Aβ의 절대 정량 _1-42 CSF의 질량 분석 참조 측정 절차를 사용하여

이 참조 측정 절차의 전반적인 목표는 인간 CSF의 베타 측정을 조화시키는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머병의 중심 아밀로이드 병리학 및 신경병리학적 특징에 대한 바이오마커인 CSF, 베타 42 측정을 위한 분석을 표준화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 철저하게 검증되었으며 AVR 142의 정량화에 항체를 사용하지 않는다는 것입니다.

이 기술의 의미는 알츠하이머병 치료로 확장되는데, 이는 분석을 조화시키고 임상 시험에서 일반적인 컷오프 수준의 도입을 촉진하는 데 사용되기 때문입니다. 이 방법은 인간의 아밀로이드 병리학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 형질전환 마우스 및 비인간 영장류와 같은 다른 필멸 유기체에도 적용하여 신약을 주입할 수 있습니다. 일반적으로 AVR 142는 소수성이 매우 강하고 피펫 팁 및 튜브와 같은 표면에 쉽게 달라붙을 수 있기 때문에 이 방법을 처음 사용하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다.

먼저, 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 0.46 밀리리터의 20% 아세토니트릴 및 4% 농축 암모니아에 N15 베타 펩타이드 40 마이크로리터를 첨가합니다. 펩타이드 용액을 와류 믹서에서 1분 동안 혼합합니다. 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 1.95밀리리터의 20% 아세토니트릴 및 4% 농축 암모니아에 50마이크로리터의 펩타이드 용액을 추가합니다.

펩타이드 용액을 와류 믹서에서 1분 동안 혼합합니다. 다음으로, 마이크로 원심분리기 튜브에서 각 용액의 적절한 부피를 혼합하여 6개의 교정기 용액을 준비합니다. 캘리브레이터 용액을 혼합한 후, 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 해당 캘리브레이터 용액과 인간 CSF를 적절한 부피로 혼합하여 최종 캘리브레이터를 복제하여 준비합니다.

볼텍스 믹서에서 각 용액을 1분 동안 혼합합니다. 내부 표준물질을 준비하려면 먼저 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 1.968밀리리터의 20% 아세토니트릴 및 4% 농도 암모니아에 13C 베타 펩타이드 32마이크로리터를 추가합니다. 펩타이드 용액을 와류 믹서에서 1분 동안 혼합합니다.

다음으로, 5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 0.1ml의 펩타이드 용액을 4.9ml의 20%아세토니트릴 및 4%농도 암모니아에 추가합니다. 펩타이드 용액을 와류 믹서에서 1분 동안 혼합합니다. 반응 인자 샘플을 준비하기 위해 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 0.46ml의 20% 아세토니트릴 및 4% 농축 암모니아에 40마이크로리터의 네이티브 베타 펩타이드를 추가합니다.

혼합 후 20 밀리리터의 펩타이드 용액과 20 밀리리터 당 4 마이크로 그램, 15N 베타 펩타이드를 2 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 20 % 아세토 니트릴 및 4 % 농축 암모니아 1.96 밀리리터에 첨가합니다. 펩타이드 용액을 와류 믹서에서 1분 동안 혼합합니다. 그런 다음 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 20마이크로리터의 펩타이드 용액을 0.38ml의 인공 CSF에 추가합니다.

복제본을 준비한 후 각 용액을 와류 믹서에서 1분 동안 혼합합니다. 롤러에서 샘플을 해동한 후 각 캘리브레이터, 반응 인자 및 알 수 없는 샘플을 0.18ml를 1mL protein 96 deep well plate에 추가하고 well의 바닥 내부 또는 바닥 근처에 샘플을 추가해야 합니다. 이제 피펫 팁을 물에 담그지 않고 샘플 표면에 가까운 웰 측면에 표준물질 한 방울을 떨어뜨려 각 웰에 20마이크로리터의 내부 표준물질을 추가합니다.

그런 다음 각 웰에 0.2ml의 5몰 구아나딘 하이드로클로라이드를 추가합니다. 샘플 플레이트를 마이크로플레이트 셰이커에 놓고 샘플을 1100rpm으로 45분 동안 혼합합니다. 혼합 후 각 웰에 0.2ml의 4% 인산을 첨가합니다.

그런 다음 샘플 플레이트를 마이크로플레이트 셰이커에 놓고 1000rpm으로 짧게 혼합합니다. 혼합 모드 양이온 교환 96웰 고체상 추출 또는 추출 플레이트 매니폴드 챔버의 SPE 플레이트 아래에 폐기물용 저장 트레이를 놓습니다. 다음으로, 각 웰에 0.2ml의 메탄올을 첨가하여 SPE 흡착제를 컨디셔닝합니다.

그런 다음 각 웰에 0.2ml의 4% 인산을 추가하여 흡착제를 평형화합니다. 8채널 피펫을 사용하여 딥 웰 플레이트의 모든 샘플을 SPE 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 샘플이 통과한 후 각 웰에 0.2ml의 4% 인산을 추가하여 흡착제를 두 번 세척합니다.

세척 용제가 흡착제에서 용출된 후 저장 탱크 트레이를 튜브로 교체하십시오. 이제 75% 아세토니트릴과 10% 농축 암모니아의 50마이크로리터 알로콰트 2개를 추가하여 흡착제에서 샘플을 용리하며, 이 용액은 흡착제를 통과하는 데 매우 낮은 진공이 필요하다는 점에 유의합니다. 열을 가하지 않고 진공 원심분리를 사용하여 용리액을 건조시킵니다.

마지막으로 튜브를 밀봉하고 분석할 때까지 섭씨 80도에서 동결합니다. 교정기는 표준 편차가 낮은 회귀선에 가깝습니다. 교정이 비선형인 경우 run을 폐기해야 하며 편차는 잘못된 피펫팅 기술 및/또는 교정기 희석 오류로 인한 것일 가능성이 큽니다.

복제의 변동 계수는 바람직하게는 10% 미만이어야 합니다.네이티브 15N 및 13C는 대칭 피크에 가깝고 유의한 테일링 없이 동시에 LC 컬럼에서 베타 용리됩니다. 각 피크에 대해 최소 10회의 측정을 수행해야 하며 분석법에서 최대 주입 시간으로 조정할 수 있습니다. 펩타이드는 분석법 감도가 최적화되지 않는 한 MS 분석 중에 동시에 측정할 수 있으며, 각 주입에 대해 관심 펩타이드만 측정해야 합니다.

이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 펩타이드 용액을 옮기기 전에 항상 피펫 팁을 포화시키는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 공극 부피가 가능한 한 적은 튜브를 사용하는 것도 중요합니다.

개발 후 이 기술은 알츠하이머병 분야의 연구자들이 아밀로이드 PET 이미징과 같은 다른 방법과의 일치를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 또한 CSF 기반 참조 물질에 베타 142 농도를 할당하는 데 사용되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 CSF에서 캘리브레이터를 준비하는 방법과 LCMS 분석 전에 고체상 추출을 사용하여 샘플에서 베타 142의 절대 농도를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

사람의 CSF로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 보호 안경 및 기타 안전 조치와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.