Name: 사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 배우세요 살아있는 세포 이미징 기술을 활용하여 항암제의 실시간 흡수와 분포를 관찰하는 방법을. 고정 과정 없이 나노입자 기반 약물 전달 메커니즘을 정확하게 분석할 수 있습니다.

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사용 하는 현미경 시설 에라스무스 광학 이미징 센터의 일부 이며, 우리는 그들의 서비스에 대 한 OIC의 직원을 감사 하 고 싶습니다.

1. 준비 <ol><li>이미징 챔버, 두 부분으로 구성 된 조립.
	<ol><li>챔버 ( 그림 1A-2)의 하단 부분에 25 m m 커버 유리 ( 그림 1A-1)를 배치 하 고 하단 부분 ( 그림 1A-3)에 상단 부분을 나사. 마십시오 하지 조여 너무 열심히, 유리를 깰 수로. 압력솥 전체 챔버 ( 그림 1A-4).</li>
	</ol></li> <li>Dulbecco를 보완 하 여 세포 배양 매체를 준비 &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 (DMEM) 페 놀 레드 10% 태아 종 아리 열 비활성화 혈 청 (FCS)와 무 균 조건 하에서 1 m m L-글루타민 없이. 4 ° C에서 37 ° c 사용 하기 전에 따뜻한 게.</li>
	<li>유지 표준 세포 배양 기술을 사용 하 여 플라스 크 배양에서 세포 배양 매체와 셀. 
	참고: 여기, 두 개의 마우스 셀 라인, 흑색 B16BL6 11와 루이스 폐 암 (LLC는), 그리고 2 개의 인간 정면을, BLM와 1F6 12, 사용 되었다.</li>
	<li>무게 및 젤라틴 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° C에 용 해 하 여 만들어 0.1% 젤라틴 하룻밤. 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 여 솔루션을 소독을 4 ° c.</li>
</ol> 2. 세포를 플레이트 <ol><li>이미징 약 실에서에서 제거 층 류 캐비닛에 살 균 가방, 신중 하 게 챔버, 강화 하 고 페 트리 접시에. 
	참고: 오염을 방지 하려면 이미징 챔버 페 트리 접시에까지 계속 현미경 챔버를 둘 수 있다.</li>
	<li>코트 37 ° C, 5% CO 2 시 20 분에 대 한 0.1% 살 균 젤라틴의 1 mL와 이미징 챔버의 유리. 
	참고: 이것은 더 나은 셀 첨부 파일 수.</li>
	<li>(단계 1.2 및 1.3 참조) 셀 문화 플라스 크에서 매체를 제거, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리. 세포 배양 매체를 추가 하 여는 트립 신을 비활성화, 세포를 수집, 5 분, 1100 x g에서 스핀 다운 및 세포 배양 매체의 5 ml에서는 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>20 세포 현 탁 액의 희석 20 µ L µ L trypan 블루 (이 죽은 세포에 의해 채택 될 것 이다)의. Hemocytometer;를 사용 하 여 생활 하 고 죽은 세포의 수를 계산 죽은 세포의 수 10%를 넘지 말아야 한다.</li>
	<li>는 젤라틴을 발음 하 고 24 시간 이내 70%의 최대 허용 희석에서 셀 접시. 예를 들어 5 x 10 4 또는 10 x 10 4 셀 1 mL에 희석을 사용 합니다. 5% CO 2와 24 h. 위해 37 ° C에서 준수를 셀 수 있도록</li>
</ol> 3. 시간 경과 현미경 ( 그림 2) 참고: 여기, 주문 품 단계 홀더 confocal 현미경, 대부분 제조 라이브 셀 이미징에 대 한 incubators의 범위를 제공 하지만 사용 되었다 또한 조사 nanoparticulated 약물 전달에 적합.
<ol><li>Confluency, 세포 형태학 및 오염에 대 한 현미경으로 세포를 평가. CO 2 배양 기에 다시 챔버를 놓습니다. 
	참고:는 confluency 70%를 초과 하지 않아야 합니다. 세포 형태는 일치 하지 않습니다 (즉, 셀 고착 하지 않는다) 또는 오염 감지, 이미징 챔버 삭제.</li>
	<li>전환에 confocal 현미경 ( 그림 1E-1), 형광등 ( 그림 1E-2), 컴퓨터 ( 그림 1E-3).</li>
	<li>목적 렌즈 히터를 연결 하 고 설정 35 ° C (-4 그림 1E + 삽입).</li>
	<li> 그림 1B와 같이 외피 단위 준비. 
	참고:이의 단위 구성 됩니다 ( 그림 1B-1)가 열된 단계 흐름 단계 CO 2 튜브 ( 그림 1B-2)에 대 한 커넥터와 CO 2 프로브 ( 그림 1B -3), 및 빨간 닫는 패치 ( 그림 1B-4). 이 패치 이미징 챔버에 배치 됩니다 때까지 단위를 일시적으로 종료 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>는 현미경 스테이지에 외피 단위 놓고에-및 아웃-flow CO 2 튜브 ( 그림 1E-5)를 연결 합니다. 주요 공동 2 밸브 ( 그림 1E-6) 열고 CO 2 컨트롤러 ( 그림 1E-7)에 전환. 컨트롤러는 5% CO 2로 설정 되어 있는지 확인. 
	참고: 습도, CO 2는 가습기 ( 그림 1E-8)를 통해 전달합니다. 저 산소 증 실험은 별도 O 2 레 귤 레이 터 ( 그림 1E-9)는 설치 프로그램에 포함 되어.</li>
	<li>설정 단계 온도 37 ° C ( 그림 1E-10). 고 열 실험 설정 온도 42 ° C. 허용 선택한 온도 CO 2 비율 도달 외피 단위.</li>
	<li>주요 공동에서 이미징 챔버 2 인큐베이터 고 전송 현미경 검사 법을 페 트리 접시에 챔버.</li>
	<li>이미징 챔버 ( 그림 1A-4)에 주문 품, 35 m m 직경 홀더 ( 그림 1A-5) 무대와 주문 품 씰링 뚜껑 챔버를 닫습니다 ( 그림 1A-6). 
	참고: 뚜껑 CO 2 통과 허용 하 고 증발 및 오염 방지.
	<ol><li>외피 단위를 열고, 이미징 챔버와 붉은 패치를 대체 하 고 단위 ( 그림 1C)을 닫습니다. 이렇게 셀의 냉각을 방지 하기 위해 가능한 한 빨리. 케이블 사이 단계 및 현미경 붙어있는 다는 것을 확인.</li>
	</ol></li> <li>30 분에 대 한 순응을 두고</li>
	<li>소프트웨어 열고 레이저 스위치. 
	참고: 여기, 488 nm 아르곤, 543 nm 헬륨-네온와 633 nm 헬륨-네온 레이저 사용.</li>
	<li>클릭 하 여 새 데이터베이스를 만드는 &#34; 새로운 &#34; 파일 탭 이름 아래와 데이터베이스 저장.</li>
	<li>설정 구성을 클릭 하 여 &#34; 구성 &#34; 취득 탭 선택에서 &#34; 채널 모드 &#34; 및 &#34; 단일 트랙 &#34; 단일 fluorophore 평가 하 또는 &#34; 멀티 트랙 &#34; 여러 fluorophores에 대 한. 적절 한 대역 통과 필터 (dox와 Dox NP에 대 한 예를 들어, 560 615 nm 대역 통과 필터, 참조에 대 한 더 많은 예 대표 결과) fluorophore 일치를 선택 합니다. 트랙 중 하나에 밝은 필드 채널을 선택 합니다.</li>
	<li>클릭 하 여 스캔 컨트롤 설정 &#34; 스캔 &#34; 취득 탭 설정 프레임 크기 (1024 x 1024), 스캔 속도 (최적의), 아래 스캔 방향 (8 비트, 단일), 및 평균 (4)를 클릭 하 여 스캔 &#34; 모드. &#34; 홀 (200 µ m)를 설정 하며, (오프셋 예를 들어, 580, 700, 및 835; 그림 3 참조), 레이저 출력 및 (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%)를 클릭 하 여 &#34; 채널. &#34;</li> <li>클릭 하 여 이러한 설정을 저장 &#34; 구성 &#34; 탭에서 구성 하 고 구성 데이터베이스에 저장.</li>
	<li>클릭 하 여 시간 경과 설정 &#34; 멀티 시간 X &#34; ( 그림 1D) 매크로 탭 클릭에에서 &#34; 위치를 단일 &#34;.</li>
	<li>초점, 셀을 계속 클릭 하 여 매크로에서 자동된 초점을 선택 &#34; 자동 초점. &#34; 
	참고: 자동 초점 유리의 반사를 사용 하 여 기준점으로 633 nm 레이저와 함께 이루어집니다.</li>
	<li>클릭 하 여 저장 된 구성을 적용 &#34; 단일 트랙 &#34; 또는 &#34; 멀티 트랙 &#34; 스크롤 시간 간격 (예를 들어, 15 분), 검사 (예: 97)의 수를 설정 하는 구성 데이터베이스에는 필요한 구성 및 클릭 하면 &#34; 부하 구성. &#34; 참고: 이러한 설정을 사용 하 여, 97 x 15 분 = 24 h의 시간 시리즈 이루어집니다.</li>
	<li>이름에 시간 경과 &#34; 기본 파일 이름 &#34; (단계 3.11에서에서 만든) 데이터베이스를 클릭 하 여 선택 하 고 &#34; 이미지 데이터 베이스 &#34;는 시간 경과 하기. 클릭 하 여 임시 폴더를 설정 &#34; Tmp 이미지 폴더. &#34; 참고: 이미지가이 폴더에 있는 경우 시스템 중지 또는 어떠한 이유로 든 충돌,.</li>
	<li>Incubating 장치를 엽니다, 그리고 이미징 반지를 들어, 목적, 침수 기름 방울을 추가 하 고 단위를 가능한 한 빨리 닫습니다. 집중 하 고 이미징 약 실에 있는 위치를 선택 합니다. 
	참고:이 위치 포함 최소 70 %confluency, 개별 셀의 이미징에 대 한 허용의 단층에 셀.</li>
	<li>배경에 대 한 구성 설정을 확인 하 고 필요한 경우 수정. 
	참고: 배경 이득 또는 레이저 전력 줄여 수정 될 수 있습니다. 구성에서 변경 (단계 3.17 참조) 저장 하 고 로드 (단계 3.18 참조) 다시 매크로에서.</li>
	<li>층 류 캐비닛, 희석 무료 마약 또는 5 µ g/mL 약물의 농도 또는 세포 배양에서 지질 0.05 µmol 나노 입자. 마약/나노 살 균 하지 않은 경우 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>Incubating 챔버 씰링 뚜껑 리프트, 세포에서 매체를 제거, 희석된 마약/나노 입자의 1 개 mL를 추가 단위를 가능한 한 빨리 닫습니다.</li>
	<li>클릭 하 여 셀에 시작 시간 경과 집중 &#34; 시작 시간 &#34; 멀티 시간 X 매크로에서.</li>
	<li>셀 초점에 아직도 있는지 확인 하기 위해 정기적으로 확인 하거나 자동 초점 (3.16 단계 참조)를 사용 합니다. 프로그램은 데이터베이스;에 시간 경과 저장 자동으로 프로그램이 실행 되는 동안 데이터베이스는 닫지 마십시오.</li>
</ol> 4. 데이터 분석 <ol><li>원래 연구 질문에 따라 데이터 분석을 위한 ImageJ 같은 소프트웨어 프로그램을 사용 (예를 들어 결과 섹션을 참조).</li></ol>

<ol><li>Duggan, S. T., Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+liposomal+doxorubicin%3A+a+review+of+its+use+in+metastatic+breast+cancer%2C+ovarian+cancer%2C+multiple+myeloma+and+AIDS-related+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma.</a> Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).</li>
<li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).</li>
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<li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+%28Doxil%29+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).</li>
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<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hyperthermia+triggered+doxorubicin+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+improves+intratumoral+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

과거에 관측 된 고정 거의 즉시 자주 nanocarriers를 파괴할 수 있다 고 DXR 발표 양식 이러한 파괴 리는 여전히 핵, 입력 시간 했다 매우 어렵고 심지어 잘못 된 데이터의 해석 만들기. 일부 미세한 조정, 살아있는 세포 및 조직 화학요법 운명 수 정기적으로 조사 확인 또는 조직학 관측 전복. 최근 종이 자유롭고 캡슐화 된 dox 라이브 셀 시간 경과 영상9를 사용 하 여 치료 하는 셀에 통풍 관, 릴리스 및 DXR의 지역화를 보여주었다. 이 작품에서는 좀 더 자세하게에서 실험적인 체제를 설명합니다. 이 모델을 사용 하 여, 그것은 핵에 dox의 즉각적인 교통을 시각화 수 그것은 지속적으로 셀 결국 죽을 때까지 축적. 대조적으로, Dox NP를 사용 하면 적은 양의 나온된 dox 핵에서 발견 된다. 지속적인 노출 결과 연속 DXR 형성, 형광 신호 이지만 Dox에 훨씬 낮은-NP-dox 처리 세포 대 세포 농도 후속 세포 독성에 차이 나타내는. 또한, 라이브 셀 표식을 사용 하 여 그것, Dox NP에는 셀을 노출할 때 DXR 및는 nanocarrier에에서 있는 리소좀 표시 했다. 이 완전 한 liposome 셀에 의해 채택 되 고 이러한 나노 입자의 통풍 관 동안 endocytic 통로의 참여 보여줍니다 나타냅니다. 핵에서 DXR 나온된 dox에서 명확 하 게 이다. 그러나, DXR와 캐리어 공동 지역화와 리소좀에 갇힌 것이 방법을 사용 하 여, 아니에요 아직 결정적인이 캡슐화 여부 dox를 발표. 나노 입자의 본질적인 안정성 dox 릴리스는 리소좀에 지역화 방지 가능 하다.
이 프로토콜에서 라이브 셀 이미징 맞춤 단계 홀더 (사양 요청에 주어질 수 있다)를 가진 특정 현미경 설치를 사용 하 여 증명 됩니다. 그러나, 가장 confocal 현미경 제조 수행 라이브 셀 이미징 하는 인큐베이터의 범위를 제공 합니다. 세포 배양 조건 (즉, 온도, CO2, pH, 습도, 및 불 임)을 보존은이 산부인과의 주요 기준 이며 적절 한 상태를 확인 하기 위해 몇 가지 예비 테스트는 추가 설명입니다. 자동화 된 데이터 수집 프로그램은 또한 동일한 제조 업체에 의해 전달할 수 있습니다. "멀티 위치" 옵션 통계 분석 정제 동일한 약 실에서 여러 위치에 이미지를 가능 하 게. 그러나,이 원고에 언급 된 매크로에서이 옵션 고정된 XYZ 위치, Z-드리프트에 대 한 수정 가능성 있는 손실 됩니다 필요 합니다. 이 매크로에 분석에 대 한 초점 비행기 사용 Z-차원 검사를 포함할 수 있습니다. 그러나,이 여분의 검색, phototoxicity의 가능성을 증가 하 고 표백 필요 합니다.
모든 형광 측정, 것과 같이 과도가 문제다, 다른 세포질 통풍 관을 가진 두 화합물을 비교 하는 경우에 특히. 형광 강도 통풍 관, 농도, 및 약물 노출 시간 속도에 뿐만 아니라, 화합물의 본질적인 신호에 따라 종속 되지 않습니다. 그림 3에서 보듯이, 반면에 Dox NP 처리 셀에서 아무 신호를 볼 dox 처리 셀의 핵 DXR 콘텐츠 표시, 이미입니다. 증가 하는 이득에 의해서만 수 Dox NP 처리 셀에서 DXR 구상 될, dox 처리 셀에 과도에 지도. 또한,도 침, Dox NP heterogeneously 배포는 아래 피할 수 없는 발생할 수 있습니다-또는 노출 과도. 세포질 DXR 함정 수사를 조사 하는 경우에 특히 이득 개별 세포 (그림 5B 및 5c)을 구별 하는 것 크게 감소 되었다. 따라서, 픽셀 밀도로 표현 하는 측정 결과의 적절 한 해석에 대 한 대표적인 이미지에 의해 동반 되어야 합니다.
Phototoxicity 표백, 낮은 신호 대 잡음 비율에에서는, 및 또한 중요 한 문제 형광 현미경 검사 법, 그리고 이미지의 품질과 이미지 수집 사이 타협을 설정 해야 합니다. 그러나, 현미경 설치 최적입니다, 경우에 이미지 품질은 또한 크게 전지와 추가 화합물의 품질에 의해 결정 됩니다. DXR 강한 신호를 제공 하 고, 적절 한 주의와 표백 하지 관찰 되었다, (최대 72 h) 오랜 후에. 그러나, 형광 신호 감소 경과의 결과 수 있습니다. 경과 약물 저항15 중요 한 현상 이며 셀 펌프 액션의 세포내 사이트에서 마약을 하는 경우에 발생 합니다. 시간이 지남에 형광 신호 감소 하실 수 있습니다 따라서 dox 경과9의 결과. 표백 시연할 예정 이다 시간 경과 시리즈에서 마지막 이미지와 실험의 끝에 비 스캔 위치의 형광 신호를 비교 (즉, 신호 높은 것 비 스캔 위치에서) 또는 (즉, 두 경과 신호 것입니다 동일)입니다. (예를 들어, 배경, 드리프트, 표백, 등) 여러 교정 옵션 ImageJ16같은 프로그램에서 사용할 수 있습니다. 또한, 형광 강도 시간이 지남에 따라 증가, 구성 설정 시간 경과 (단계 3.21)의 끝에 과도 최소화 하기 위해 파일럿 실험에서 미리 계산 된 수 있습니다. 또는, 이미 원하는 기간에 대 한 약물에 노출 된 세포 이미징 챔버 설정을 초기화를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 유형의 분석, 독성 약물 농도 (단계 3.22) 피해 야 한다 하 고 미리 기존의 바이오-분석 실험을 사용 하 여 설정.
세포는 지속적으로 교양 하 고 페 놀 레드 없이 매체에 유지. 페 놀 레드는 스펙트럼의 빨간 부분에 fluoresces 고 휴대 organelles, 가장 가능성이 리소좀, 거짓 양성 정보 (1.2 단계)에서 관찰 될 수 있다. 개별 셀의 모니터링에 대 한 수 있도록, 셀 합류 70% (3.1 단계.) 넘지 말아야 한다. CO2 흐름-속도 (3.5 단계) 또는 유지 보수 후 유효성 검사 실험 장비를 구입 하는 경우에 통제 될 필요가 있다. 속도가 너무 높은, 중간 증발 됩니다. 속도 너무 낮은 경우에, 세포 성장에 영향을 미칠 수 있는 매체의 pH 증가 합니다. 매체 없이 pH에 페 놀 레드 산도 표시기 변경 관찰 될 수 없다 고 따라서 쉽게 간과 된다. CO2 흐름의 유효성을 검사 하는 일단 이러한 설정은 모든 미래 실험에 사용할 수 있습니다.
여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 나노 입자의 운명 수 있다 쉽게 조사 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경을 사용 하 여. 이 절차에서는 상업적으로 이용 가능한 나노 입자 사용 되었다. 그러나, 열에 민감한17, 양이온 리10;의 운명 짧은 체인 shingolipids18; 농축 리 그리고 나노 캡슐화 다른 약물8,19 도 이러한 방법으로 종양과 정상 세포에 조사 되었다.

세포 세포 상호 작용 같은 생물 학적 과정에 따라 수 간-세포내 수송, 세포 독성 화합물 통풍 관, 및 살아있는 세포와 조직에 단일 분자의 단백질 단백질 상호 작용 및 마지막에 큰 관심을 얻고 있다 10 년, "실시간"의 여분의 차원을 제공 합니다 이 원고에서 무료 dox dox 나노 (Dox-NP)에 통합의 세포내 운명에 따라 하는 방법 설명입니다.
나노 입자 특정 암 치료에 수십 년 동안 사용 되었습니다. 에이즈 관련 Kaposi 육 종, 치료에 대 한 난소 고급 유방암과 다중 골 수 종1, Dox NP 승인 되었습니다. 그것은 첫 번째 자주 나노 입자 개발 및 임상 설정에서 도입 중 하나 였다. 자유형, dox, 광대 하 게 충분 한 양의 종양 사이트에 접근을 제한 하는 혈액 순환에서 지워집니다. 또한, 치료는 심한 고 복용량 제한 부작용, 구내 염, 심장 마비 등을 동반 된다. Pegylated 자주 나노 입자에 캡슐화 순환 시간이 일2분에서 증가 합니다. 콜레스테롤을 포함 하는 이러한 유형의 liposome 상당히 안정적 이며 캡슐화 된 약물의 약 동학이이 안정성에 따라 결정 됩니다.
그러나,이 강성 단점이 있다. 세포 독성 종양 세포에 대 한 화합물의 기능은 첫 번째 평가 된 생체 외에서그리고 그 dox는 Dox-NP에서 세포 독성 분석 실험3,4보다 더 강력한 표시 되었습니다. 그것은 릴리스 및, 약의 세포질 통풍 관을 방지 하는 캐리어의 안정성 그리고이 현상 더 조사 가치가 가설 했다. 대상 사이트 (즉, 종양에서 세포 독성 구성 요소 (즉, dox)의 장애인된 bioavailability 귀착되 었 다 혈 류에서 공격적인 요소를 마지막에 그대로, 종양 사이트에 도달를 내장 기본 자주 속성 세포 핵)입니다. Dox NP 대담 자유 형식에 비해 응답을 개선, 비록 그것은 여전히 임상 값의 캡슐화는 크게5cardiotoxic 효과 감소. 다음 몇 년 동안, 다른 화합물 나노 캐리어6캡슐 했다. 또한, 반송파 수정 트리거 마약 릴리스 (즉, 종양 사이트)에서 가져왔지만 혈액 순환을7,8에 안정성을 유지. 조사 및 임상 사용의 년에 불구 하 고 같은 Dox NP nanocarriers의 intratumoral 운명을 아직 명확 하지 않다 완전히. 최근 간행물에서 그것 동안에 dox 리소좀9에 갇혀는 나노 전체적으로 채택 되는 표시 했다.
나노 및 약물 방출의 세포질 통풍 관에는 최고의 라이브 셀 이미징 사용 하 여 모니터링할 수 있는 동적 프로세스입니다. 또한, 클래식 조직학, 셀에서 알을 품는 그리고 잘못 된 결과 줄 수 그 후 고정, 고정 자주 캐리어를 파괴 하 고 유물을 소개 하는 경우. 라이브 셀 이미징에 대 한 주요 요구 사항 시각화, 형광, 선호에 의해 원하는 과정입니다. Dox, 같은 특정 화합물 있다 본질적인 붉은 형광. 또한, 형광 마커는 캐리어에 소개 될 수 있다 고 휴대 organelles 라이브 셀 마커를 사용 하 여 구상 될 수 있다. 이 방법에서는, 매개 변수, 캐리어, 마약 릴리스 및 캐리어 및 마약, 셀룰러 현지화의 다양 한 군데 고 분석 될 수 있습니다. 여기, 메서드는 dox Dox-NP 여러 종양 세포에서의 세포 운명 뒤에 실시간으로 설명 합니다. 또한,이 방법은 쉽게 적용할 수 있습니다 (예를 들어, 나노 입자10청구) 대상 및 실행에 대 한 이상적인 조건을 만들려고 마약 릴리스 (예: 고 열7).

<table><tbody><tr><td>DMEM (페놀 레드 없음)</td> <td>Sigma</td><td>D1145</td><td>1 mM L- 글루타민 및 10 % FCS</td></tr><tr><td>Trypsin-versene (EDTA)</td> 보충<td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>태아 종아리 혈청</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>55 &ordm에서 30 분 동안 열 비활성화; C</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>소 피부에서 추출한 젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>PBS에서 0,1% 용액 만들기, 멸균</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0,22 &micro; M 필터 - 500 ml&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>세포: Lewis lung carcimoma</td><td>ATCC</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>세포: B16BL6</td><td>겐트 대학교 P. Brouckaert 박사</td> 기<td>증</td><td>Ref.10</td></tr><tr><td>세포: BLM 및 1F6</td><td>네이메헌 대학교 van Muijen 박사</td><td></td><td>기증 Ref.11</td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>독소루비신</td><td>액타비스&nbsp;</td><td></td><td>원고에서 dox로 언급</td></tr>됨 <tr><td>Doxil/Caelyx</td><td>Janssen-Cilag</td><td></td><td>원고에서 Dox-NP로 언급</td></tr>됨 <tr><td>Syringe filter 0.2 &micro; m</td><td>VWR 국제</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>Lysotracker-green DND-26</td><td>Invitrogen</td><td>L7526</td><td>원고에서 lyosomal marker (LM)-green으로 언급</td></tr><tr><td>Lysotracker-red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td> 원<td>고에서 lyosomal marker (LM)-red로 언급</td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 25 mm #1</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td>CB00250RA1</tr><tr><td>스테이지 홀더 + 밀봉 뚜껑</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 510 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 LSM 510 버전 3.2 SP2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr></tbody></table>

사용 하 여 체 외에서 전달 chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

기존의 이미징 기술을 세포 프로세스에 대 한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나,이 정보는 그렇지 않으면 동적 시스템에서 정적 이미지에 근거 하 고 연속 단계는 쉽게 간과 되거나 오해. 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경 검사 법, 있는 살아있는 세포 수에 따라 몇 시간 또는 며칠 더 많거나 적은 연속 방식에서 들이 따라서 매우 유익한. 여기에 설명 된 프로토콜 살아있는 세포에서 독 소 루비 (dox)의 납품 후에 화학요법 나노 입자의 운명을 조사 수 있습니다. Dox는 intercalating 에이전트 생물학적으로 활성 되는 nanocarrier에서 발표 해야 합니다. 십년 이상에 대 한 임상 등록, 불구의 이해, 분석, 및 약물 방출 아직도 완전히 이해 된다. 이 기사에서는 지질 기반 나노 입자는 종양 세포에 의해 채택 하 고 천천히 저하 가설. 출시 된 dox 핵에 translocated 다음 이다. 고정 아티팩트를 방지 하기 위해, 라이브 셀 이미징 및 시간 경과 현미경 검사 법,이 실험 절차에 따라 적용할 수 있습니다.

자주 사업자와 다른 마커 라벨 앞에서 설명한9되었습니다. 빨강 dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine 과염소산염 (않았다;으로 표시 하는 항공사 Ex = 644 nm; 엠 = 665 nm) 또는 녹색 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Ex = 490 nm; 엠 = 515 nm)이이 원고에 표시 됩니다. 세포 유사점 및 차이점에 자주 통풍 관, 릴리스, 그리고 세포내 지역화를 표시 하려면 여러 종양 종류 공부 했다. 이러한 두 마우스 라인, B16BL6 흑색 종11 와 루이스 폐 암 (LLC는), 그리고 두 인간의 정면을, 높은 전이성 (BLM), 전이성 비 (1F6) 흑색 종12,13포함 됩니다. 모든 실험은 살아있는 세포를 사용 하 여 수행 했다. 모든 실험에 대 한 3 또는 24 h. 측정 된 고 (무료, 발표, 캡슐화, 분리 된, 또는 형태로 삽입) 분석된 dox 라고도 했다 DXR 5 µ g/mL dox, 5 µ g/mL Dox-NP, 또는 0.05 µmol 나노 입자의 농도 관리 되었다. 40 X (숫자 조리개: 1.3) 오일 렌즈 사용 되었다, 그리고 영상 CF-PE 및 lysosomal 마커 (LM) 488 nm 아르곤 레이저 (10%/0.2 mW 전력)와 505 550 nm 대역 통과 필터 수행 되었다-녹색. 543 nm 헬륨-네온 레이저 (100% / 0.2 mW 전력) 560 615 nm 대역 통과 필터 dox, Dox NP 및 lysosomal 마커-레드 사용 되었다. 633 nm 헬륨-네온 레이저 (100%/0.5 mW 전력)와 640 nm 긴 패스 필터가 사용 되었다 않았다.
캡슐화 때문에 체 외에서 세포 독성, 생체 이용률, dox의 약 동학 크게 변경된3,,914했다. 자유롭고 캡슐 형태로 투여 하면 약물의 생체 이용률의 차이 그림 3에서 보여 줍니다. Dox intercalating 에이전트 이며 될 세포 독성 세포 핵을 입력 해야 합니다. 그림 3 관련 영화 1 및 2 3 h BLM 셀 dox 또는 Dox NP 동일한 조건 하에서 치료의 시간 경과 표시. Dox 노출의 몇 분 안에 핵 DXR (그림 3A, 영화 1) 관찰 될 수 있다 그리고, 낮은 사용 하 여 이득 (삽입), 핵에 있는 intercalating 볼 수 있습니다. 대조적으로, Dox NP에 드러낼 때, 세포내 DXR 거의 표시 됩니다이 시간 내-(그림 3B, 영화 2). 광 전 증폭 관 이득, 증가에 의해서만 DXR 세포질에서 관찰 될 수 있다 (삽입). ImageJ를 사용 하 여, 세포질 및 핵 DXR의 픽셀 밀도 분석 되었다. 로 셀 모션에서 시간 경과 평가 하는 동안, 밝은 필드 이미지 형광 결합 하는 것 중요 하다. 이 개별 셀을 추적 하 고 안정화 ImageJ의 특정 플러그인을 사용 하 여 XY 드리프트의 가능성을 제공 합니다. 그림 3에서 제시 하는 분석에 밝은 필드 이미지 세포질 (실선)와 핵 (점선) (ROI) 관심 영역을 그리는 데 사용 되었다. ImageJ의 ROI 관리자 메뉴 항목 분석에서에서 찾을 수 있습니다 &#62; 도구 &#62; ROI 관리자. 이러한 ROIs 메뉴 항목 분석을 사용 하 여 픽셀 밀도 분석 하는 형광 이미지에 사용 되는 &#62; 측정. 핵 (그림 3C)의 픽셀 밀도 dox-또는 Dox-NP-치료 세포의 세포질 (그림 3D)의 차이 이미지에서 본 것을 확인 합니다. 또한, 셀 dox 또는 Dox-NP, 후 화합물 매체에 의해 대체 되었고 즉시 광 전 증폭 관 이득 (그림 4)의 감도 증가 함께 몇 군데 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다. 레이저 파워, 오프셋, 핀 홀, 및 이미지 디스플레이, 등의 다른 설정을 동일 했다. Dox NP 처리 dox 처리에 비해 셀에 낮은 DXR 신호 강렬 합니다. 700의 이득을 사용 하 여, DXR Dox NP 처리 셀에 표시 됩니다, 반면에 dox의 이미지는 이미 과다 노출. 이 간단한 생체 외에서 실험 캡슐화 된 약 대 무료의 bioavailability에 상당한 차이 시각화.
24 h에 대 한 세포는 Dox NP에 노출 되는 지속적으로 때 DXR 빌드 시간이 지남에 그림 5A 와 영화 3, 4에서와 같이. 신호는 세포질에서 증가 하 고 후, DXR 발견 된다 핵에 삽입 된. 이러한 관측 픽셀 밀도 그래프 (그림 5B)에 의해 확인 됩니다. 측정 된 세포질 픽셀 밀도 BLM 세포내 분포에 차이가 있기 때문에 1F6 세포에 비해 서에서 낮습니다. DXR 1F6 셀에 셀에 걸쳐 배포 됩니다, 반면 DXR BLM 셀에 핵 (그림 5C) 가까운 세포 기관이에 더 집중 된다.
따라서, 약물 및 다른 셀 라인 (그림 6)에서 캐리어의 지역화 조사 했다. 셀은 Dox-NP/한 군데와 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다. 밝은 분야 이미지를 사용 하 여, 세포 막 (실선) 및 핵 (점선)의 오버레이 세 개의 다른 셀 라인의 형광 이미지에 그려진 했다. 그것은 여기 표시 캐리어 DXR로 동일한 세포질 패턴에 따라, 설명 된다: LLC는에서 전체 핵 주위에 있는 BLM, 핵에 가까운 세포 기관이 집중 하 고 무작위로 B16BL6 세포에서 세포질에 흩어져. 핵에서 유일한 DXR 없고 않았다 볼 수 있습니다, dox 출시 나타내는. 광 전 증폭 관 이득 줄임으로써, DXR 및 캐리어, 표시와 함께 포함 된 개별 세포질 소포, 뿐만 아니라 CF-PE (그림 6B 와 6 C)와 함께 볼 수 있습니다.
세포질 DXR 작은 소포에 sequesters 그리고 셀 녹색 또는 빨간색에 라이브 셀 lysosomal 표시와 함께 표시 했다. 이러한 리소좀의 움직임 (영화 5) 셀에 다음 수 있습니다. 세포질 DXR과는 nanocarrier이이 구조 내에서 colocalize 그리고 DXR 패턴에서 작성 차이 그림 6에서 보듯이 설명 여기. 리소좀은 B16BL6에 세포질 걸쳐 무작위로 배포 하 고 핵 BLM 셀 (그림 7A)에 옆에 있습니다. ImageJ를 사용 하 여, DXR과 캐리어는 리소좀에 사이 colocalization 계산 되었다 (그림 7B). 컬러 이미지 바이너리 되었다 (프로세스 &#62; 이진 &#62; 이진 하 게) colocalization 플러그인을 사용 하 고 (분석 &#62; Colocalization), colocalization 이미지와 DXR의 되었다 않았다. 이 두 이미지의 colocalized 픽셀을 나타내는 흰색 픽셀 그린-레드-화이트 색된 이미지를 만듭니다. 메뉴를 통해 프로세스 항목 &#62; 이진 &#62; 이진 하 게 흰색 픽셀을 구분 하 고 검은 픽셀, 픽셀 밀도 측정으로 변환 됩니다 (분석 &#62; 측정). 그 후, colocalization 이미지가이 DXR 사이 되었다-이미지 않았다 고 lysosomal 마커 (LM) 및 픽셀 밀도의 바이너리 이미지 측정. Colocalization 데이터는 픽셀 DXR에 대 한 긍정적인의 비율-않았다 DXR-않았다/lysosomal 마커 (그림 ℃). 그 뿐만 아니라 CF-PE와 라벨이 캐리어로,에 있는 리소좀 그림 7D에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig1.jpg"> 
그림 1: 악기와 장비 설치. A) 챔버 + 필수품 이미지입니다. 25 m m #1 커버 유리 (1), (2), 챔버의 하단 부분 상위 챔버 (곳에의 부분아래로 거꾸로 d)와 링 (3), 무대 홀더 (4), 및 씰링 뚜껑 (5). 눈금 막대: 2 cm. B) 외피 단위. 열띤된 현미경 단계 (1) 흐름 단계와에-및 아웃-flow CO2 (2), (3), CO2 프로브 및 닫는 패치 (4). 눈금 막대: 2 cm. C) 현미경 아래에서 본 인큐베이터 장치에서 챔버를 이미징. D) 다중 시계열 매크로입니다. E) 이미징 장비입니다. 거꾸로 현미경 (1), 형광등 (2), 컴퓨터 (3), 링 히터 (4, 삽입)와 컨트롤러 (4, 주요 그림), CO2 흐름 튜브 (5), CO2 밸브 (6), CO2 컨트롤러 (7), CO2 가습기 (8), O2 밸브 및 컨트롤러 (9), 그리고 단계 온도 컨트롤러 (10). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig2.jpg"> 
그림 2: 프로토콜 섹션 3에에서 대 한 자세한 현미경 매개 변수의 도식. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig3.jpg"> 
그림 3: 단기 통풍 관에 dox 그리고 Dox NP를 조사.  BLM 셀 3 h, dox 또는 Dox NP에 지속적으로 노출 됐다 고 한 경과 찍은. (A) 셀 dox로 인 큐베이 팅의 시간 경과의 스틸 사진. 셀의 경과의 (B) 스틸 사진을 Dox NP와 인 큐베이 팅. 눈금 막대 50 µ m. (C) 픽셀 밀도의 증가 핵 DXR dox-Dox-NP-처리 셀에 =. (D) dox-Dox-NP-처리 세포에서 세포질 DXR의 픽셀 밀도 증가. 데이터 필드 3 셀의 평균 ±를 SD를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig4.jpg"> 
그림 4: 다른 세포에 dox Dox NP의 장기 도입을 조사. 셀은 dox 또는 Dox NP에 노출 됐다 고 후 24 h를 몇 군데. 이미지 3 다른 이득 갖는 약물의 제거 직후 찍은 사진. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig5.jpg"> 
그림 5: 세포질 통풍 관 그리고 자주 에이전트의 방출 조사. 셀 24 h, Dox NP에 지속적으로 노출 됐다 고 한 시간 경과 되었다. (A)는 시간 경과의 스틸 사진. 눈금 막대 50 µ m. (B) 픽셀 밀도 증가 DXR의 핵 및 세포질에서 =. 데이터 필드 3 셀의 평균 ±를 SD를 나타냅니다. (C) 이미지 셀 내에서 DXR의 지역화를 설명 합니다. 실선: 세포 막, 점선: 핵. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig6.jpg"> 
그림 6: 약물 및 다른 세포에서 캐리어의 지역화를 조사. (A) 세포 Dox-NP/한 24 h에 노출 되었고 몇 군데. 눈금 막대 = 50 µ m. (B) 셀 24 h 동안 Dox-NP/했/CF-PE에 노출 되었고 개별 소포를 구별 하는 낮은 강도 이득으로 몇 군데. (C) 밝은-필드와 DXR DXR 세포질 소포 (화살표)를 보여주는 오버레이. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig7.jpg"> 
그림 7: 약물 및 캐리어의 세포내 지역화의 조사. 셀 Dox-NP/또는 CF-PE/한 24 h에 노출 됐다 고 리소좀 녹색 또는 빨간색에 라이브 셀 lysosomal 마커 (LM)을 사용 하 여 시각화 됩니다. (A) DXR과 캐리어 (않았다)의 세포내 지역화. 화살표는 DXR의 3 예제 나타내고는 리소좀에 지역화 된 않았다. 눈금 막대 = 50 µ m (B) 공동 지역화 분석 DXR 및 캐리어 (않았다) 리소좀 (LM) ImageJ를 사용 하 여에. DXR의 공동 지역화와 리소좀에 운반대의 (C) 비율. 데이터 3 개별 실험의 평균 ±를 SEM을 나타냅니다. (D)는 캐리어의 Lysosomal 격리는 두 다른 마커를 사용 하 여 시각입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/55405fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov1.jpg"> 
영화 1: 관련 그림 3 : BLM 셀 3 h. 위해 dox로 인 큐베이 팅 했다 시간 경과: 19 이미지, 10 분 프레임 속도의 간격: 3 fps. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_1_BLM_Doxorubicin_for_3h.avi" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov2.jpg"> 
영화 2: 관련 그림 3 : BLM 셀 3 h. 위해 Dox NP와 인 큐베이 팅 했다 시간 경과: 19 이미지, 10 분 프레임 속도의 간격: 3 fps. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_2_BLM_Doxil_for_3h.avi" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov3v3.jpg"> 
영화 3: 관련 된 그림 5 : BLM 셀 24 h.에 Dox NP와 인 큐베이 팅 했다 시간 경과: 프레임 속도 15 분 간격으로 96 이미지: 8 fps. 눈금 막대 = 50 µ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a href=""></a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a>6"대상 =""_blank >이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (다운로드를 오른쪽 클릭 합니다.)
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov4.jpg"> 
영화 4: 관련 그림 5 : 1F6 셀 했다 24 h.에 Dox NP와 인 큐베이 팅 시간 경과: 프레임 속도 15 분 간격으로 96 이미지: 8 fps. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_4_1F6_Doxil_for_24h.avi" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 5" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov5.jpg"> 
영화 5: 관련 그림 7 : 리소좀의 B16BL6 세포 라이브 셀 표식으로 물 했다. 시간 경과: 10의 간격으로 10 이미지 s. 프레임 속도: 3 fps. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55405/Movie_5_B16BL6_lysotracker.avi" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

라이브 셀 이미징은 동적 프로세스를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 고정된 셀의 시험만 정적 사진을, 오해 및 과정에 대 한 혼란으로 이어질 수 있는 제공 합니다. 이 작품 이해, 약물 방출, 및 자주 나노 살아있는 세포에서의 세포내 지역화 하는 방법을 제공 합니다.

사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

이 라이브 셀 이미징(Live-cell imaging) 기술의 전반적인 목표는 고정 과정 없이 화학요법제(Chemotherapeutic Agents)의 흡수 및 분포와 같은 세포 프로세스를 관찰하는 것입니다. 이러한 방법은 유리 형태 또는 나노입자에 캡슐화된 화학요법제가 종양 세포에 어떻게 흡수되는지와 같은 암 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포를 이미징함으로써 고정 과정으로 인한 아티팩트를 방지하고 실시간 동적 평가를 가능하게 한다는 점입니다.우리는 고정 과정 중 나노입자가 분해되어 약물 전달에 대한 오해석으로 이어지는 것을 관찰하면서 처음 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 이미징 챔버를 조립하려면, 25 millimeter 커버 글라스를 챔버의 하단부에 배치하고 상단부를 하단부에 나사로 조이십시오. 유리가 깨질 수 있으므로 너무 세게 조이지 마십시오.챔버 전체를 오토클레이브합니다. 세포를 플레이팅하려면 층류 정화 작업대(Laminar Flow Cabinet) 내에서 멸균 백으로부터 이미징 챔버를 꺼냅니다. 챔버를 조심스럽게 조인 후 페트리 접시에 넣습니다.이미징 챔버의 유리를 0.1% 멸균 젤라틴 1 mL로 코팅하여 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 20분 동안 처리합니다. 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거한 후, 세포를 1x PBS로 한 번 세척하고 0.25% Trypsin을 사용하여 세포를 분리합니다. 세포 배양 배지를 첨가하여 Trypsin을 불활성화합니다.그런 다음, 세포를 수집하여 1,100 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다. 침전물을 5 mL의 세포 배양 배지에 다시 현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 수를 센 후, 젤라틴을 흡입하여 제거하고 24시간 이내에 최대 70%까지 도달할 수 있는 희석 배율로 세포를 플레이팅합니다.5% 이산화탄소와 37°C 조건에서 24시간 동안 세포를 부착시킵니다. 현미경을 통해 세포의 합류도, 세포 형태 및 오염 여부를 평가하십시오. 그 다음, 공초점 현미경, 형광등 및 컴퓨터의 전원을 켭니다.렌즈 히터를 대물렌즈에 연결하고 35도로 설정하십시오. 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 배양 장치를 준비하십시오. 배양 장치를 현미경 스테이지 위에 놓고 이산화탄소 유입 및 유출 튜브를 연결하십시오.메인 이산화탄소 밸브를 열고 이산화탄소 컨트롤러의 전원을 켭니다. 컨트롤러가 5% 이산화탄소로 설정되어 있는지 확인하십시오. 온도, CO2, pH, 습도 및 무균 상태와 같은 적절한 세포 배양 조건은 장기 세포 이미징에 매우 중요합니다.따라서 각 인큐베이터에 대해 적절한 테스트가 필요합니다. 챔버 온도를 37 °C로 설정하십시오. 배양 장치가 선택한 온도와 이산화탄소 백분율에 도달할 때까지 기다리십시오.메인 이산화탄소 배양기에서 이미징 챔버를 꺼내 페트리 접시에 담아 현미경실로 운반합니다. 이미징 챔버를 맞춤 제작된 35 millimeter 직경의 스테이지 홀더에 거치하고 맞춤 제작된 밀봉 덮개로 챔버를 닫습니다. 배양 유닛을 열고, 세포의 온도가 낮아지는 것을 방지하기 위해 최대한 신속하게 작동하여 기존의 레드 패치를 이미징 챔버로 교체한 후 유닛을 닫습니다.스테이지와 현미경 사이에 케이블이 끼어 있지 않은지 확인하십시오. 장비가 환경에 적응하도록 30분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음, 소프트웨어를 실행하고 레이저를 켭니다.File 탭 아래의 "New"를 클릭하여 새 데이터베이스를 만듭니다. 데이터베이스의 이름을 지정하고 저장하십시오. Acquire 탭 아래의 "Config"를 클릭하여 설정을 구성하십시오.단일 형광체를 평가하려면 "Channel Mode"와 "Single Track"을 선택하십시오. 여러 형광체를 사용하는 경우 "Multi Track"을 선택하십시오. 그런 다음, 형광체에 맞는 적절한 밴드패스 필터를 선택하십시오.트랙 중 하나에서 명시야 채널을 선택하십시오. 스캐닝 과정에서는 화합물의 형광 신호와 이미지 품질 사이의 절충이 필요합니다. 과노출, 광퇴색, 신호 대 잡음비, 세포의 상태, 첨가된 화합물은 모두 결과에 영향을 미칠 수 있는 요인들이며 적절한 검증이 필요합니다.Acquire 탭 아래의 Scan을 클릭하여 스캔 제어 설정을 지정합니다. 그런 다음 Mode를 클릭하여 프레임 크기, 스캔 속도, 스캔 방향 및 스캔 평균값을 설정합니다. Channels를 클릭하여 핀홀, 게인 및 오프셋, 그리고 레이저 출력을 설정합니다.Configuration 탭에서 "Config"를 클릭하여 이 설정들을 저장하고, Configuration 데이터베이스에 저장하십시오. Macro 탭에서 "Muti TimeX"를 클릭하여 타임랩스(time-lapse)를 설정하십시오. Single Location을 클릭하십시오."Single Track"을 클릭하여 저장된 설정을 적용하고, 설정 데이터베이스에서 필요한 설정을 찾아 스크롤합니다. 시간 간격과 스캔 횟수를 설정합니다. "Load Conf"를 클릭하여 설정을 로드합니다.기본 파일 이름(Base File Name)에 타임랩스 이름을 입력하고, 'Image Data Base'를 클릭하여 타임랩스를 저장할 데이터베이스를 선택하십시오. 'Temporary Image Folder'를 클릭하여 임시 폴더를 설정하십시오. 다음으로, 배양 장치를 열고 이미징 링을 들어 올린 후, 대물렌즈에 침수유(Immersion Oil) 한 방울을 떨어뜨리고 가능한 한 빨리 장치를 닫으십시오. 초점을 맞춘 후 이미징 챔버 내에서 위치를 선택하십시오.층류 작업대(Laminar Flow Cabinet) 내에서, 유리 약물 또는 나노입자를 세포 배양 배지(Cell Culture medium)를 사용하여 약물 농도 5 µg/mL 또는 지질 농도 0.05 µmol로 희석합니다. 약물이나 나노입자가 멸균 상태가 아닌 경우 0.22 µm 시린지 필터로 여과합니다. 인큐베이팅 챔버를 열고 상단 덮개를 들어 올립니다.그 다음, 세포에서 배지를 제거하고 희석된 약물 또는 나노입자 1mL를 추가한 뒤 가능한 한 빠르게 장치를 닫습니다. 세포에 초점을 맞추고 Scan Control 탭에서 "Single"을 클릭하여 빠르게 스캔합니다. 명시야 이미지에서 세포의 초점이 맞으면 Multi TimeX Macro에서 "Start Time"을 클릭하여 타임랩스를 시작합니다.반복 횟수와 남은 시간은 매크로 및 이미지에 표시됩니다. 세포가 여전히 초점에 있는지 정기적으로 확인하거나 자동 초점(Autofocus) 기능을 사용하십시오. 프로그램은 타임랩스 영상을 데이터베이스에 자동으로 저장합니다.프로그램이 실행되는 동안 데이터베이스를 닫지 마십시오. 이것은 유리 독소루비신(Doxorubicin)에 노출된 세포의 3시간 타임랩스 영상입니다. 적색 형광 독소루비신의 흡수와 핵으로의 즉각적인 전위를 관찰하십시오.여기서는 세포를 캡슐화된 Doxorubicin과 함께 3시간 동안 배양합니다. 형광 신호가 훨씬 낮으며 세포질에 위치해 있습니다. 핵에서는 신호가 거의 보이지 않습니다.이 타임랩스 영상을 Image J로 가져와서, 핵 주변에 관심 영역(region of interest)을 설정하고 픽셀 밀도를 측정할 수 있습니다. 여기에 제시된 그래프는 유리 Doxorubicin 또는 캡슐화된 Doxorubicin과 함께 배양된 세포에서 시간에 따른 핵 섭취량의 차이를 보여줍니다. 여기에는 빨간색으로 표시된 캡슐화된 Doxorubicin과 함께 배양된 세포들이 나타나 있습니다.보라색 신호는 캐리어를 나타내며, 리소좀은 녹색 생세포 마커로 염색되었습니다. 두 세포 유형을 비교하면 리소좀 분포의 차이를 확인할 수 있습니다. B16BL6 세포의 리소좀은 세포질 전체에 분포되어 있습니다.반면, BLM 세포의 리소좀은 핵 근처에 위치합니다. 그러나 두 세포주 모두 리소좀에서 적색과 자색 신호의 높은 공국소화를 보이며, 이는 독소루비신과 그 운반체가 이들 세포 소기관에 갇혀 있음을 나타냅니다. 이 영상을 시청하고 나면, 살아있는 세포 내에서 화학요법제 및 기타 형광 마커의 흡수를 수 시간 또는 수일 동안 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

using-vitro-live-cell-imaging-to-explore-chemotherapeutics-delivered

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 조류 배아 모델 동적, 실시간 intravital 이미지를 사용하여 인간의 xenografted 종양의 vasculature에 nanoparticle의 국제화를 수치 소설 접근법을 제시한다.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

생체 내 이미징을 위한 형광단의 사용은 옵소니화, 빠른 제거, 낮은 검출 감도 및 숙주에 대한 세포 독성 효과로 인해 크게 제한될 수 있습니다. 필름 수화 및 압출에 의한 리포솜 내 형광단의 캡슐화는 형광 소멸 및 보호로 이어져 높은 검출 감도로 in vivo 이미징을 가능하게 합니다.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질 생체 광학 이미징

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

액정 나노 입자 (LCNP) nanocarrier는 살아있는 세포의 세포막에 소수성화물의 제어 전달을위한 수단으로 이용된다.

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

나노 의약품의 생체 내 성능에 대한 이해가 부족하여 임상 번역이 지연됩니다. 종양 보유 면역 능력이 있는 마우스에서 전신, 조직, 단세포 및 세포 내 수준에서 암 나노의약품의 생체 내 거동을 평가하는 절차가 여기에 설명되어 있습니다. 이 접근 방식은 연구자가 임상 번역을 위한 유망한 암 나노의약품을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

이 프로토콜의 목표는 형광 표지된 리포솜을 합성하고 유세포 분석을 사용하여 세포 수준에서 리포솜의 생체 내 국소화를 식별하는 것입니다.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

여기에서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)를 제형화하기 위한 프로토콜이 제시된다. 이 LNP는 HepG2 세포의 in vitro 및 C57BL/6 마우스의 in vivo 에서 효능을 테스트했습니다.

미세유체 혼합으로 제조된 mRNA-지질 나노입자의 In vitro 및 In vivo 효율 테스트

배우세요 살아있는 세포 이미징 기술을 활용하여 항암제의 실시간 흡수와 분포를 관찰하는 방법을. 고정 과정 없이 나노입자 기반 약물 전달 메커니즘을 정확하게 분석할 수 있습니다.

사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

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