사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

이 라이브 셀 이미징(Live-cell imaging) 기술의 전반적인 목표는 고정 과정 없이 화학요법제(Chemotherapeutic Agents)의 흡수 및 분포와 같은 세포 프로세스를 관찰하는 것입니다. 이러한 방법은 유리 형태 또는 나노입자에 캡슐화된 화학요법제가 종양 세포에 어떻게 흡수되는지와 같은 암 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포를 이미징함으로써 고정 과정으로 인한 아티팩트를 방지하고 실시간 동적 평가를 가능하게 한다는 점입니다.

우리는 고정 과정 중 나노입자가 분해되어 약물 전달에 대한 오해석으로 이어지는 것을 관찰하면서 처음 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 이미징 챔버를 조립하려면, 25 millimeter 커버 글라스를 챔버의 하단부에 배치하고 상단부를 하단부에 나사로 조이십시오. 유리가 깨질 수 있으므로 너무 세게 조이지 마십시오.

챔버 전체를 오토클레이브합니다. 세포를 플레이팅하려면 층류 정화 작업대(Laminar Flow Cabinet) 내에서 멸균 백으로부터 이미징 챔버를 꺼냅니다. 챔버를 조심스럽게 조인 후 페트리 접시에 넣습니다.

이미징 챔버의 유리를 0.1% 멸균 젤라틴 1 mL로 코팅하여 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 20분 동안 처리합니다. 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거한 후, 세포를 1x PBS로 한 번 세척하고 0.25% Trypsin을 사용하여 세포를 분리합니다. 세포 배양 배지를 첨가하여 Trypsin을 불활성화합니다.

그런 다음, 세포를 수집하여 1,100 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다. 침전물을 5 mL의 세포 배양 배지에 다시 현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 수를 센 후, 젤라틴을 흡입하여 제거하고 24시간 이내에 최대 70%까지 도달할 수 있는 희석 배율로 세포를 플레이팅합니다.

5% 이산화탄소와 37°C 조건에서 24시간 동안 세포를 부착시킵니다. 현미경을 통해 세포의 합류도, 세포 형태 및 오염 여부를 평가하십시오. 그 다음, 공초점 현미경, 형광등 및 컴퓨터의 전원을 켭니다.

렌즈 히터를 대물렌즈에 연결하고 35도로 설정하십시오. 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 배양 장치를 준비하십시오. 배양 장치를 현미경 스테이지 위에 놓고 이산화탄소 유입 및 유출 튜브를 연결하십시오.

메인 이산화탄소 밸브를 열고 이산화탄소 컨트롤러의 전원을 켭니다. 컨트롤러가 5% 이산화탄소로 설정되어 있는지 확인하십시오. 온도, CO2, pH, 습도 및 무균 상태와 같은 적절한 세포 배양 조건은 장기 세포 이미징에 매우 중요합니다.

따라서 각 인큐베이터에 대해 적절한 테스트가 필요합니다. 챔버 온도를 37 °C로 설정하십시오. 배양 장치가 선택한 온도와 이산화탄소 백분율에 도달할 때까지 기다리십시오.

메인 이산화탄소 배양기에서 이미징 챔버를 꺼내 페트리 접시에 담아 현미경실로 운반합니다. 이미징 챔버를 맞춤 제작된 35 millimeter 직경의 스테이지 홀더에 거치하고 맞춤 제작된 밀봉 덮개로 챔버를 닫습니다. 배양 유닛을 열고, 세포의 온도가 낮아지는 것을 방지하기 위해 최대한 신속하게 작동하여 기존의 레드 패치를 이미징 챔버로 교체한 후 유닛을 닫습니다.

스테이지와 현미경 사이에 케이블이 끼어 있지 않은지 확인하십시오. 장비가 환경에 적응하도록 30분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음, 소프트웨어를 실행하고 레이저를 켭니다.

File 탭 아래의 "New"를 클릭하여 새 데이터베이스를 만듭니다. 데이터베이스의 이름을 지정하고 저장하십시오. Acquire 탭 아래의 "Config"를 클릭하여 설정을 구성하십시오.

단일 형광체를 평가하려면 "Channel Mode"와 "Single Track"을 선택하십시오. 여러 형광체를 사용하는 경우 "Multi Track"을 선택하십시오. 그런 다음, 형광체에 맞는 적절한 밴드패스 필터를 선택하십시오.

트랙 중 하나에서 명시야 채널을 선택하십시오. 스캐닝 과정에서는 화합물의 형광 신호와 이미지 품질 사이의 절충이 필요합니다. 과노출, 광퇴색, 신호 대 잡음비, 세포의 상태, 첨가된 화합물은 모두 결과에 영향을 미칠 수 있는 요인들이며 적절한 검증이 필요합니다.

Acquire 탭 아래의 Scan을 클릭하여 스캔 제어 설정을 지정합니다. 그런 다음 Mode를 클릭하여 프레임 크기, 스캔 속도, 스캔 방향 및 스캔 평균값을 설정합니다. Channels를 클릭하여 핀홀, 게인 및 오프셋, 그리고 레이저 출력을 설정합니다.

Configuration 탭에서 "Config"를 클릭하여 이 설정들을 저장하고, Configuration 데이터베이스에 저장하십시오. Macro 탭에서 "Muti TimeX"를 클릭하여 타임랩스(time-lapse)를 설정하십시오. Single Location을 클릭하십시오.

"Single Track"을 클릭하여 저장된 설정을 적용하고, 설정 데이터베이스에서 필요한 설정을 찾아 스크롤합니다. 시간 간격과 스캔 횟수를 설정합니다. "Load Conf"를 클릭하여 설정을 로드합니다.

기본 파일 이름(Base File Name)에 타임랩스 이름을 입력하고, 'Image Data Base'를 클릭하여 타임랩스를 저장할 데이터베이스를 선택하십시오. 'Temporary Image Folder'를 클릭하여 임시 폴더를 설정하십시오. 다음으로, 배양 장치를 열고 이미징 링을 들어 올린 후, 대물렌즈에 침수유(Immersion Oil) 한 방울을 떨어뜨리고 가능한 한 빨리 장치를 닫으십시오. 초점을 맞춘 후 이미징 챔버 내에서 위치를 선택하십시오.

층류 작업대(Laminar Flow Cabinet) 내에서, 유리 약물 또는 나노입자를 세포 배양 배지(Cell Culture medium)를 사용하여 약물 농도 5 µg/mL 또는 지질 농도 0.05 µmol로 희석합니다. 약물이나 나노입자가 멸균 상태가 아닌 경우 0.22 µm 시린지 필터로 여과합니다. 인큐베이팅 챔버를 열고 상단 덮개를 들어 올립니다.

그 다음, 세포에서 배지를 제거하고 희석된 약물 또는 나노입자 1mL를 추가한 뒤 가능한 한 빠르게 장치를 닫습니다. 세포에 초점을 맞추고 Scan Control 탭에서 "Single"을 클릭하여 빠르게 스캔합니다. 명시야 이미지에서 세포의 초점이 맞으면 Multi TimeX Macro에서 "Start Time"을 클릭하여 타임랩스를 시작합니다.

반복 횟수와 남은 시간은 매크로 및 이미지에 표시됩니다. 세포가 여전히 초점에 있는지 정기적으로 확인하거나 자동 초점(Autofocus) 기능을 사용하십시오. 프로그램은 타임랩스 영상을 데이터베이스에 자동으로 저장합니다.

프로그램이 실행되는 동안 데이터베이스를 닫지 마십시오. 이것은 유리 독소루비신(Doxorubicin)에 노출된 세포의 3시간 타임랩스 영상입니다. 적색 형광 독소루비신의 흡수와 핵으로의 즉각적인 전위를 관찰하십시오.

여기서는 세포를 캡슐화된 Doxorubicin과 함께 3시간 동안 배양합니다. 형광 신호가 훨씬 낮으며 세포질에 위치해 있습니다. 핵에서는 신호가 거의 보이지 않습니다.

이 타임랩스 영상을 Image J로 가져와서, 핵 주변에 관심 영역(region of interest)을 설정하고 픽셀 밀도를 측정할 수 있습니다. 여기에 제시된 그래프는 유리 Doxorubicin 또는 캡슐화된 Doxorubicin과 함께 배양된 세포에서 시간에 따른 핵 섭취량의 차이를 보여줍니다. 여기에는 빨간색으로 표시된 캡슐화된 Doxorubicin과 함께 배양된 세포들이 나타나 있습니다.

보라색 신호는 캐리어를 나타내며, 리소좀은 녹색 생세포 마커로 염색되었습니다. 두 세포 유형을 비교하면 리소좀 분포의 차이를 확인할 수 있습니다. B16BL6 세포의 리소좀은 세포질 전체에 분포되어 있습니다.

반면, BLM 세포의 리소좀은 핵 근처에 위치합니다. 그러나 두 세포주 모두 리소좀에서 적색과 자색 신호의 높은 공국소화를 보이며, 이는 독소루비신과 그 운반체가 이들 세포 소기관에 갇혀 있음을 나타냅니다. 이 영상을 시청하고 나면, 살아있는 세포 내에서 화학요법제 및 기타 형광 마커의 흡수를 수 시간 또는 수일 동안 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.