열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

이 프로토콜의 전반적인 목표는 성체 초파리 수질 뉴런의 컬럼 및 층의 dendric routing을 분석하여 dendric 패턴을 특성화하고, 형태학에 따라 세포 유형을 결정하고, 돌연변이를 식별하는 것입니다. 이 방법은 뇌 회로를 매핑하고 수상돌기의 배선 메커니즘을 이해하는 것을 포함하여 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 3차원 공간에서 수지상 특성을 전달하여 수지상 배선 논리 및 기능에 대한 이해를 향상시킨다는 것입니다.

이 절차의 목표는 두 개의 직교, 수평 및 정면 방향에서 관심 뉴런의 두 개의 이미지 스택을 획득하는 것입니다. 표준 기술을 사용하여 토끼 항 GFP와 광수용체 축삭돌기를 1차 항체로 분류하는 항체로 절개된 파리 뇌를 염색합니다. 그런 다음 1차 항체에 형광 2차 항체를 표시하고 70%의 글리세롤과 1X PBS로 뇌를 청소합니다.

뇌를 수평 방향으로 장착하려면 글리세롤이 제거된 뇌를 현미경 슬라이드 중앙에 증착된 20마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체 방울로 옮깁니다. 그런 다음 커버슬립에 네 모서리에 작은 점토 조각을 부착하여 커버슬립이 뇌를 부수는 것을 방지합니다. 이제 해부 현미경으로 뇌를 복부 위로 향하게 합니다.

뇌의 볼록한 등쪽 표면을 랜드마크로 사용하여 뇌 샘플의 방향을 식별합니다. 이것은 뉴런의 수평적 관점을 제공합니다. 그런 다음 커버 슬립을 부착하십시오.

GaAsP 검출기가 이상적으로 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 높은 개구수 대물렌즈와 2.5의 디지털 줌으로 수평 보기 이미지 스택을 얻을 수 있습니다. 최소 180개의 광학 섹션을 획득하고, 512개의 정사각형 픽셀을 갖고, 2미크론의 스텝 크기를 갖습니다. 첫 번째 이미지 스택을 촬영한 후 슬라이드에서 커버슬립을 제거하고 뇌를 정면 보기를 제공하는 앞쪽 위쪽 위치로 재배치합니다.

그런 다음 동일한 기술을 사용하여 수평 보기에서 이미지화된 동일한 뉴런의 정면 보기의 새 이미지 스택을 만듭니다. 또한 수질 신경세포와 관련하여 관심 있는 뉴런의 위치를 기록해야 합니다. 동일한 뉴런을 식별하는 것은 더 낮은 배율에서 가능합니다.

그러나 조직이 깊어 신호가 손실되면 뇌의 복부 절반을 이미지화하면 됩니다. 또한 이미지 스택을 검사하여 이미지를 획득하는 동안 샘플이 이동했는지 확인합니다. Image de convolution 및 image combining 은 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

이 절차의 목표는 신경돌기를 추적하고 등록을 위한 참조 지점을 할당하는 것입니다. 먼저 재조합된 이미지 파일을 엽니다. 그런 다음 편집으로 이동합니다.

그런 다음 디스플레이 조정을 표시하고 빨간색인 광수용체 채널을 끕니다. 다음으로 초과 모드에서 이미지를 시각화합니다. 컴퓨터에 스테레오그래프 시스템이 장착되어 있는 경우 스테레오를 켜고 쿼드 버퍼 모드를 사용하여 3D 이미지를 시각화합니다.

새 필라멘트를 추가하고 surpass, filaments로 이동한 다음 skip automatic creation, edit manually라고 표시된 탭을 클릭합니다. 그런 다음 그리기 탭을 클릭하고 AutoDepth를 선택합니다. 그런 다음 설정을 선택합니다.

선 옵션을 전환하고 더 나은 시각화를 위해 적절한 픽셀 번호를 입력합니다. 그런 다음 수상돌기, 시작점 및 분기점 표시를 전환하고 렌더링 품질을 100%로 설정합니다.이제 그리기 탭을 선택하고 신경돌기 추적을 시작합니다. 축삭돌기부터 시작하여 수상돌기로 이동합니다.

트랜스 수질 뉴런의 축삭돌기와 수상돌기는 쉽게 구별할 수 있어야 합니다. 신경돌기를 추적한 후 설정으로 돌아가서 시작점과 분기점을 모두 토글합니다. 그런 다음 능가로 이동 한 다음 내보내기로 이동합니다.

객체를 선택하고 필라멘트를 inventor 파일로 저장합니다. 다음 단계는 참조점을 할당하는 것입니다. 시작하려면 디스플레이 조정 표시를 선택하고 두 이미징 채널을 모두 켭니다.

그런 다음 초과로 이동 한 다음 측정으로 이동합니다. 그리고 편집 탭에서 특정 채널을 전환하고 이 경우 광수용체 채널을 선택합니다. 이제 맨 위 레이어에 대한 참조점을 할당합니다.

능가를 선택한 다음 측정 지점을 선택하고 m1 레이어의 시작 부분을 맨 위 레이어로 표시합니다. 클리핑 평면 기능을 사용하면 점을 쉽게 할당할 수 있습니다. 점의 순서는 적도, 전방, 전방, 전복부, 복부, 후복부, 후방, 적도 후, 중앙입니다.

중심 광수용체(center photoreceptor)를 찾는 것은 가장 수지상 돌기(dendritic process)와 관련된 것입니다. 그런 다음 동일한 기술을 사용하여 R8 및 R7 레이어에 대한 참조 점을 할당합니다. 각 참조점 세트를 정의한 후 좌표를 내보냅니다.

통계를 선택한 다음 세부 정보, 특정 값 및 위치를 선택합니다. 그런 다음 탭 표시에서 통계를 파일로 내보내기를 선택하고 좌표를 CSV 파일로 저장합니다. 그런 다음 스프레드시트 편집기에서 세 개의 CSV 파일을 엽니다.

27개 참조점의 좌표를 맨 위, R8, R7 순으로 복사하여 새 파일에 붙여넣습니다. 수지상 분기 및 종료 빈도를 계산하기 위해 우복부 구성에 대한 강체 및 TPS 비선형 등록 표준화를 위한 텍스트 프로토콜에 따라 진행합니다. 궁극적으로 데이터는 다양한 정보 플롯을 만드는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 이중 보기 이미징 절차를 사용하여 드문드문 라벨링된 tm 20 뉴런을 포함하는 파리 뇌를 두 개의 직교 방향으로 이미지화했습니다.

이미지 재조합은 축 해상도를 향상시킵니다. 재조합된 이미지는 수평 보기 및 정면 보기 이미지보다 해상도가 더 좋습니다. 3D 모델을 참조한 후 15tm 20 뉴런에서 수지상 흔적을 수집하고 15tm 2 뉴런의 수지상 흔적과 비교했습니다.

이러한 뉴런의 분기 및 종료 확률을 분석했습니다. 두 유형 모두 4미크론 미만의 세그먼트에 대해 유사했습니다. 수지상 종결에 대한 층별 분석은 두 가지 뉴런 유형이 서로 다른 층 특이적 방식으로 분포하는 것을 보여주었습니다.

Tm 2 수상돌기는 m2 및 m5 단위로 입력을 받습니다. tm 20 수상돌기는 m1에서 m3 층에서 끝납니다. 평면 분석에 따르면 tm 2 수상돌기는 전방으로 돌출된 반면 tm 20 수상돌기는 후방으로 돌출

이 비디오를 시청한 후에는 두 개의 컨포칼 이미지를 획득하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이미징 파일의 연구 표시를 읽고 이러한 이미지에서 수지상 특성을 추출합니다. 이 절차를 시도하는 동안 컨포칼 이미징 전에 샘플을 적절하게 표시하는 것이 중요합니다.

이미징 중에 샘플이 이동하면 이미징 조합이 실패합니다.