바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

이 전도도 측정 바이오센서 분석의 전반적인 목표는 하이브리드 베타-락타마제 기술을 사용하여 생체 분자 상호 작용을 감지하는 것입니다. 우리는 키메라 베타-락타마제 단백질을 사용하여 항체 항원 상호 작용을 감지하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 원리는 베타-락타마제 활성의 양성자 방출을 측정하여 결합을 감지하는 데 의존합니다.

기존 면역 센서에 비해 이 기술의 주요 장점은 키메라 베타-락타마제(chimeric beta-lactamase)를 사용한다는 점이며, 하이브리드 단백질을 사용하여 분석물을 검출함으로써 더 저렴하고 빠른 감각 분석을 할 수 있으며, 이 절차를 시연하는 것은 대학원 연구원인 Mathieu Dondelinger가 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 샘플 및 용액 준비로 이 절차를 시작합니다. 전극 준비 용액 웰당 300마이크로리터가 들어 있는 96웰 플레이트의 웰에 팁을 실온에서 부드럽게 혼합하면서 2분 동안 담궈 재사용 가능한 전극을 준비합니다.

이 단계를 세 번 반복합니다. 그런 다음 실온에서 부드럽게 혼합하면서 2분 동안 증류수 웰당 300마이크로리터가 들어 있는 96웰 플레이트의 웰에 팁을 담궈 전극을 헹굽니다. 전극을 재생하려면 재생 용액 웰당 300마이크로리터가 들어 있는 96웰 플레이트의 웰에 팁을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 1시간 동안 담그십시오.

그런 다음 인산염 완충 식염수 웰당 300마이크로리터가 들어 있는 96웰 플레이트의 웰에 팁을 담궈 전극을 세 번 세척합니다. 실온에서 부드럽게 혼합하여 2분 동안 세탁할 때마다 수행합니다. 인산염 완충액에서 준비된 HEWL 밀리리터당 40마이크로그램의 15마이크로리터 방울을 전극 표면에 증착하여 암탉-달걀-흰색 라이소자임을 전극의 폴리아닐린 표면에 코팅합니다.

전극을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 센서 칩의 전극 부분을 인산염 완충액 웰당 300마이크로리터를 포함하는 96웰 플레이트의 웰에 담궈 인산염 완충액으로 전극을 3회 세척합니다. 실온에서 부드럽게 혼합하여 2분 동안 세탁할 때마다 수행합니다.

전극 표면에 차단 용액을 30마이크로리터 방울 떨어뜨려 전극을 포화시킵니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 이전과 같이 세 번 씻습니다.

결합 완충액에서 BlaP-cAb-Lys3 또는 BlaP 용액을 밀리리터당 20마이크로그램으로 희석합니다. 그런 다음 이 희석된 용액을 15마이크로리터 방울 떨어뜨려 전극에 바르십시오. 전극을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

항원 나노바디 반응 후 세척액으로 전극을 세 번 세척합니다. 그런 다음 검출 버퍼 웰당 96마이크로리터가 들어 있는 300웰 플레이트의 웰에 전극을 담궈 검출 버퍼에서 센서의 전극을 세척합니다. 그리고 1분 동안 짧게 배양합니다.

감지를 위해 디지털 멀티미터를 컴퓨터에 연결하십시오. 그런 다음 구리 회로 부분을 통해 센서 칩을 디지털 멀티미터에 연결합니다. 포지티브 표지된 전극에 4밀리몰 벤질페니실린 용액을 50마이크로리터 방울 떨어뜨려 센서 반응을 시작합니다.

검출 용액을 음극 표지된 전극에 50마이크로리터 방울 떨어뜨려 음성 대조군 역할을 합니다. 연결된 디지털 멀티미터로 30분 동안 컨덕토미터 값을 모니터링합니다. 데이터를 화면에서 직접 실시간으로 시각화하거나 디지털 데이터를 텍스트 파일로 내보낼 수 있습니다.

이러한 원시 데이터는 시간에 대한 기준 전극과 샘플 전극 사이의 전도도 변화 측정값을 나타내는 그래픽 출력을 생성하기 위해 플롯할 수 있습니다. 키메라 단백질을 구성하기 위해 클래스 A 베타-락타마제 BlaP를 운반체 단백질로 사용했습니다. 여기서 촉매 잔류물은 빨간색으로 표시됩니다.

용매에 노출된 루프에 위치한 삽입 부위는 노란색으로 표시됩니다. cAb-Lys3라는 camelid 항체 단편을 BlaP에 삽입했습니다. 그 결과 생성된 키메라 단백질인 BlaP-cAb-Lyse3는 베타-락타마제 활성이 유지되는 동안 HEWL에 결합할 수 있습니다.

HEWL은 BlaP-cAb-Lys3를 로드하기 전에 폴리아닐린 코딩 전극에 고정되었습니다. 고정된 키메라 단백질에 의한 벤질페니실린 가수분해 시 양성자가 방출되면 사용자가 해석할 수 있는 전도도 변화를 유도합니다. 센서에는 4쌍으로 구성된 8개의 칩이 포함되어 있습니다.

각 칩에는 3개의 전극, 1개의 폴리아닐린 코팅 작업 전극, 1개의 기준 전극 및 1개의 상대 전극이 포함됩니다. 각 쌍에 대해 negative라고 표시된 칩은 negative control에 해당하고 positive라고 표시된 chip은 테스트된 샘플에 해당합니다. 여기에 표시된 것은 BlaP-cAb-Lys3와 HEWL의 특정 상호 작용을 보여주는 컨덕턴스 측정값입니다.

전도도 변화는 고정된 키메라 베타-락타마제에 의한 항생제 가수분해에 의해 유도된 양성자 방출로 인해 발생합니다. 음성 대조군인 네이티브 베타-락타마제 BlaP에 대한 결합은 검출되지 않았습니다. 일단 숙달되면 이 기술이 제대로 수행되고 실험 조건이 최적화되면 하루 1/2 만에 완료할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 BlaP에 항체 조각을 삽입하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 생성된 데이터의 품질은 키메라 베타-락타마제의 기능에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 이 상호 작용의 평형 연관 상수를 결정하기 위해 검출된 상호 작용의 정량화를 허용하는 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 면역 바이오센서 분야의 연구자들이 살아있는 유기체에서 다양한 환경에 이르기까지 다양한 샘플에서 분자 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 기술의 의미는 키메라 베타-락타마제 기술이 주요의 항체 또는 단백질 단편을 기능화하는 다목적 도구이기 때문에 수많은 생체 분자의 검출로 확장됩니다. 따라서 인간 및 동물 건강과 같은 수많은 분야에서 저렴하고 빠른 진단 도구를 개발하는 데 사용할 수 있습니다.