사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

이 Live-cell imaging 기술의 전반적인 목표는 고정할 필요 없이 Chemotherapeutic Agent의 흡수 및 분포와 같은 세포 과정을 추적하는 것입니다. 이러한 방법은 다음과 같은 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.자유 형태 또는 나노 입자로 캡슐화된 화학요법제는 종양 세포에 의해 어떻게 흡수되는지. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포를 이미징하여 고정 아티팩트를 방지하고 실시간 동적 평가가 가능하다는 것입니다.

우리는 약물 전달에 대한 잘못된 해석으로 이어진 고정 중에 나노 입자가 분해되는 것을 관찰했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 이미징 챔버를 조립하려면 챔버 하단 부분에 25mm 커버 유리를 놓고 상단 부분을 하단 부분에 나사로 고정합니다. 유리가 깨질 수 있으므로 너무 세게 조이지 마십시오.

챔버 전체를 오토클레이브합니다. 세포를 플레이트링하려면 Laminar Flow Cabinet의 멸균 백에서 이미징 챔버를 제거합니다. 챔버를 조심스럽게 조이고 페트리 접시에 넣습니다.

이미징 챔버의 유리를 1밀리리터의 0.1% 멸균 젤라틴과 섭씨 37도에서 20분 동안 5%의 이산화탄소로 코팅합니다. 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거한 후 1x PBS로 세포를 한 번 세척하고 0.25% 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다. 세포 배양 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.

그런 다음 세포를 모아 5분 동안 1, 100G의 속도로 스핀다운합니다. 펠릿을 5ml의 세포 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 계수한 후 젤라틴을 흡인하고 24시간 이내에 최대 70%의 적용 범위를 허용하는 희석액으로 세포를 플레이트에 넣습니다.

세포가 5% 이산화탄소와 섭씨 37도에서 24시간 동안 부착되도록 합니다. 현미경으로 세포의 포화도, 세포 형태 및 오염을 평가합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경, 형광등 및 컴퓨터를 켭니다.

렌즈 히터를 대물렌즈에 연결하고 35도로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 배양 장치를 준비합니다. 인큐베이션 유닛을 현미경 스테이지에 놓고 유입 및 유출 이산화탄소 튜브를 연결합니다.

메인 이산화탄소 밸브를 열고 이산화탄소 컨트롤러를 켭니다. 컨트롤러가 이산화탄소 5%로 설정되어 있는지 확인합니다. 온도, CO2, pH, 습도 및 무균 상태와 같은 적절한 세포 배양 조건은 장기 세포 이미징에 매우 중요합니다.

따라서 각 인큐베이터에 대해 적절하게 테스트해야 합니다. 무대 온도를 섭씨 37도로 설정하세요. 배양 장치가 선택한 온도와 이산화탄소 퍼센트에 도달하도록 합니다.tage.

메인 이산화탄소 인큐베이터에서 이미징 챔버를 가져와 페트리 접시에 담아 챔버를 현미경 검사실로 운반합니다. 이미징 챔버를 맞춤 제작된 35mm 직경의 스테이지 홀더에 놓고 맞춤형 밀봉 덮개로 챔버를 닫습니다. 배양 장치를 열고 세포의 냉각을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 작업하십시오. 빨간색 패치를 이미징 챔버로 교체한 다음 장치를 닫습니다.

스테이지와 현미경 사이에 케이블이 끼어 있지 않은지 확인하십시오. 30분 동안 장치를 순응하도록 두십시오. 그런 다음 소프트웨어를 열고 레이저를 켭니다.

파일 탭에서 새로 만들기"를 클릭하여 새 데이터베이스를 만듭니다. 데이터베이스 이름을 지정하고 저장합니다. Acquire 탭에서 Config"를 클릭하여 컨피그레이션을 설정합니다.

채널 모드"와 단일 트랙"을 선택하여 단일 형광단을 평가합니다. 여러 형광단에 대해 Multi Track"을 선택합니다. 그런 다음 형광단과 일치하는 적절한 띠 과거 필터를 선택합니다.

트랙 중 하나에서 명시야 채널을 선택합니다. 스캐닝은 화합물의 형광 신호와 이미지 품질 사이에서 손상됩니다. 과다 노출, 광표백, 신호 대 잡음비, 세포의 품질, 첨가된 화합물은 모두 결과에 영향을 미칠 수 있는 요인이며 적절한 테스트가 필요합니다.

Acquire 탭에서 Scan"을 클릭하여 스캔 컨트롤을 설정합니다. 그런 다음 모드"를 클릭하여 프레임 크기, 스캔 속도, 스캔 방향 및 스캔 평균을 설정합니다. "채널을 클릭하여" 핀홀, 게인 및 오프셋, 레이저 출력을 설정합니다.

구성 탭에서 "구성"을 클릭하여 이러한 설정을 저장하고 구성 데이터베이스에 저장합니다. 매크로 탭에서 Muti TimeX"를 클릭하여 타임랩스를 설정합니다. 단일 위치를 클릭합니다.

Single Track(단일 트랙)"을 클릭하여 저장된 구성을 적용하고 Configuration 데이터베이스에서 필요한 구성으로 스크롤합니다. 시간 간격과 스캔 횟수를 설정합니다. Load Conf를 클릭하여 구성을 로드합니다.

기본 파일 이름에서 타임랩스의 이름을 지정하고 "이미지 데이터베이스 데이터베이스"를 클릭하여 타임랩스를 저장합니다. 클릭하여 임시 폴더 설정임시 이미지 폴더"그런 다음 인큐베이팅 유닛을 열고 이미징 링을 들어 올리고 이머젼 오일 한 방울을 대물렌즈에 추가하고 가능한 한 빨리 장치를 닫습니다. 초점을 맞추고 이미징 챔버에서 위치를 선택합니다.

Laminar Flow Cabinet에서 세포 배양 배지에서 밀리리터 약물당 5마이크로그램 또는 0.05마이크로몰의 지질 농도로 유리 약물 또는 나노 입자를 희석합니다. 약물 또는 나노 입자가 멸균되지 않은 경우 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 필터링합니다. 인큐베이팅 챔버를 열고 천장 뚜껑을 들어 올립니다.

그런 다음 세포에서 배지를 제거하고 1ml의 희석된 약물 또는 나노 입자를 첨가한 다음 가능한 한 빨리 장치를 닫습니다. 셀에 초점을 맞추고 Scan Control 탭에서 Single"을 클릭하여 빠르게 스캔합니다. 명시야 이미지에 초점이 맞춰진 세포가 표시되면 Multi TimeX 매크로에서 "시작 시간"을 클릭하여 타임랩스를 시작합니다.

반복 횟수와 남은 시간은 매크로와 이미지에 표시됩니다. 셀에 여전히 초점이 맞춰져 있는지 정기적으로 확인하거나 자동 초점을 사용하십시오. 이 프로그램은 타임랩스를 데이터베이스에 자동으로 저장합니다.

프로그램이 실행되는 동안에는 데이터베이스를 닫지 마십시오. 이것은 자유 독소루비신에 노출된 세포의 3시간 타임랩스입니다. 적색 형광 독소루비신(Doxorubicin)의 흡수와 핵으로의 즉각적인 전좌를 관찰합니다.

여기에서 세포는 캡슐화된 독소루비신으로 3시간 동안 배양됩니다. 형광 신호는 훨씬 낮고 세포질에 있습니다. 신호는 핵에서 거의 보이지 않습니다.

이러한 타임랩스 동영상을 이미지 J로 전송하면 핵 주위에 관심 영역을 그릴 수 있고 픽셀 밀도를 측정할 수 있습니다. 여기에 제시된 그래프는 자유 또는 캡슐화된 독소루비신으로 배양된 세포에서 시간 경과에 따른 핵 흡수의 차이를 보여줍니다. 여기에 표시된 것은 캡슐화된 독소루비신(Doxorubicin)으로 배양된 세포(빨간색으로 표시)입니다.

보라색 신호는 보인자를 나타내며 리소좀은 녹색 Live Cell 마커로 염색됩니다. 두 세포 유형을 비교하면 리소좀 분포의 차이를 볼 수 있습니다. B16BL6 세포의 리소좀은 세포질 전체에 분포합니다.

반면, BLM 세포의 리소좀은 핵 가까이에 위치합니다. 그러나 두 세포주 모두 리소좀에서 적색과 보라색 신호의 높은 공동 국소화를 보여 독소루비신과 그 운반체가 이러한 소기관에 갇혀 있음을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 몇 시간 또는 며칠 동안 Living Cells에서 화학요법제(Chemotherapeutic Agents) 및 기타 형광 마커의 흡수를 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.