면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

이 실험의 전반적인 목표는 전자 현미경 관찰을 위해 비영장류 뇌 조직의 신뢰할 수 있는 매립 전 면역염색(pre-embedding immunostaining) 결과를 얻는 것입니다. 이 방법은 특정 뇌 구조 내에서 주어진 신경 지배의 시냅스 발생률과 같은 신경해부학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전자 현미경에 적합한 특정 신경 지배를 표지할 수 있는 쉽고 저렴한 방법이라는 점입니다.

먼저 관심 영역이 포함된 아크롤레인 고정 비인간 영장류 뇌의 50 micron 두께 절편을 PBS가 담긴 12웰 플레이트로 옮깁니다. 부유 절편을 실온에서 5분 동안 PBS로 세 번 세척한 다음, 갓 제조한 붕소수소화나트륨 용액에서 실온으로 30분 동안 배양합니다. 덮개 없이 부드럽게 흔들어 줍니다.

30분이 경과하면, 수소화붕소나트륨을 흡입하여 제거하고 각 웰에 PBS를 첨가합니다. 플레이트를 로커에 올려놓고 10분 동안 강하게 흔들어 줍니다. 반응 가스가 더 이상 남지 않을 때까지 이 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.

2% normal serum과 0.5% cold fish gelatin을 PBS에 희석한 용액에서 실온으로 1시간 동안 부드럽게 흔들어주며 절편을 블로킹합니다. 배양 시간이 지나면, 1차 항체 용액에서 실온으로 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어주며 절편을 배양합니다. 다음 날, 이전과 동일하게 절편을 세척한 후, 2차 항체 용액에서 실온으로 1시간 30분 동안 부드럽게 흔들어주며 절편을 배양합니다.

이전과 동일하게 절편을 세척한 후, avidin-biotin-peroxidase 또는 ABC 용액에서 1시간 동안 rocking하며 반응시킨다. 다음으로 TBS에 희석한 0.005% hydrogen peroxide와 0.05% 3, 3'Diaminobenzidine 신선한 용액을 준비한다. 세척 후, DAB 용액에서 3~7분 동안 부드럽게 rocking하며 절편을 반응시킨다.

갈색 침전물이 원하는 색상으로 나타나면, 차가운 TBS로 빠르게 2회 세척하여 반응을 중지시킨 후, 정해진 시간 동안 TBS와 PB로 연속 세척합니다. DAB 염색된 절편이 포함된 플레이트를 환기 후드로 옮깁니다. PB가 채워진 6-웰 플레이트로 절편을 옮기고, 플레이트에서 PB를 조심스럽게 피펫으로 제거하여 절편을 완전히 펴줍니다. 그 다음, 펴진 절편이 흐트러지지 않도록 오스뮴 사산화물 용액을 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다.

섹션이 빛에 노출되지 않도록 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 상온에서 30분 동안 교반 없이 배양합니다. 삼투 고정(osmification)이 진행되는 동안, 에폭시 수지 혼합물의 각 성분을 적절한 양으로 대형 플라스틱 컵에 넣어 내수성 에폭시 수지를 준비합니다. 균일한 갈색이 될 때까지 나무 막대나 플라스틱 피펫으로 저어준 후, 처리할 섹션 수에 맞는 크기의 알루미늄 컵에 동일한 양의 수지를 나누어 담고 그대로 둡니다.

삼투고정 기간이 끝나면, 저속 ロッキング(rocking) 상태에서 PB로 10분 동안 세 번 세척합니다. 세척 후, 다음과 같은 단계별 농도의 에탄올 시리즈에서 각각 2분씩 처리하여 절편을 탈수합니다. 다음으로, 프로필렌 옥사이드가 채워진 유리 바이알로 절편을 옮기고, 프로필렌 옥사이드에서 2분씩 세 번 처리하여 탈수 과정을 완료합니다.

그런 다음 절편들을 공기와의 접촉을 최대한 피하며 하나씩 조심스럽게 알루미늄 컵으로 옮깁니다. 미리 혼합해 둔 발수성 에폭시 수지로 절편을 평평하게 임베딩하고, 환기 후드 아래 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 유리 슬라이드와 플라스틱 커버 슬립에 미네랄 오일을 바른 후, 알루미늄 컵을 60 °C에서 최대 12~15분 동안 배양하여 수지를 부드럽게 만듭니다.

그리스가 도포된 유리 슬라이드 위에 절편들을 조심스럽게 펴줍니다. 그리스가 도포된 커버슬립을 덮고 남은 기포를 조심스럽게 밀어내어 제거합니다. 슬라이드를 60 °C에서 48시간 동안 배양합니다.

48시간 후, 플라스틱 커버 슬립을 제거하여 절편이 수지에 둘러싸인 상태로 둡니다. 먼저 쌍안경을 사용하여 관심 영역을 찾은 다음, 메스를 사용하여 약 1mm² 크기의 작은 사각형 조직 조각을 절단합니다. 다음으로, 수지 블록의 끝부분을 갈아낸 후 그 위에 사각형 조직 조각을 접착합니다.

건조 후, 레진 블록을 울트라마이크로톰 데크의 수직 위치에 놓고 날카로운 면도날을 사용하여 레진 블록의 각 측면을 점진적으로 절단하여 측면이 매끄러운 사다리꼴 모양으로 만듭니다. 다음으로, 데크를 수평 위치로 놓고 사다리꼴의 가장 긴 면이 아래를 향할 때까지 블록을 회전시킵니다. 다이아몬드 트리밍 툴 또는 유리 칼을 전용 공간에 배치합니다.

울트라 마이크로톰을 1mm/s의 속도로 300µm 두께의 절편을 자르도록 설정하십시오. 칼날이 사각 블록과 수직으로 평행하게 맞추고 수평 각도를 약 1도 정도로 매우 작게 조정한 후, 조직이 나타나기 시작할 때까지 사각 블록의 표면을 다듬으십시오. 이제 증류수가 채워진 보트가 장착된 45도 다이아몬드 나이프로 교체하여 80µm 두께의 절편을 자르십시오.

자일렌을 적신 흡수지를 사용하여 수면에 닿지 않게끔 섹션들을 매끄럽게 다듬고, 150 mesh 구리 그리드에 연속 섹션들을 수집합니다. 그리드를 그리드 보관함에 넣은 후, 납 시트레이트(lead citrate) 스톡 용액과 증류수를 1:1 비율로 혼합한 용액을 준비하여 0.2 micron 시린지 필터로 여과합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 바이알을 알루미늄 호일로 감쌉니다.

희석된 시트르산 납 용액 한 방울 위에 각 그리드를 올리고, 용액과 접촉하는 면이 절편이 되도록 합니다. 그다음 소형 핀셋으로 그리드를 잡고 증류수가 담긴 비커 두 개에서 충분히 세척합니다. 흡수지로 과잉 수분을 조심스럽게 제거한 후 그리드 박스에 보관합니다. 30분 후 투과 전자 현미경으로 절편을 관찰할 수 있습니다.

이 다람쥐원숭이 내측 담창구(internal globus pallidus)의 전자현미경 사진은 immunoperoxidase diaminobenzidine 기법을 이용한 acrolein-PFA 경심장 관류 후 잘 보존된 조직을 보여줍니다. 사진에서 볼 수 있듯이, 이 절차를 통해 화살표로 표시된 거대 축삭의 수초(myelin sheath)를 관찰할 수 있습니다. 외측 담창구(external globus pallidus)의 이 전자현미경 사진에서는 문자 d로 표시된 수지상 돌기 단면, a로 표시된 작은 무수초 축삭, 그리고 av로 표시된 축삭 정맥류(axon varicosities)를 쉽게 식별할 수 있음을 보여줍니다.

화살표는 축삭 정맥팽대(axon varicosity)가 수지상 돌기 단면과 대칭적 시냅스 접촉을 형성하는 예를 보여줍니다. 면역 표지된 요소들은 전자 밀도가 높은 DAB 침전물로 채워진 세포질 또는 축삭질을 통해 쉽게 식별할 수 있습니다. 여기에서 GPi의 choline acetyltransferase로 면역 염색된 수지상 돌기가 표지되지 않은 축삭 정맥팽대로부터 시냅스 접촉을 받고 있습니다.

이 전자현미경 사진은 수초집이 비교적 온전하며 축삭형질이 tyrosine hydroxylase에 대해 면역표지된 GPe의 수초화된 축삭을 보여줍니다. 이 예시는 serotonin transporter에 대해 면역표지되어 가지돌기와 대칭적 시냅스 접촉을 형성하고 있는 GPi의 축삭 정맥류를 보여줍니다. 이 예에서 DAB 침전물은 세포막과 소기관의 외표면을 따라 형성되어 있습니다.

여기에 표시된 축삭 정맥(axon varicosity)은 GPe에서 관찰되었으며, tyrosine hydroxylase에 대해 면역 염색되었습니다. 이는 DAB 침전물이 축삭질(axoplasm)을 완전히 채운 사례로, 시냅스 소포가 보이지만 경계를 구분하기는 더 어렵습니다. 이 절차 이후에는 단백질이나 수용체의 시냅스 수준에서의 공존(colocalization)과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 매립 전 이중 면역 조직 화학 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 비영장류 뇌 조직의 매립 전 면역조직화학법 준비 과정, 에폭시 수지 매립 절차, 그리고 전자 현미경 관찰에 적합하도록 관심 영역을 80 µm 두께의 절편으로 초미세 절단하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.