Name: 열 및 레이어에 수지상 형태학 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 배우세요 Drosophila 시각 중추 신경원의 수지상 형태를 3D 이미징과 계산 분석을 통해 연구하는 방법을. 이 기법은 뇌 회로 매핑과 신경 발달 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 아동 건강 및 인간 개발 (C.-HL에 부여 HD008913)의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소, 정보 기술 센터 (PGM, NP, ESM 및 MM).

<ol><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+maps+are+fundamental+to+sensory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Topographic maps are fundamental to sensory processing.</a> Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).</li>
<li>Sanes, J. R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+insect+and+vertebrate+visual+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design principles of insect and vertebrate visual systems.</a> Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).</li>
<li>Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+lamina-specific+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting.</a> CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743(2010).</li>
<li>Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+visual+map%3A+mechanisms+and+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Making a visual map: mechanisms and molecules.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).</li>
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<li>Takemura, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuits+and+their+variations+within+different+columns+in+the+visual+system+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+substrate+of+spectral+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The neural substrate of spectral preference in Drosophila.</a> Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).</li>
<li>Karuppudurai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hard-wired+glutamatergic+circuit+pools+and+relays+UV+signals+to+mediate+spectral+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).</li>
<li>Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+ON+and+OFF+pathways+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system.</a> Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor-derived+activin+promotes+dendritic+termination+and+restricts+the+receptive+fields+of+first-order+interneurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila.</a> Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+R7+axons+in+the+Drosophila+visual+system+is+mediated+both+by+transduction+of+an+activin+signal+to+the+nucleus+and+by+mutual+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion.</a> Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li>
<li>Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuits+of+the+Drosophila+optic+lobe%3A+the+input+terminals+to+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla.</a> J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).</li>
<li>Takemura, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+circuits+integrate+neighboring+visual+signals+in+a+Drosophila+motion+detection+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway.</a> Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+NeuronJ+tracing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of NeuronJ tracing data.</a> Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
<li>Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Measure%3A+a+web-accessible+tool+for+the+analysis%2C+comparison+and+search+of+digital+reconstructions+of+neuronal+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies.</a> Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+Estimation+from+Incomplete+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22JASA%22%5BJournal%5D)">Nonparametric Estimation from Incomplete Observations.</a> JASA. 53, 457-481 (1958).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기, 우리는 어떻게 이미지에와 초파리 수질 뉴런의 수상 돌기 아버 분석을 보여줍니다. 첫번째 섹션 듀얼 뷰 영상은 고해상도 영상 스택에 디컨 볼 루션 두 화상 스택의 조합을 설명한다. 두 번째 섹션, 수지상 추적 및 등록 기준 열 배열에 수질 뉴런의 수상 돌기의 추적 및 등록에 대해 설명합니다. 세 번째 섹션, 수지상 분석, 수지상 패턴을 분석하는 사용자 정의 스크립트의 사용을 설명합니다. 함께 이러한 프로토콜 층 및 컬럼에 대해 돌기 패턴에 대한 정보를 추출하고 수지상 분지 종료하는 주파수를 결정하기 위해 전체 워크 플로우를 제공한다. 여기에 제시된 듀얼 뷰 촬상 방법은 두 개 이상의 이미지 스택 직교 높은 축 resolutio을 달성하기 위해 재결합 수거 된 광 시트 현미경으로 구현 된 멀티 뷰 영상 기술, 개념적으로 유사하다N 17, 18. 그러나,...

개발하는 동안, 복잡하지만 틀에 박힌 분기 패턴에 신경 정교한 수상 돌기들은 시냅스 파트너와 시냅스를 형성한다. 수지상 분기 패턴은 신경 정체성과 기능의 상관 관계. 수지상 복잡성 및 필드 크기는 입력 된 숫자를 관리하면서 수지상 분지 아버의 위치는, 그들이받는 시냅스 입력의 종류를 결정한다. 따라서, 수지상 형태 학적 특성은 시냅스 연결 및 신경 계산을위한 중요한 결정이다. 이러한 비행 광학 로브와 척추 동물의 망막과 같은 복잡한 뇌의 많은 지역에서 시냅스 회로는 정보 처리 (1), (2)를 용이하게하기 위해 열과 층으로 구성되어 있습니다. 이러한 열과 층 조직에서는 뚜렷한 양상 프로젝트 축삭의 시냅스 전 뉴런 특정 층 (소위 계층 특정 타겟팅)에서 종료하고 규칙적인 2 차원 배열을 형성하는 (소위 칼레D 지형도), 시냅스 후 뉴런이 특정 계층에 적절한 크기의 돌기를 확장하면서 정확한 종류와 숫자의 시냅스 입력을받을 수 있습니다. 층 및 컬럼에 타겟팅 축삭 잘 3,4-를 연구 하였지만, 훨씬는 덴 드라이트가 특정 계층에 전달하고 올바른 연접 파트너 5 시냅스 연결을 형성하는 수용 필드를 적절히 확장 크기 방법에 대해 공지되어있다. 이미징 및 층과 열을 대상으로 정량화 수지상의 어려움은 기둥과 적층 뇌 구조에서 수지상 개발의 연구를 방해하고있다. 초파리 수질 신경 세포는 열 및 레이어 수상 라우팅 및 회로 어셈블리를 공부에 이상적인 모델이다. 플라이 수질의 neuropil는 3D 10 층의 격자 약 750 열로 구성되어있다. 각 열은 페이지를 포함하여 구 심성의 집합에 의해 신경 지배한다그 축삭 터미널 계층 별 패션 (6)의 지형도를 형성 L5 - hotoreceptors R7 / R8과 얇은 신경 L1. 수질 신경 세포의 약 38 종류가이 구 심성 (7)로부터 입력을받을 때마다 수질 항목과 특정 계층에 적절한 필드 크기와 정교한 수상 돌기에 존재한다. 수질의 시냅스 회로는 전자 현미경 수준에서 재구성되었다; 따라서, 시냅스 협력이 잘 8 7 설정됩니다. 또한, 수질 신경의 여러 유형의 레이블을 유전 도구 9, 10, 11 가능하다. transmedulla의 세 가지 유형 (TM) 뉴런 (TM2, TM9 및 Tm20)를 검사하여, 우리는 이전에 두 개의 세포 형 특정 수지상 특성을 확인했다 (ⅰ) Tm은 뉴런이 중 전방 또는 후방 방향으로 돌기 프로젝트를 (평면 PROJection 방향) 상기 세포 유형에 따라 및 (ii)의 수질 신경 돌기가 셀 타입 별 패션 (계층 별 종단) (12)에 특정 수질 레이어 종료. 층 및 열 단서 Tm은 반응을 방해 돌연변이가 이러한 속성의 독특한 측면에 영향을 미치는 반면, 평면 형상 돌기 방향과 레이어 별 종단은, Tm은 뉴런의 세 가지 유형을 구별하기에 충분하다. 여기, 우리는 열 및 레이어 (그림 1)에서 초파리 수질 신경 세포의 수지상 패턴을 조사하기위한 완벽한 워크 플로우를 제시한다. 첫째, 두 개의 공 초점 화상을 결합하는 맞춤형 소프트웨어를 사용하는 듀얼 뷰 촬상 방법은 고품질의 이미지를 생성 등방성 스택을 나타낸다. 이 방법은, 초 - 해상도 현미경에 의존하지 않고, 수지상 분기 안정적인 추적을 허용 고품질 이미지를 생성하는데 전용 종래 공 초점 현미경을 필요 이러한의 STED (유도 방출 고갈) 또는 구조적 조명. 둘째, 수지상 아버 트레이싱 및 기준 컬럼 배열 얻어진 돌기 추적을 등록하기위한 방법을 제시한다. 셋째, 수지상 분지와 종단 주파수에 대한 추정치를 유도뿐만 아니라, 평면 형상 돌기 방향과 수지상 층 특정 종단에 대한 정보를 추출하기위한 계산 방법을 나타낸다. 함께, 이러한 방법들은 3D 수지상 모폴로지에 기초하여 세포 형태의 분류에 돌기 패턴의 특성과 돌연변이의 잠재적 결함의 식별을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>버전 16.05</td><td>이미지 디콘볼루션(https://svi.nl).&nbsp;</td></tr><tr><td>이미지 재조합 및 등록(http://mipav.cit.nih.gov/)을 위한</td>상용 소프트웨어<td>MIPAV</td><td></td><td>버전 7.3.0</td>; 프리웨어</tr><tr><td>MIPAV 플러그인: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class</td><td></td><td></td><td>프리웨어</td></tr><tr><td>MIPAV 플러그인: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class</td><td></td><td></td><td>프리웨어</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td> 신경 <td>돌기 추적 및 이미지 등록 (http://www.bitplane.com)을 위한 참조 포인트 할당; swc</td></tr><tr>파일 시각화를 위한 상용 소프트웨어<td>Vaa3D</td><td></td><td></td><td>( https://github.com/Vaa3D/release/releases/); </td></tr><tr><td>수상돌기의 형태 분석을 위한</td>프리웨어<td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2014b</td>(http://www.mathworks.com); 상용 소프트웨어</tr><tr><td>Matlab 도구 상자: 수지상 형태 매개변수 분석을 위한 TREES1.14</td><td></td><td>v1.14</td><td>(http://www.treestoolbox.org/download.html); 프리웨어</td></tr><tr><td>Matlab 도구 상자: Dendritic_Tree_Toolbox</td><td></td><td>v1.0</td><td>형태 측정 매개 변수 (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration)를 계산합니다. 프리웨어</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sample files</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWC file definition</td><td></td><td></td><td>http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html</td></tr><tr><td>이미지 조합 및 정합</td><td></td><td></td>을 위한 코드 및 샘플 파일 <td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration</td></tr><tr><td>참조 포인트 예제&nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Computer system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Windows Windows 7 x64 또는 Macintosh OS X 10.7 이상</td><td></td><td></td><td>3GHz 64비트 쿼드 코어 프로세서, 16G RAM(최소)</td></tr><tr><td>옵션: Quadro4000&nbsp; (또는 그 이상) 수상</td><td>돌기의 입체 시각화를 위한</td> <td>그래픽 카드 Nvidia</td><td></td>.</tr><tr><td>옵션: NVIDIA 3D vision2</td><td>Nvidia</td><td></td><td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html</td></tr><tr><td>옵션: NVIDIA 3D vision2</td><td></td><td></td>용 120Hz LCD 디스플레이 <td>http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html<</td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>코멘트</ 이미징</td></tr><tr><td>용 strong>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24B10 항체</td><td>The Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag 항체</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>G10362</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A21124</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디엄</td><td>벡터 연구소</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>마운팅&nbsp; 점토&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>S04179</td><td></td></tr><tr><td>70% 글리세롤이 1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 안경에 포함되어 있음, 고성능, D = 0.17&nbsp; mm</td><td>자이스</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr></tbody></table>

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

이러한 플라이 눈 돌출부와 척추 피질과 같은 중추 신경계의 여러 영역에서 시냅스 회로 개발 동물 개발 및 정보 처리 동안 뇌 배선을 용이하게하는 층과 열이 구성되어있다. 특정 레이어 유형 특정 패턴의 정교한 수상 돌기 시냅스 후 뉴런은 적절한 시냅스 터미널 시냅스합니다. 플라이 수질의 neuropil 10 층과 약 750 컬럼으로 구성되어; 각 열은 유형 특정 방식으로 구 심성의 일부 7 종류의 축삭 단자와 일치 수질 뉴런의 38 이상 종류의 수상 돌기에 의해 신경 지배된다. 이 보고서는 이미지의 절차를 자세히 설명하고 수질 뉴런의 수상 돌기를 분석 할 수 있습니다. 워크 플로우는 세 부분으로 포함한다 : (I) 듀얼 뷰 촬상 부는 돌기 고해상도 3D 이미지에 직교하는 방향에서 수집 개의 공 초점 화상 스택을 결합하는 단계; (ⅱ) 수상 돌기는 추적 및 등록 섹션은 수지상를 추적3D의 아버와 기준 열 배열 수지상 트레이스 레지스터; (ⅲ) 수지상 분석 부는 수지상 정자 층 특정 종단 및 평면 투영 방향을 포함하여 열 및 층에 대하여 돌기 패턴을 분석하고, 수지상 분지와 종단의 주파수 추정치를 유도한다. 프로토콜은 매트릭스 실험실 언어의 오픈 소스 MIPAV (의료 영상 처리, 분석 및 시각화) 플랫폼 및 사용자 정의 도구 상자에 내장 된 사용자 정의 플러그인을 사용한다. 함께, 이러한 프로토콜은 세포 유형을 확인하고, 돌연변이 체의 결함을 결정하기 위해, 레이어 및 열들 초파리 수질 뉴런의 수지상 경로를 분석하는 전체 워크 플로우를 제공한다.

여기에 제시된 듀얼 뷰 촬상 절차를 이용하여, 성기 표지 Tm20 뉴런을 포함하는 플라이 뇌 개의 직교 방향에 묘화 하였다. 촬상에 앞서, 뇌 막 닿는 GFP와 감광체 축삭 시각화 적절한 일차 및 이차 항체로 염색 하였다. 이미징 뇌 먼저 가로 방향으로 장착 하였다 (도 2A, B). GFP 표지 Tm20 신경 및 주변 감광 축삭은 공 초점 레이저 주사 현미경 (도 3a)을 사용하여 영상화 하였다. 뇌는 (그림 2A, B)을 다시 정렬하고, 같은 Tm20 신경 세포는 정면 방향 (그림 3B)에서 다시 이미지화했다. 이미징 프로세스 동안 Tm20 뉴런의 위치는 오른쪽 수질 neuropil (RV 구성)의 복부 절반 인 것이 확인되었다. 이들 두 개의 화상은 스택 화상 컨벌루션 소프트웨어 및 REC를 사용 하였다 deconvolved재조합 화상 스택 <...

여기, 우리는 열 및 레이어 초파리 수질 신경 세포의 수지상 라우팅을 분석하는 방법을 보여줍니다. 워크 플로우는 추적 기준 열 배열 수지상 아버를 등록하기위한 3 차원 공간에서 수지상 구조를 분석하기위한 이미지 품질과 연산 툴을 개선하기 위해 이중 - 뷰 영상 법을 포함한다.

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 성체 초파리 시각엽(medulla) 뉴런의 기둥 및 층별 수지상 경로를 분석하여 수지상 패턴을 특성화하고, 형태학적 근거로 세포 유형을 결정하며, 돌연변이체를 식별하는 것입니다. 이 방법은 뇌 회로도 작성 및 수지상의 배선 메커니즘 이해를 포함하여 신경과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3차원 공간에서 수지상 특성을 전달함으로써 수지상 배선 논리와 기능에 대한 이해를 향상시킨다는 점입니다.이 실험 절차의 목적은 관심 뉴런의 직교하는 두 방향인 수평 및 전면 방향에서 두 개의 이미지 스택을 획득하는 것입니다. 표준 기술을 사용하여 해부된 초파리 뇌를 rabbit anti-GFP 및 광수용기 축삭을 표지하는 1차 항체로 염색합니다. 그 다음, 형광 2차 항체로 1차 항체를 표지하고 70% glycerol 및 1X PBS에서 뇌를 투명화합니다.뇌를 수평 방향으로 마운팅하려면, 글리세롤로 투명화된 뇌를 현미경 슬라이드 중앙에 떨어뜨린 20 µL의 antifade 마운팅 매질 방울로 옮깁니다. 그런 다음 커버슬립의 네 모서리에 작은 점토 조각을 부착하여 커버슬립이 뇌를 압착하는 것을 방지합니다. 이제 실체 현미경 하에서 뇌의 복측(ventral)이 위를 향하도록 배치합니다.뇌의 볼록한 등쪽 표면을 지표로 삼아 뇌 샘플의 방향을 확인하십시오. 이렇게 하면 뉴런의 수평 뷰를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 커버슬립을 부착하십시오.GaAsP 검출기가 장착된 공초점 현미경을 사용하여, 고개구수 렌즈와 2.5배 디지털 줌으로 수평 뷰 이미지 스택을 얻습니다. 512 x 512 픽셀 해상도와 2 µm의 단계 크기로 최소 180개의 광학 절편을 획득하십시오. 첫 번째 이미지 스택을 촬영한 후, 슬라이드에서 커버슬립을 제거하고 뇌를 전면 뷰가 가능하도록 전측이 위로 향하게 재배치하십시오.그 다음 동일한 기법을 사용하여, 수평 뷰로 촬영한 동일한 뉴런들의 정면 뷰 이미지 스택을 생성하십시오. 이때 연수 뉴로필(medulla neuropil)에 대한 관심 뉴런의 위치도 반드시 기록하십시오. 동일한 뉴런의 식별은 저배율에서 가능합니다.하지만 조직이 너무 깊어 신호가 손실되는 경우에는 뇌의 복측 절반만 촬영하십시오. 또한, 이미지 스택을 검토하여 이미지 획득 중에 샘플이 이동했는지 확인하십시오. 이미지 디컨볼루션(deconvolution) 및 이미지 병합에 관한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다.이 절차의 목적은 신경突起(neurites)를 추적하고 등록을 위한 참조점을 지정하는 것입니다. 먼저 재결합된 이미지 파일을 엽니다. 그런 다음 편집(edit)으로 이동하십시오.그런 다음 디스플레이 조정을 표시하고 적색인 광수용체 채널을 끕니다. 다음으로 surpass 모드에서 이미지를 시각화합니다. 컴퓨터에 스테레오그래프 시스템이 장착되어 있는 경우, 스테레오를 켜고 quad 버퍼 모드를 사용하여 3D 이미지를 시각화합니다.새 필라멘트를 추가하려면 Surpass로 이동하여 Filaments를 선택한 다음, 'skip automatic creation, edit manually'라고 표시된 탭을 클릭하십시오. 그 다음 Draw 탭을 클릭하고 AutoDepth를 선택하십시오. 이어서 Settings를 선택하십시오.선 옵션을 전환하고 시각화 효과를 높이기 위해 적절한 픽셀 수를 입력하십시오. 그런 다음 수지상 돌기, 시작점 및 분기점 표시 옵션을 전환하고 렌더링 품질을 100%로 설정하십시오. 이제 그리기 탭을 선택하고 뉴라이트 추적을 시작하십시오. 축삭부터 시작하여 수지상 돌기로 이동하십시오.trans medulla 뉴런의 축삭과 수지상돌기는 쉽게 구별될 것입니다. 뉴라이트를 추적한 후, 설정으로 돌아가 시작점과 분기점 토글을 모두 해제하십시오. 그런 다음 surpass로 이동하여 내보내기를 수행하십시오.객체를 선택하고 필라멘트를 inventor 파일로 저장합니다. 다음 단계는 참조점을 지정하는 것입니다. 우선, show display adjustment를 선택하고 두 이미징 채널을 모두 켭니다.그다음 surpass로 이동한 후 measurement를 선택하십시오. 그리고 edit 탭 아래에서 specific channel을 활성화하고, 여기서는 photoreceptor 채널을 선택하십시오. 이제 상위 레이어에 대한 기준점을 지정하십시오.Surpass를 선택한 다음 측정 지점(measurement points)을 선택하고, m1 층의 시작 부분을 상층으로 표시합니다. 지점 할당을 용이하게 하려면 클리핑 평면(clipping plane) 기능을 사용하십시오. 지점의 순서는 적도, 전적도, 전방, 전복측, 복측, 후복측, 후방, 후적도 및 중심 순입니다.중심 광수용기를 찾으려면, 가장 많은 수지상 돌기와 연결된 것을 선택하십시오. 다음으로 동일한 기술을 사용하여 R8 및 R7 층의 기준점을 지정하십시오. 각 기준점 세트를 정의한 후 좌표를 내보내십시오.통계(statistics)를 선택한 다음, 상세(detailed), 특정 값(specific values) 및 위치(position)를 선택하십시오. 그런 다음 탭 표시(tab display)에서 통계 내보내기(export statistics)를 선택하고 좌표를 CSV 파일로 저장하십시오. 다음으로 스프레드시트 편집기에서 세 개의 CSV 파일을 엽니다.상단, R8, R7의 순서에 따라 27개 참조 점의 좌표를 새 파일에 복사하여 붙여넣으십시오. 수지상 분지 및 종단 빈도 계산을 위한 우측 복측 구성으로의 강체 및 TPS 비선형 등록 표준화 텍스트 프로토콜을 따라 진행하십시오. 최종적으로, 이 데이터는 다양한 정보 제공용 도표를 만드는 데 사용됩니다. 본 연구에서 제시한 듀얼 뷰 이미징 절차를 사용하여, 희소하게 표지된 tm 20 뉴런이 포함된 초파리 뇌를 두 개의 직교 방향에서 이미징하였습니다.이미지 재결합은 축 방향 해상도를 향상시킵니다. 재결합된 이미지는 수평 뷰 및 정면 뷰 이미지보다 더 우수한 해상도를 갖습니다. 3D 모델을 참조하여 15 tm 20 뉴런에서 수지상 돌기 추적 데이터를 수집하고, 이를 15 tm 2 뉴런의 수지상 돌기 추적 데이터와 비교하였습니다.이들 뉴런의 분지 및 종결 확률을 분석하였습니다. 4 µm 미만의 분절에 대해서는 두 유형이 모두 유사했습니다. 수지상 돌기 종결의 층별 분석 결과, 두 뉴런 유형이 서로 뚜렷하게 구별되는 층 특이적 방식으로 분포한다는 것이 확인되었습니다.Tm 2 수지상돌기는 m2와 m5에서 입력을 받습니다. 반면 tm 20 수지상돌기는 m1에서 m3 층에서 끝납니다. 평면 분석 결과, tm 2 수지상돌기는 앞쪽으로 투사되는 반면, tm 20 수지상돌기는 뒤쪽으로 투사되는 것으로 나타났습니다.이 영상을 시청한 후, 두 개의 공초점 이미지를 획득하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이미징 파일에 표시된 연구 마크를 읽고 이 이미지들로부터 수지상 돌기 특성을 추출하십시오. 이 절차를 수행할 때, 공초점 이미징 전에 샘플을 적절하게 표시하는 것이 중요합니다.이미지 촬영 중 시료가 이동하면 이미지 조합에 실패하기 때문입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

많은 최근의 연구는 뇌 pathologies와 관련된 시냅스 단백질에 돌연변이가 확인되었습니다. 기본 교양 피질 뉴런이 돌기 척추의 형태와 운동성에서 이러한 질병 관련 단백질의 영향을 조사 큰 유연성을 제공합니다.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

우리는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에서 자란 개별 Purkinje 세포의 수지상 나무의 형태를 확인하고 양적 엉덩이에 할 수 있습니다 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 Purkinje 세포 수지상 개발의 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기위한 것입니다.

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

출처: Ting, C., et al., 열과 층의 수지상 형태 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 초파리 뇌를 준비하고, 공초점 현미경으로 GFP 표지 수질 수상돌기의 수평 및 정면 이미지 스택을 캡처하고, 층과 열에 걸쳐 형태를 분석하기 위한 3D 재구성을 생성하는 절차를 보여줍니다.

Drosophila Medulla 층과 기둥에 걸친 수지상 형태 분석

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

여기서 우리는 Golgi-Cox 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 신뢰할 수있는 조직 얼룩 방법은 최소한의 문제 해결과 함께 해마 및 전체 뇌에 걸쳐 cytoarchitecture의 높은 품질 평가를 허용합니다.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

이 프로토콜에서 초파리, 수지상 morphogenesis의 연구를 위해 사용 될 수 있는 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)의 정량 분석에 집중 한다.

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

신경 수지상 형태는 종종 기능의 근간을 이수합니다. 실제로, 뉴런의 발달에 영향을 미치는 많은 질병 프로세스는 형태학적 표현형으로 나타납니다. 이 프로토콜은 그대로 수지상 식소및 연관된 척추를 분석하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다.

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

제시된 것은 2D 형광 심상에서 신경 수지상 분기의 방향을 간단하고 직접 자동적으로 측정할 수 있는 계산 도구입니다.

수지상 가지 및 방향자동 식별

수지상 가시는 대부분의 흥분성 시냅스의 시냅스 후 구획입니다. 수지상 척추 형태의 변화는 신경 발달, 노화, 학습 및 많은 신경 및 정신 장애 중에 발생하며, 이는 신뢰할 수 있는 수지상 척추 분석의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용하여 수상돌기 척추 형태를 정확하고 재현성 있게 정량화하는 방법을 설명합니다.

자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

배우세요 Drosophila 시각 중추 신경원의 수지상 형태를 3D 이미징과 계산 분석을 통해 연구하는 방법을. 이 기법은 뇌 회로 매핑과 신경 발달 연구에 활용됩니다.

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

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