2017년 3월 30일
이 문서에서는 마이크로 유체 칩의 생산과 수명 및 단일 효모 세포의 세포 표현형을 측정하는 미세 유체 실험의 설정에 최적화 된 프로토콜을 제공한다.
이 실험의 전반적인 목표는 특수 미세유체 장치를 만들어 단일 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는 데 사용하는 것입니다. 이 방법은 모세포가 노화하고 죽는 이유, 세포 항상성 상실을 유발하고 결국 세포 노화 및 사멸을 유발하는 초기 분자 사건은 무엇인지와 같은 효모 노화 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 모 세포를 추적하고, 모세포의 수명과 다양한 분자 마커를 동시에 추적할 수 있으므로 수명과 관련된 분자 이벤트를 찾을 수 있다는 것입니다.
이 방법은 효모 노화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 여러 세대에 걸쳐 세포 확인이 필요한 참여에 대한 2차 반응을 모니터링하는 것과 같은 다른 영역에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 미세유체 장치 제조, 세포 로딩, 현미경 설정이 성공적으로 수행하기 위해 많은 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 이전 시연은 microfluidic 장치에 효모를 적절하게 로드하기 어렵기 때문에 중요합니다.
먼저 함께 제공되는텍스트 프로토콜에 설명된 표준 기술을 사용하여 장치용 실리콘 웨이퍼 몰드를 제작합니다. 특징면이 위로 향하게 하여 15cm 페트리 접시에 놓습니다. 페트리 접시의 곰팡이를 테이프로 고정합니다.
다음으로 깨끗한 계량 보트를 저울에 놓고 저울을 찢습니다. 50g의 PDMS 베이스를 계량 보트에 붓고 5g의 PDMS 경화제를 첨가합니다. PDMS 베이스와 경화제를 일회용 피펫으로 저어줍니다.
계량 보트의 가장자리에서 시작하여 천천히 안쪽으로 이동합니다. 혼합물 전체에 작은 거품이 형성될 때까지 몇 분 동안 혼합물을 철저히 저어줍니다. 혼합물을 페트리 접시에 천천히 붓습니다., 실리콘 웨이퍼 몰드를 완전히 덮도록.
그런 다음 페트리 접시를 진공 상태에서 10분 동안 넣어 PDMS 혼합물에서 모든 기포를 제거합니다. 진공 상태에서 제거한 후 혼합물 표면에 기포가 남아 있으면 피펫을 사용하여 불어냅니다. 그런 다음 장치를 섭씨 75도에서 2시간 동안 굽습니다.
다시 실온으로 냉각되면 금형 주위의 PDMS를 조심스럽게 절단한 다음 실리콘 웨이퍼 몰드에서 중합된 PDMS 층을 부드럽게 벗겨내어 웨이퍼 몰드 구조에 대한 손상을 방지합니다. 패턴 면이 위를 향하도록 하여 PDMS 레이어를 벤치에 놓습니다. 단일 모서리 산업용 면도날로 개별 칩을 조심스럽게 잘라내고 구조적 손상을 방지하기 위해 각 단일 칩의 가장자리에서 적절한 여백을 유지하십시오.
패턴 면이 위를 향하게 하여 펀치 펜을 사용하여 채널의 각 측면에 있는 입구 및 출구 원을 통해 똑바로 아래로 구멍을 뚫습니다. 펀치 펜 바늘을 구멍에 다시 삽입하여 각 구멍을 확인합니다. 바늘이 반대쪽에서 나올 수 있는지 확인하여 막힌 부분이 없음을 나타냅니다.
그런 다음 테이프를 사용하여 상단 표면에서 먼지 입자와 부스러기를 청소합니다. 이 단계를 최소 세 번 반복하고 PDMS에 깨끗한 스카치 테이프를 남겨 먼지가 없는 표면을 유지합니다. 그런 다음 디바이스를 뒤집고 PDMS의 반대쪽 사이트에서 이 절차를 반복합니다.
마지막 테이프 조각도 이쪽에 남겨 두십시오. 이제 장치 바닥의 유리 표면을 준비합니다. 두께가 13mm에서 17mm 사이인 24mm x 30mm 커버 유리 조각을 선택합니다.
유리에 70% 에탄올을 뿌리고 먼지 제거제로 건조시켜 표면을 살균합니다. 그런 다음 커버 유리와 PDMS를 플라스틱 플레이트로 옮깁니다. PDMS에서 스카치 테이프를 제거하고 상단 표면에 접촉하지 않고 패턴 면이 위를 향하도록 플레이트에 놓습니다.
그런 다음 플레이트를 플라즈마 챔버로 옮깁니다. PDMS와 커버 유리에 산소 플라즈마 처리를 적용하여 표면을 친수성으로 만듭니다. 그런 다음 플라즈마 챔버에서 플레이트를 제거하고 PDMS의 플라즈마 처리 표면을 커버 유리에 조심스럽게 연결합니다.
PDMS와 커버 유리 사이에 기포가 없는지 확인합니다. 마지막으로 장치를 오븐으로 옮기고 섭씨 75도에서 최소 2시간 동안 굽습니다. PDMS 칩을 준비하기 하루 전에 입력 및 출력 튜브를 70% 에탄올 용액에 담그십시오.
다음 날 5ml 주사기에 오토클레이브 물을 채우고 튜브를 주사기에 놓고 튜브를 물로 씻어 각 튜브를 세척합니다. 세척 단계를 최소 3회 반복하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 다음으로 광학 현미경으로 PDMS 채널을 검사합니다.
10 X 대물렌즈를 사용하여 구조가 일관되고 손상되지 않았는지 확인합니다. 스카치 테이프를 사용하여 현미경 플랫폼에서 손상되지 않은 PDMS 칩을 안정화합니다. 멸균수가 적재된 5ml 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 해당 입력 및 출력 튜브를 장치에 삽입합니다.
유량을 시간당 750마이크로리터로 설정하고 약 10분 동안 칩을 헹굽니다. 채널을 관찰하여 기포가 씻겨 나갔는지 확인하십시오. 10분 헹굼 후에도 거품이 남아 있으면 수동으로 속도를 조정하여 거품을 제거하십시오.
준비한 효모 표본의 1 밀리리터를 2개의 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관으로 옮기고 3, 000 시간 G.Remove에 5 분 동안 표본을 5 밀리리터 표본을 형성하기 위하여 대다수 상등액을 결합하고 5개 밀리리터 표본을 형성하기 위하여 나머지를 결합하십시오. 이제 효모 샘플이 준비되면 PDMS 칩에서 입력 튜브를 제거합니다. 주사기 펌프를 수동으로 역으로 하여 길이가 1-2cm인 작은 기포와 각 입력 튜브를 흡입한 다음 세포 배양을 흡입합니다.
그런 다음 입력 튜브를 PDMS 칩에 다시 삽입하고 펌프를 다시 시작하여 시간당 750마이크로리터의 속도로 셀을 로드합니다. 주사기 펌프를 10분 동안 켜둔 다음 현미경으로 세포 로딩 진행 상황을 검사합니다. 성공적으로 로드하면 셀이 60% 이상의 suspend pillar 아래에 갇히게 됩니다.
효모 세포를 유지하려면 주사기의 용액을 영양 용액으로 전환하고 속도를 시간당 400마이크로리터로 조정하십시오. 효모의 수명 표현형은 포획된 각 모세포에서 생성되는 새싹의 수를 세고 Kaplan-Meier 추정기를 추정하여 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 이 장치는 이미 포획된 세포에서 싹을 틔운 새로운 딸 세포를 자주 포획합니다.
그런 다음 이러한 세포는 다운스트림 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 식별할 수 있는 새로운 모세포로 바뀝니다. 이 신선한 모세포는 보다 정확한 수명 측정을 제공합니다. 이 실험에서 신선한 모 세포의 평균 수명은 약 2세대 정도 약간 더 길었습니다.
새싹의 수 외에도, 두 개의 연속적인 싹 틈 이벤트 사이의 시간 간격은 이미징 데이터에서 추출할 수 있습니다. 싹이 트는 것은 수명이 다할 때까지 급격히 느려지며 이는 이러한 노화된 세포의 건강하지 않은 상태를 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 기포를 방지하는 데 도움이 되도록 새로 만든 칩을 사용하고 필요할 때 세포 로딩 효율을 개선하기 위해 세포 농도를 높이는 것을 모두 기억하는 것이 중요합니다.
개발 후 이 기술은 효모 노화 분야의 연구자들이 노화 표현형의 원인이 되는 초기 분자 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 미세유체 장치를 만드는 방법과 이를 사용하여 단일 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 단일 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하기 위한 특수한 미세유체 장치를 만드는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 효모 노화 분야의 주요 질문, 특히 모체 세포의 노화 과정에 대한 질문에 답하는 것을 목표로 합니다.
This microfluidic approach enables high-resolution, longitudinal tracking of single-cell aging dynamics, providing mechanistic insights into cellular homeostasis loss that can inform target validation in aging-related pathways. By correlating molecular markers with lifespan outcomes in a controlled microenvironment, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing for conserved longevity mechanisms. Its scalability across strains and conditions positions it as a reusable discovery platform for de-risking therapeutic targets in age-associated diseases.
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven aging research that informs lead identification through phenotypic anchoring of molecular targets.