마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

이 실험의 전반적인 목표는 특수 미세유체 장치를 제작하여 단일 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 모세포가 노화하고 사멸하는 이유와 세포 항상성의 상실 및 결국 세포 노화와 사멸을 유도하는 초기 분자적 사건은 무엇인가와 같은 효모 노화 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모세포를 추적하면서 수명과 다양한 분자 마커를 동시에 추적할 수 있어, 수명과 상관관계가 있는 분자적 사건을 탐색할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 효모의 노화에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 여러 세대에 걸친 세포 확인이 필요한 자극에 대한 2차 반응 모니터링과 같은 다른 분야에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사용자는 미세유체 장치 제작, 세포 로딩, 현미경 설정 등을 성공적으로 수행하기 위해 많은 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 미세유체 장치에 효모를 적절하게 로딩하는 것이 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 사전 시연이 매우 중요합니다.

먼저, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 표준 기술을 사용하여 장치를 위한 실리콘 웨이퍼 몰드를 제작하십시오. 몰드의 특징부가 위를 향하도록 15 centimeter 페트리 접시에 놓습니다. 테이프를 사용하여 페트리 접시 위에 몰드를 고정하십시오.

다음으로 깨끗한 weighing boat를 저울 위에 놓고 저울을 영점 조절합니다. weighing boat에 PDMS base 50 grams를 붓고, 이어서 PDMS curing agent 5 grams를 추가합니다. 일회용 피펫을 사용하여 PDMS base와 curing agent를 혼합합니다.

무게 측정 보트의 가장자리부터 시작하여 천천히 안쪽으로 이동합니다. 혼합물 전체에 작은 기포가 형성될 때까지 수분 동안 충분히 교반합니다. 혼합물을 페트리 접시에 천천히 부어 실리콘 웨이퍼 몰드를 완전히 덮이게 합니다.

그런 다음 페트리 접시를 진공 상태로 10분 동안 두어 PDMS 혼합물에서 모든 기포를 제거합니다. 진공 상태에서 꺼낸 후에도 혼합물 표면에 기포가 남아 있다면, 피펫을 사용하여 기포를 불어내어 제거합니다. 다음으로, 장치를 75 °C에서 2시간 동안 굽습니다.

실온으로 다시 냉각되면, 몰드 주변의 PDMS를 조심스럽게 자른 다음 실리콘 웨이퍼 몰드의 구조가 손상되지 않도록 주의하며 중합된 PDMS 층을 웨이퍼 몰드에서 천천히 떼어냅니다. PDMS 층의 패턴 면이 위로 향하게 하여 벤치 위에 놓습니다. 단일 엣지 산업용 면도날을 사용하여 개별 칩을 조심스럽게 잘라내되, 구조적 손상을 방지하기 위해 각 개별 칩의 가장자리에서 적절한 여백을 유지하십시오.

패턴 면이 위를 향하게 한 상태에서, 펀치 펜을 사용하여 채널 양측의 입구 및 출구 원형 표시 부분을 수직으로 뚫어 구멍을 냅니다. 펀치 펜 바늘을 구멍에 다시 넣어 각 구멍을 확인하십시오. 바늘이 반대편으로 나올 수 있는지 확인하여 막힌 곳이 없는지 점검합니다.

다음으로 테이프를 사용하여 상단 표면의 먼지 입자와 이물질을 제거합니다. 이 단계를 최소 3회 반복하고, 먼지가 없는 표면을 유지하기 위해 깨끗한 스카치테이프 조각을 PDMS 위에 붙여둡니다. 그런 다음 장치를 뒤집어 PDMS의 반대편에도 동일한 절차를 반복합니다.

이쪽 면의 마지막 테이프 조각도 그대로 둡니다. 이제 장치의 바닥면이 될 유리 표면을 준비합니다. 두께가 13에서 17 mm 사이인 24 mm x 30 mm 크기의 커버 글라스를 선택하십시오.

유리에 70% ethanol을 분사하고, 먼지 제거기로 닦아 표면을 멸균합니다. 그다음 커버 글라스와 PDMS를 플라스틱 플레이트로 옮깁니다. PDMS에서 스카치테이프를 제거하고, 윗면에 닿지 않도록 패턴 면이 위를 향하게 하여 플레이트에 놓습니다.

그 다음 플레이트를 플라즈마 챔버로 옮깁니다. PDMS와 커버 글라스 표면을 친수성으로 만들기 위해 산소 플라즈마 처리를 수행합니다. 이후 플레이트를 플라즈마 챔버에서 꺼내어 플라즈마 처리된 PDMS 표면과 커버 글라스 표면을 조심스럽게 접합합니다.

PDMS와 커버 글라스 사이에 기포가 없는지 확인하십시오. 마지막으로, 장치를 오븐으로 옮겨 75 °C에서 최소 2시간 동안 베이킹합니다. PDMS 칩 준비 하루 전에 입구 및 출구 튜브를 70% ethanol 용액에 담가 두십시오.

다음 날, 5 mL 주사기에 오토클레이브 멸균된 물을 채운 후, 튜브를 주사기에 고정하고 물로 씻어내어 각 튜브를 세척합니다. 잔류 에탄올을 제거하기 위해 이 세척 단계를 최소 3회 반복합니다. 그다음 광학 현미경으로 PDMS 채널을 관찰합니다.

10 X 대물렌즈를 사용하여 구조가 일관되고 온전한지 확인하십시오. 온전한 PDMS 칩을 스카치테이프를 사용하여 현미경 플랫폼 위에 고정합니다. 멸균수가 충전된 5 mL 시린지를 시린지 펌프에 고정하고, 해당 입력 및 출력 튜브를 장치에 삽입하십시오.

유량을 750 µL/h로 설정하고 칩을 약 10분 동안 세척합니다. 채널을 관찰하여 기포가 모두 제거되었는지 확인하십시오. 10분간의 세척 후에도 기포가 남아 있는 경우, 속도를 수동으로 조절하여 기포를 제거하십시오.

준비된 효모 샘플 1 mL를 두 개의 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 3,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 각 튜브에서 상층액의 대부분을 제거하고 남은 부분을 합쳐 5 mL 샘플을 만듭니다. 효모 샘플이 준비되면 PDMS 칩에서 입력 튜브를 제거합니다. 시린지 펌프를 수동으로 역회전시켜 각 입력 튜브에 1~2 cm 길이의 작은 공기 방울을 흡입한 다음, 세포 배양액을 흡입합니다.

그 다음 입력 튜브를 PDMS 칩에 다시 삽입하고 펌프를 재가동하여 750 µL/h의 속도로 세포를 로딩합니다. 시린지 펌프를 10분 동안 작동시킨 후 현미경으로 세포 로딩 진행 상황을 확인합니다. 로딩이 성공적이면 서스펜드 필러(suspend pillar)의 60% 이상에 세포가 포집됩니다.

효모 세포를 유지하려면 시린지의 용액을 영양 용액으로 교체하고 속도를 400 microliters per hour로 조정하십시오. 포획된 각 모세포에서 생성된 출아 수의 측정과 Kaplan-Meier 추정량 산출을 통해 효모의 수명 표현형을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 장치는 이미 포획된 세포에서 출아한 새로운 딸세포를 빈번하게 포획합니다.

이 세포들은 이후 새로운 모세포로 변하며, 이는 다운스트림 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 식별할 수 있습니다. 이러한 새로운 모세포는 더욱 정확한 수명 측정을 가능하게 합니다. 본 실험에서 새로운 모세포의 평균 수명은 약 2세대 정도 약간 더 길었습니다.

출아 수뿐만 아니라, 두 번의 연속적인 출아 이벤트 사이의 시간 간격 또한 이미징 데이터에서 추출할 수 있습니다. 수명이 다해갈수록 출아 속도가 급격히 느려지며, 이는 노화된 세포의 건강하지 못한 상태를 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때는 기포 발생을 방지하기 위해 갓 제작한 칩을 사용하고, 필요에 따라 세포 로딩 효율을 높이기 위해 세포 농도를 증가시켜야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술의 개발 이후, 효모 노화 분야의 연구자들은 노화 표현형의 원인이 되는 초기 분자 변화를 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이 미세유체 장치를 제작하는 방법과 이를 이용하여 단일 세포의 수명 및 세포 표현형을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.