Name: 전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 학습하세요 급성 신경 조직의 장기간 배양 기법으로 24시간 이상 조직 활성을 유지하는 방법을. 전기 생리학 및 칼슘 이미징 실험에 활용하여 동물 사용을 줄이고 데이터 품질을 향상시킵니다.

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기술 지원을 제공해 주신 Colin Symons와 James Wright에게 감사드립니다. 이 작업은 Y.B.와 웨스턴 시드니 대학교의 혁신 사무소에 대한 시드 펀딩 보조금(WSU)의 지원을 받았습니다. MC는 ARC 펠로우십(DECRA)의 지원을 받습니다.

프로토콜은 아래의 C57BL / 6 및 C3H / 그는 (retinally 퇴화) 마우스의 신경 조직의 제조 방법을 설명하지만, 유사한 기술들이 다른 종에도 적용 할 수있다. 모든 동물은 건강하고 표준 온도 조건, 습도, 12 시간 조명 / 어두운주기, 음식과 물을 무료로 이용할 취급했고, 어떤 의도 스트레스 자극없이. 모든 실험 승인 및 웨스턴 시드니 대학 동물 관리 및 윤리위원회에 따라 수행하고 동물 사용 및 관리 지침 (동물 연구 기관 # A9452, # A10396 및 #의 A8967)에 따라되었다. 1. 뇌 조각 준비 <ol><li> 이소 플루 란 (5 %)의 흡입에 의해 동물을 마취 및 설치류 단두대를 사용하여 목을 벨. 이전 9 설명한대로, 신속하게 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 생리 솔루션 (ACSF) (단위 : mm)를 포함 넣 : 125 염화나트륨,의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2를 25 2.5의 KCl, 1NaHCO3을 25 덱 스트로스 carbogen 포화 (95 % O 2 / 5 % CO 2 혼합물 310 mOsm하여 pH 7.4). </li><li> 진동 마이크로톰 300 μm의 두께, 관심 영역에서 뇌 조각을 잘라. </li><li> 이전 10 11 바와 같이 carbogen 흐름 및 온도 - 밀접하게 모니터링하여 pH 수준 (7.4의 pH 7.2)을 제어 주문품 배양 시스템 슬라이스 전송. </li><li> 15 ~ 35 ° C로 초기 챔버 온도를 설정 - 30 분, 천천히 15로 감소 - 그림 1C에서와 같이 16 ° C. 필요할 때까지 다음 중 전기 생리학 또는 이미징, 배양 시스템에서 슬라이스를 품어. 참고 : 슬라이스가 칼슘 이미징에 사용하는 경우, RT 아래 조직을 냉각하기 전에 다음 단계를 수행합니다. </li></ol> 2. 망막 Wholemount 준비 및 내부 경계 막 제거 <ol><li> 두 정상에서 망막 wholemounts을 준비실험실 조명 조건이나 어두운 레드 / 적외선 빛. </li><li> 자궁 경부 전위 즉시 명백히하다 눈으로 동물을 안락사. 에임스 미디어, 또는 ACSF 포함하는 하나의 작은 오라 세라 따라 잘라 내기, 장소 (MM) 확인 : (125)의 NaCl을, 25의 NaHCO3, 3의 KCl, 2 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2, 10 글루코스, 0.5 L 글루타민, 및 carbogen로 포화 (2 / 5 % CO 2 혼합물을 95 % O; ~ 300 mOsm하여 pH 7.4)에서 RT. </li><li> 즉시 작은 가위로 오라 세라 따라 절단 집게로 렌즈와 유리체를 제거하여 각막, 렌즈 및 유리체를 제거합니다. 실온에서 배양 시스템에서 조직을 놓습니다. 참고 : 망막 조직이 15 느린 온도 감소 후, 눈 컵에서 유지 될 수있다 - 필요할 때까지 배양 시스템에서&gt; 24 시간 동안 16 ° C. </li><li> Earl&#39;s- 30 U / mL의 파파인, 1 MM의 L - 시스틴, 0.5 mM의 EDTA와 0.005 %의 DNase의를 포함하는 작은 유리 항아리에 망막을 포함한 눈 컵을 전송의 ILM을 제거하려면20 분 동안 37 ° C에서 균형 소금 용액 (BSS). 뚜껑을 통해 용액에 95 % O 2 / 5 % CO 2를 적용하지만 거품하지 않습니다. 젊은 동물 (&lt;6 주)에서 조직을 사용하는 경우, 반 강도 솔루션을 희석. <ol><li> 얼 BSS에서 10 분 동안 ovomucoid (10 ㎎ / ㎖) 및 BSA (10 ㎎ / ㎖) 용액에 조직을 배치하여, 소화 효소를 중지. 16 ° C - 워시 조직을 철저하게 ACSF와 배양 시스템에 전송하기 전에 15에 온도를 줄일 수 있습니다. </li></ol></li><li> 필요할 때까지 눈 컵에서 망막 조직을 유지한다. 현미경에 전송, 눈 컵에서 망막을 분리하고 면도칼 4 조각으로 잘라. 전체 망막이 필요한 경우에는 평평 할 수 있도록 망막의 주위에 4 개의 작은 상처를 만든다. 참고 : 이미징 실험, 배양 시스템에 전송하기 전에 칼슘 염료와 부하 내용은 아래를 참조하십시오. </li></ol> 3. 인큐베이터에서 조직을 유지 <ol><li&gt; pH와 온도 측정 용 프로브 (그림 1A, B)를 포함하는 메인 챔버에 넣어 조직. </li><li> 용액에 떠있는 박테리아를 방사하다하기 위해 (5W / 2P 살균기 UV 램프, 254 ㎚) 주 챔버로부터 분리 및 UVC 빛 W 1.1에 노출 (이전 12 설명한 바와 같이 내장, UVC 실) 두 번째 챔버를 통해 ACSF를 순환 (그림 1A). ACSF의 과열을 방지하기 위해 30 분 - 15 분마다 15 사이에 26 다양한 시간에 ON이 임의의 기능을 사용하여 프로그램 타이머를 통해 제어 UVC 빛 타이밍. </li><li> 12 mL의에 UVC 챔버 내의 유량을 설정 / 분으로 12 이전보고 하였다. 신경 조직을 손상시킬 수있는 챔버, UVC 외부 조명을 방지하는 알루미늄 호일로 UVC 챔버 커버. 주 : 어두운 적응 망막 조직의 경우, 빛을 제외 할 주요 챔버로 맞춤 커버를 적용합니다. </li><li> circula하는 연동 펌프를 사용하여TE 두 챔버를 통해 용액 (ACSF)와 0의 범위 내의 원하는 온도로 냉각 또는 주 챔버를 가열하거나 냉각 기능 펠티에 열전 냉각 판 - 50 ° C. 장기 생존을위한 16 ° C - 최적의 조직 배양를 들어, 15을 사용합니다. </li></ol> 4. 칼슘 염료로드 <ol><li> 개별 연구자의 선호도에 따라 칼슘 염료를 선택합니다. 여기에서 우리는의 Fura-오전 2시, FLUO-오전 8시 또는 FLUO-오전 4시를 사용합니다. 그러나,이 방법은 또한 다른 염료에 적용될 수있다 : 1 mM의 용액 및 1 %의 블록 공중 합체에 DMSO 칼슘 염료를 용해 (예를 들어, 플루로 닉 산 (127))를 10 분 동안 최종 50 μL의 부피 및 초음파 처리한다. </li><li> 망막 10 μM, 뇌 조각 0.01 %의 블록 공중 합체, 및 20 μM (망막), 0.02 %의 블록 공중 합체의 최종 농도로 용액 ACSF 추가. F 37 ° C (의 Fura-2 AM) 또는 실온에서 (FLUO-4를 오전 젊은 동물, 45 분 동안 화장실에 부하로부터 망막 (파파인 치료) 및 뇌 조각에서루오-8 AM). <ol><li> 성인 동물 (&gt; 12 주)에 대한 직접 뇌 조각 위에 염료 (50 μL)를 피펫, 그리고 깊은 층에 염료를 더 잘 침투 할 수 있도록 75 분 동안 유지한다. </li><li> 염료 배양 동안 침수 슬라이스의 충분한 산소를 보장하기 위해, ACSF 2.5 mL에 희석 칼슘 염료와 닫힌 뚜껑 (직경 2.5 cm의 원형 항아리, 3.5 cm 높이)와 유리 로딩 챔버를 준비합니다. 95 % O 2 / 5 % CO 2으로 연속적 네이트. 거품하지 마십시오. </li></ol></li><li> 실험 사용할 때까지 16 ° C - 염료로드를 따라 천천히 15 온도를 감소 배양 시스템에 ACSF 및 전송과 조직을 씻는다. </li></ol> 5. 전기 생리 녹음 및 이미지 <ol><li> 현미경 침수 기록 챔버 내에서 조직을 배치하고, (4)의 유량으로 산화 된 ACSF으로 관류 - RT (~ 22 ° C) 또는 생리적 온도에서 5 mL / 분 중 (~ 35 ° C). 홀리신장과 금 또는 백금 와이어의 U 자 모양의 조각을 통해 접착 나일론 골드 스레드로 만든 &#39;하프&#39; &#39;만든 사용자 정의를 사용하여 장소에 D 조직. </li><li> 전기 생리학의 경우 : <ol><li> 5-6 MΩ의 최종 저항을 달성하기 위해 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 1.5 mm (1.19 mm의 ID) 붕규산 유리에서 기록 피펫을 준비합니다. </li><li> 이전 13 설명 된 바와 같이 내부 솔루션의 4 μL와 CCD 카메라를 사용하여 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC)에서 세포를 시각화 - 3 피펫을 입력합니다. 세포 내 용액을주의 깊게 실험 결과를 달성하기 위해 각각의 실험에 맞게 조정되어야한다. </li><li> 위치 피펫 양압을 유지하면서 미세 조작기를 이용하여 세포막에 피펫 홀더 흡입구를 통해서 주어지는. ILM이 망막에서 제거 된 이후, 더 이전에 막 스크래핑 필요가 없습니다. 피펫은 셀되면, 부드러운 음을 적용피펫에 압력이 기가 옴 밀봉을 달성했다. 이어서 부압 짧은 양의 세포막을 파열. </li><li> 해당 표준 기술을 사용하여 전체 셀 전류 또는 전압 클램프 녹음을합니다. </li></ol></li><li> 칼슘 이미징 : <ol><li> 의 Fura-2의 비율 적 이미징, 340 nm 내지 380 nm 인 여기 파장을 제공하는 초고속 파장 스위처를 사용한다. 510 ± 20 ㎚의 방출 필터를 사용하여 각 셀로부터 방출 된 광을 전달하고 고감도, 고속 디지털 카메라로 촬영. </li><li> 550 nm의 대역 통과 필터 - 515 내지 490 nm의 대역 통과 필터 및 출사 광 - FLUO-4, 필터의 여기 광 460 내지 단일 여기 파장. 가장 빠르고 가장 민감한 녹화 등의 고속 디지털 카메라를 사용합니다. 필요에 따라 이미지를 획득. </li><li> 시간의 함수 중 어느 하나의 파장 (FLUO-4) 또는 파장 비율을 이용로 형광의 변화를 측정방법은 (는 Fura-2), 미리 14 8 바와 같이. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Yossi Buskila와 Paul Breen은 급성 신경 조직용 인큐베이션 시스템 구축을 전문으로 하는 회사인 PAYO Scientific Pty Ltd의 공동 소유주임을 선언합니다. 다른 모든 저자는 현재 연구와 관련된 금전적 이해관계나 잠재적인 이해 상충을 보고하지 않습니다.

이 문서함으로써 실험 목표를 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄이고, 이미징 및 전기 생리학 실험에 급성 신경 조직의 생존을 연장하는 배양 방법을 설명합니다. 두 가지 방법은 시간에 신경 조직의 열화 관장 : ⅰ) 증가 박테리아 수준 및 방출 박테리아 독소의 동반 증가 및 외상성 슬라이싱 절차 (10)를 다음과 ⅱ) 흥분 독성. 급성 신경 조직 환경 무방비 바와 같이, 산도, 온도, 박테리아 수준 가까이 모니터링을 통해 조직 환경의 엄격한 조절은 네트워크 무결성뿐만 아니라 세포 활성을 유지하는데 필수적이다. 해부 및 조직 처리 (파파인 소화, 칼슘 염료 로딩) 실험 시간의 감소를 야기 완료를 통해 2 시간이 걸릴 수 있습니다. 그러나, 조직이 손실없이 측정&gt; 24 시간 동안 배양 시스템에서 유지 될 수 있기 때문에 IN 생존 7, 8,이 제제는 결과&gt; 24 시간을 얻기 ...

전기 생리학 및 기능적 영상 (칼슘, 전압 감응 염료) 신경에 가장 일반적으로 사용되는 실험 기술이있다. 뇌 슬라이스 준비하고 여기에 검사됩니다 망막 wholemount은 마취제 나 근육 이완제에서 오염없이 전기 생리 특성과 시냅스 연결을 검사하는 방법을 제공합니다. 뇌 슬라이스와 망막의 특정 회로 뇌 네트워크 (1)의 연구를 허용, 문화 또는 세포 균질 달리 구조적 무결성을 유지 wholemount. 격리 된 조직에서 녹음은 심장 박동 및 호흡과 관련된 운동으로 생체 내 녹음을 통해 이점을 제거해야합니다. 또한, 직접 시각화 대상이되는 세포의 특정 클래스 및 약리 도구 2, 3의 로컬 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 패치 클램프 녹음 및 CALCIUM은 로딩 염료 망막 wholemount에는 망막 신경절 세포 (RGC) 층을 포함하고, 세포에 직접 액세스를 방지 멤브레인 (ILM)를 제한 이너의 존재에 의해 복잡하다. 일반적으로이 멤브레인은 하나의 셀에 기가 옴 씰의 패치 피펫 및 형성의 직접 적용 할 수 있도록 유리 피펫으로 긁어된다. 또한, 목욕 적용 칼슘 염료는 ILM을 통과하지 않고 하나 역행 시신경 5에서 다음 주사를 운반 또는 조직 (6)를 통해 전기 천공,이 멤브레인 (4) 아래에 주입해야합니다. 색소 성 망막염의 설치류 모델을 사용하는 경우 또한,의 RD / RD 마우스는 ILM은 두껍고 더 꿰 뚫을 수있다. 여기서는 패치 클램프 recordi 대한 망막 신경절 세포에 편재 칼슘 염료 로딩 및 직접 액세스를 모두 허용하는 효소 소화 7과 ILM을 제거하는 방법을 사용하여NGS 8. 뇌 조각 또는 망막 wholemount 중 하나에서 성공적인 녹음 해부하고 가능한 신경 조직의 배양에 따라 달라집니다. 통상적으로, 조직을 실험의 아침 추출하고,이 기록을 위해 사용될 때까지 인공 뇌척수액 (ACSF)에서 배양 하였다. 이 시간 창 다음 중요한 저하, 8 시간 - 일반적으로 조직은 6 가능한 남아있다. 그러나, 뇌 조각 wholemount 망막 제제 모두는 일반적으로 짧은 시간주기 내에서 기록 될 수있는 것보다 더 많은 조직을 생성한다. 결과적으로, 조직은 종종 일의 마지막 폐기 및 박리 후속 일 다시 종료된다. 이것은 또 다른 동물 사용 및 설치 및 해부 / 반복 염색 ~ 2 시간을 의미합니다. 다음 프로토콜이 이용되는 소수의 동물을 의미 이상을 24 시간 동안 신경 조직의 수명을 연장하는 방법을 설명하고, 실험적인 시간이 가능하다. 조직의 생존 w전기 생리 특성과 칼슘 역학을 기록을 통해 평가하고, 이러한 속성은 &lt;4 시간과&gt; 24 시간 postdissection 사이의 구별 할 수 있었다있다. 이러한 결과는 장기간 배양 후 하나의 셀 속성은 그대로하고 기능뿐만 아니라 나타냅니다 만, 칼슘 이미징 및 전기 생리 녹음에 의해 평가로 네트워크 활동은, 24&gt; 변경 시간 postdissection입니다. 또한, 우리는 칼슘 염료가 어떤 해로운 영향을주지 않고 장기간 세포에 남아있을 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜의 적용은 외부 환경이 고도로 조절되면 급성 신경 조직에서 신경 세포의 기능 활성이 장기간 유지 될 수 있음을 보여준다. 조직 생존 인해 상이한 배양 프로토콜 실험실간에 크게 변화 더욱이,이 방법은 급성 NEU의 상태에서 변화를 줄이기 위해 적용되어야 이상적인 파라미터 금 표준을 확립RONAL 조직.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-메틸-D-글루카민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마 알드리치</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>소듐 인산염 단일염기</td><td>성 시그마 알드리치</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>M9272&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>파파인 해리 시스템</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 무수</td><td>시그마 알드리치</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>플루로닉 F-127 저자외선 흡광*</td><td>생명 기술</td><td>P-6867</td><td>DMSO&nbsp의 20% 용액;</td></tr><tr><td>후라-2 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>플루오-4 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>진동 블레이드 마이크로톰&nbsp;</td><td>라이카 Biosystem</td><td>VT1200 S</td>, <td>라이카 탑재 s Vibrocheck&trade; 측정 장치&nbsp;</td></tr><tr><td>진동 방지 테이블</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&nbsp;</td><td>비브라플레인 9100/9200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>고정 스테이지 직립 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>현미경 오브렌즈</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 목표</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>고속 파장 스위처</td><td>셔터 기기</td><td>Lambda DG-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>분자 장치</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 시스템</td><td>분자 장치</td><td>Digidata 1440A</td><td>축삭 Digidata&reg; 시스템</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 풀러</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>화염/갈색 형 마이크로 피펫 풀러</td></tr><tr><td>녹음/관류 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ 라이브 셀 이미징 소프트웨어</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

해부 다음 8 시간 - 신경 조직 준비, 뇌 조각 망막 wholemount 급성, 보통 6 유지 될 수있다. 이 실험 시간을 제한 한 연구에 따라 이용되는 동물의 수를 증가시킨다. 이러한 목욕 적용 염료의 장기간의 사전 배양을 필요로 칼슘 이미징이 제한은 특별히 영향 프로토콜을. (3) 내의 박테리아 성장 지수 - 슬라이싱 후 4 시간 단단히 조직 상태의 감소와 관련된다. 본 연구는 성장 인자를 함유하는 항생제, 멸균 방법, 또는 조직 배양 배지 없이도 시간의 장기간 (&gt; 24 h)에 대한 가능한 신경 조직을 유지하기 위하여, 급성 제제 세균의 증식을 제한하는 방법을 설명한다. UV 조사에 의해 세포 외 유체를 순환 15에서 사용자 지정 유지 챔버 내에서 조직을 유지함으로써 - 16 ° C는, 조직은 전기 생리 특성, 또는 칼슘시의 차이를 보여줍니다&gt; 24 시간 postdissection에서 세포 내 칼슘 염료를 통해 gnaling. 이러한 방법은 급성 신경 조직을 사용하는 사람들에 대한 실험 시간을 연장 할뿐만 아니라, 실험 목적을 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄일 것이고, 급성 신경 조직 배양 용 금 표준을 설정한다.

배양 중에 ACSF의 세균 부하 및 온도의 긴밀한 조절은 신경 조직의 생존을 유지하는 것이 필수적이다. 16 ° C (도 1) - 이는 UVC 광 조사 15에서 ACSF의 온도를 유지 통해 최적화 될 수있다. (도 1C APS), 다음 경우 사이의 변동성을 줄일 신경 조직을 배양 할 때 따라서 매개 변수를위한 황금 표준을 제공하고, 환경 조건의 기록 (pH와 온도.)와 실험자를 제공합니다 또한, ACSF 스탬프 매개 변수 실험. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55396/55396fig1.jpg" /> 조직 환경의 엄격한 규제를 활성화 그림 1. 배양 시스템. 냉각 펠티에 판, 주 챔버, 연동 펌프 및 UVC 챔버로 구성 배양 시스템의 A, 개략도. <...

8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저&gt; 24 시간 동안 연장 될 수있다.

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

이 기술의 전반적인 목표는 상당한 조직 분해 없이 신경 조직을 장기간 유지하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 조직 추출 후 24시간이 지난 후에도 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 급성으로 추출된 신경 조직의 생존력을 크게 향상시키고 24시간 이상 생존력을 유지함으로써, 급성 조직 배양의 새로운 표준을 제시할 것입니다.이 기술의 주요 장점은 조직을 활용할 수 있는 실험 시간이 크게 증가한다는 점입니다. 이를 통해 필요한 동물의 수를 줄이고 각 실험에서 얻을 수 있는 데이터의 양을 극대화할 수 있습니다. Braincubator는 조직의 온도를 유지하고 세포외액 내의 세균 증식을 방지하는 자동화 시스템입니다.이는 조직을 위해 엄격하게 제어된 환경을 제공합니다. 이 절차의 시연은 제 연구실의 PhD 학생인 Orsolya Kekesi와 Alba Bellot-Saez가 진행하겠습니다. 뇌 절편 준비를 위해, vibratome을 사용하여 관심 영역이 포함된 300-micrometer 두께의 뇌 절편을 준비하십시오.그런 다음 슬라이스를 carbogen 흐름, pH 수치 및 온도가 조절되는 맞춤형 배양 시스템으로 옮깁니다. 챔버의 초기 온도를 35 °C로 설정하여 15~30분 동안 유지한 후, 15 °C까지 천천히 낮춥니다. 그 후 전기생리학적 기록 또는 이미징 단계 전까지 배양 시스템에서 슬라이스를 배양합니다.망막 전체 마운트 표본 제작을 위해, 안락사시킨 동물의 안구를 즉시 적출합니다. ora serrata를 따라 작게 절개한 후, 안구를 실온의 carbogen이 공급되는 Ames' media 또는 aCSF에 넣습니다. 그 후, 작은 가위로 ora serrata를 따라 절개하여 각막, 수정체 및 유리체를 즉시 제거하고 핀셋으로 이를 걷어냅니다.조직을 상온의 배양 시스템에 넣습니다. 내경계막을 제거하기 위해 망막이 들어 있는 안구 컵을 papain, L-cysteine, EDTA 및 DNase가 포함된 37 °C의 소형 유리 용기에 옮겨 20분 동안 둡니다. 뚜껑을 통해 용액에 carbogen을 공급하되, 기포가 발생하지 않도록 합니다.조직을 Earle's BSS 내의 ovomuccoid 및 BSA 용액에 10분 동안 두어 효소 소화를 중단시킵니다. 그런 다음 aCSF로 조직을 충분히 세척합니다. 이어서 조직을 배양 시스템으로 옮기고 온도를 약 15에서 16 °C로 낮춥니다.그 다음, 망막 조직을 현미경으로 옮깁니다. 아이컵(eye cup)에서 망막을 분리한 후 면도날을 사용하여 네 조각으로 절단합니다. 망막 전체가 필요한 경우에는 망막 주변부에 네 군데의 작은 절개를 가해 망막이 평평하게 펴지도록 합니다.이제 이 조직을 전기생리학적 분석을 위해 현미경으로 옮기거나 Braincubator 내에서 유지할 수 있습니다. 조직은 pH 및 온도 측정을 위한 프로브가 포함된 메인 챔버에서 유지됩니다. 두 번째 챔버는 메인 챔버와 분리되어 있으며, 용액 내에 부유하는 박테리아를 조사하기 위해 1.1 watts UVC 광선에 노출됩니다.연동 펌프를 사용하여 두 챔버에 aCSF를 순환시키고, 펠티어 열전 냉각판을 사용하여 메인 챔버를 냉각하거나 가열합니다. 이 절차에서는, 칼슘 염료를 DMSO에 녹여 1 mM 용액을 만듭니다. 최종 부피가 50 µL가 되도록 혼합물에 1% 플루로닉 산 F-127을 첨가합니다.그 후, 10분 동안 초음파 처리합니다. 뇌 절편의 경우 최종 농도가 10 micromolar, 망막의 경우 20 micromolar가 되도록 2.5 milliliters의 aCSF에 칼슘 염색약을 희석하여 유리 로딩 챔버를 준비합니다. 망막 및 어린 동물의 뇌 절편의 경우, 샘플을 배스(bath)에서 45분 동안 배양합니다.성체 동물의 경우, 25 µL의 염료를 뇌 절편 위에 직접 피펫팅하고, 염료가 심층부까지 더 잘 침투할 수 있도록 75분 동안 유지합니다. 염료 배양 동안 침지된 조직에 충분한 산소가 공급되도록 뚜껑을 통해 carbogen으로 지속적으로 산소화하되, 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오. 염료 로딩 후, 조직을 aCSF로 세척하고 배양 시스템으로 옮깁니다.사용 전까지 온도를 약 15~16°C까지 천천히 낮춥니다. 기록을 위해 조직을 현미경 아래의 침전 기록 챔버에 넣고, 분당 4~5 mL의 유속으로 산소화된 aCSF를 관류합니다. 맞춤 제작된 하프를 사용하여 조직을 고정합니다.다음으로, 마이크로피펫 풀러를 사용하여 최종 저항이 5~6 MΩ이 되도록 기록용 피펫을 준비합니다. 피펫에 내부 용액 3~4 µL를 채운 후, 해당 용액을 얼음에 보관하십시오. 그 다음 IR-DIC 하에서 CCD 카메라를 사용하여 세포를 관찰합니다.마이크로매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 세포막 위에 위치시킵니다. 피펫 홀더의 흡입 포트를 통해 양압을 유지하십시오. 피펫이 세포 위에 놓이면, 피펫에 부드럽게 음압을 가하여 기가옴 씰(gigaohm seal)을 형성합니다.그런 다음 짧은 음압을 가해 세포막을 파열시킵니다. 이어서 전세포 전류 또는 전압 클램프 기록을 시작합니다. Fura-2의 비례 측정 이미징을 위해서는 초고속 파장 전환기를 사용하여 340 nanometers 및 380 nanometers의 들뜸 파장을 제공하십시오.그런 다음 고감도 고속 디지털 카메라와 방출 필터를 통해 방출되는 빛을 포착합니다. Fluo-4의 단일 여기 파장의 경우, 여기광은 460~490nm 밴드패스 필터로, 방출광은 515~550nm 밴드패스 필터로 필터링합니다. 소화 후에는 DIC 조명 하에서 망막 신경절 세포와 변위 아마크린 세포를 명확하게 시각화할 수 있으며, 내경계막을 사전에 긁어낼 필요 없이 패치 클램프 기록 대상으로 지정할 수 있습니다.망막 신경절 세포의 대표적인 전류 클램프 기록이 여기에 제시되어 있습니다. 패치 피펫을 통한 세포의 탈분극은 용량 의존적인 활동 전위 생성을 유도하였으며, 이는 파파인 처리 후에도 세포의 생존 능력이 유지되었음을 나타냅니다. 내경계막의 제거를 통해 Fura-2 AM을 이용한 신경절 세포층의 전반적인 염색이 가능했습니다. 또한, 30 mM 염화칼륨 적용 시 F0 대비 342 nm 및 380 nm 비율의 증가로 확인된 바와 같이 세포 내 칼슘 농도가 크게 증가하며 반응하였습니다. 염화칼륨 적용 후, 칼슘 수치는 자극 이후 다시 기저선으로 돌아왔습니다.그리고 이후에 세포를 자극하여 유사한 진폭의 반응을 유도할 수 있었습니다. 또한, 이러한 반응은 박리 후 4시간 미만에서 기록한 망막과 24시간 이상에서 기록한 망막 사이에 차이가 없었습니다. 이 절차를 수행할 때, 급성 신경 조직은 환경적 방어 능력이 없다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.따라서 pH, 온도 및 박테리아 수치를 면밀히 모니터링하여 aCSF를 엄격하게 조절하는 것이 세포 활성과 네트워크 무결성을 유지하는 데 필수적입니다. 이 절차는 무균 기술이나 생리적 상태에 영향을 줄 수 있는 성장 인자 또는 항생제가 포함된 배양 배지를 사용할 필요 없이 24시간 이상 신경 조직을 유지하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 이 방법이 조직 생존력을 극대화하기 위한 이상적인 파라미터의 표준이 되기를 바랍니다.이는 조직 자체의 건강 상태에 따른 가변성을 줄여 결과적으로 실험적 가변성을 감소시킵니다. 파파인 프로토콜을 사용하여 망막의 내경계막을 소화시키면 칼슘 염색약을 이용한 보편적인 염색이 가능해집니다. 이 프로토콜은 신경절 세포층 뉴런으로부터 다지점 세포 내 기록을 얻는 데에도 사용할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 영상 촬영 및 전기생리학 실험을 위해 24시간 이상 조직의 생존력을 유지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 자외선을 사용하는 작업은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 보호 안경과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을...

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

이 비디오는 망막의 신경 조직을 장기간 배양하는 방법을 보여줍니다. 망막을 함유한 안구컵은 생쥐의 눈에서 얻습니다. ILM(inner limiting membrane)을 효소로 소화하여 망막의 신경 세포를 노출시키고, 처리된 아이컵 또는 분리된 망막을 특수 인큐베이터로 옮겨 저온에서 장기간 배양합니다.

망막의 신경 조직의 장기간 배양을 위한 기술

이 비디오는 뇌 해마 절편에서 전체 세포 패치 클램프 기록 및 이광자 칼슘 이미징을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 급성 뇌 절편에서 다양한 뉴런 유형의 수상돌기에서 국소 Ca2+ 과도 현상(CaT)의 역학을 연구할 수 있습니다.

뇌 절편의 이광자 칼슘 이미징을 위한 전체 세포 구성 확립

이 비디오는 칼슘 이미징 및 전기 생리학적 기록을 사용하여 마우스 뇌 절편에서 신경 활동을 측정하는 기술을 보여줍니다. 이 방법은 조직에 칼륨 이온을 관류하고 고속 디지털 이미징을 통해 세포 내 칼슘 변화를 기록함으로써 실시간 신경 반응을 보여줍니다.

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

학습하세요 급성 신경 조직의 장기간 배양 기법으로 24시간 이상 조직 활성을 유지하는 방법을. 전기 생리학 및 칼슘 이미징 실험에 활용하여 동물 사용을 줄이고 데이터 품질을 향상시킵니다.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

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