식세포 화학주성 신호전달 경로의 단백질을 정확하게 정량화하는 데 사용되었습니다. 표적 펩타이드 선택, 분석 개발, 정성적 및 정량적 분석이 자세히 설명되어 있습니다.

절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 연결된 크기 배제 크로마토그래피는 생물학적 시료에서 직접 금속 단백질의 다양성 변화를 측정할 수 있는 강력한 도구입니다. 여기에서는 분자 질량 및 알려지지 않은 단백질과 관련된 금속의 양을 추정하는 데 사용되는 일련의 금속 단백질 표준물질에 대해 설명합니다.

크기 배제 ICP-MS를 이용하여 정량적 Metalloproteomic 분석을위한 표준

우리는 임상 번역 잠재력 개발 된 높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 뇌척수액 (CSF) 분석에 대해 설명합니다. 시험은 예컨대 아포지 단백질 E 변형 (E2, E3 및 E4)과 같은 신경 퇴행에 대한 잠재적 마커 및 위험 인자를 정량하고, 그 대립 유전자 발현을 측정 할 수있다.

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

단백질 합성은 세포에 대 한 중요 한 생물학적 과정. 뇌에서는 적응 적 변화에 필요합니다. 그대로 뇌에서 단백질 합성의 속도의 측정은 신중한 방법론고려가 필요합니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 대뇌 단백질 합성의 국소 비율의 측정을 위한 L-[1-14 C]-류신 정량적 자가 방사선 측정 방법을 제시한다.

생체 내 뇌 단백질 합성의 지역 비율 측정을 위한 정량적 자가 방사선 측정 방법

높은 척수액 단백질 수준은 변경된 혈액 뇌 장벽 또는 신분 합성을 통해 혈장 단백질의 확산의 결과일 수 있습니다. 최적화된 테스트 프로토콜은 두 경우를 모두 구별하는 데 도움이 되며 합성된 단백질의 정량적 측정을 제공하는 이 문서에 제시되어 있습니다.

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

학습하세요 인간 뇌척수액에서 Aβ1-42의 절대 정량을 위한 질량 분석 참조 측정 절차를 사용하는 방법을. 이 기술은 알츠하이머병 바이오마커 표준화와 임상시험 컷오프 수준 도입을 지원합니다.

Aβ의 절대 정량

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