펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

본 프로토콜의 전체적인 목적은 순차적으로 절단된 재조합 단백질과 닷 블롯 하이브리다이제이션(dot-blot hybridization)을 이용한 펩타이드 스캐닝을 통해 단일클론 항체가 인식하는 선형 B 세포 에피토프(linear B-cell epitope)를 식별하는 것입니다. 이 방법은 항원과 항체 사이의 분자 상호작용에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단순성과 효율성입니다.

이렇게 확인된 에피토프는 치료 및 진단 응용 분야와 같은 보다 광범위한 연구에 활용될 수 있습니다. 본 절차의 시연은 제 실험실의 박사 후 연구원인 Chien-Wen Chen이 진행하겠습니다. 먼저, 하이브리드 무혈청 배지에서 RGM56 마우스 단일클론 하이브리도마 세포를 배양하십시오.

세포 배양물을 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 175 T 플라스크에서 유지합니다. 5일간 배양 후, 배지가 노란색으로 변하면 배양액을 수집하고 상층액을 4°C에서 4,500 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 그 후, 펠렛 형태의 세포 잔해를 제거하여 용액 상태의 항체를 얻습니다.

다음으로, 5mL 컬럼에 50% protein G agro slurry 2mL를 넣고, 미리 충전된 레진 부피의 10배에 해당하는 ice cold PBS 10mL로 레진을 평형화합니다. 평형화된 컬럼에 이전에 준비한 항체 용액 200mL를 로딩하고, 컬럼을 통과하여 나오는 분획은 버립니다. ice cold PBS 10mL를 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다.

마지막으로, 레진에서 항체를 용출시키기 위해 pH 2.7의 밀리몰 농도 글리세린 용액 10 milliliters를 컬럼에 첨가합니다. 이전에 10X 중화 버퍼 100 microliters를 채워둔 마이크로원심분리 튜브에 900 microliter 분획물을 수집합니다. 정제된 항체는 sodium azide가 첨가된 50% glycerol 용액에 넣어 minus 20 degrees Celsius에서 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 컨스트럭트를 준비하고 E.coli BL21 세포를 형질전환합니다. 그 다음, 100 µg/mL ampicillin이 첨가된 LB 배지 3 mL가 들어 있는 15 mL 튜브에 단일 콜로니를 옮기고 튜브 캡을 느슨하게 닫습니다. 배양액을 37 °C에서 150 RPM으로 흔들어 배양합니다.

600 nm에서 배양액의 광학 밀도를 측정합니다. 광학 밀도가 약 0.6에 도달하면, 배양액을 25 °C로 냉각합니다. 그 다음, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해 0.4 mM의 최종 농도가 되도록 IPTG를 첨가합니다.

배양액을 25 °C에서 200 RPM으로 흔들어주며 4시간 더 배양합니다. 배양 후, 박테리아 배양액 1 mL를 마이크로원심분리 튜브에 옮깁니다. 세포를 12,000 ×g에서 1분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.

마이크로피펫으로 피펫팅하여 세포 펠렛을 100 µL의 변성 버퍼에 재현탁합니다. 생성된 현탁액을 격렬하게 볼텍싱하여 혼합함으로써 즉시 사용할 수 있는 재조합 단백질 샘플을 준비합니다. 닷 블롯 하이브리드화를 진행하기 위해, 각 합성 펩타이드를 DMSO에 녹여 10 mg/mL 용액으로 만듭니다.

그 다음, PVDF 막을 메탄올에서 2분 동안 활성화하고, modified Towbin 버퍼로 2분 동안 추가로 평형화합니다. 크로마토그래피 용지를 modified Towbin 버퍼로 헹군 후, 평형화된 PVDF 막을 그 위에 올립니다. 막 표면에서 버퍼가 사라질 때까지 그대로 둡니다.

10 µL 팁을 사용하여 각 펩타이드 또는 재조합 단백질 샘플 2 µL를 멤브레인 위에 첨가하고 10분 동안 자연 건조시킵니다. 멤브레인에 샘플을 점적하는 것은 본 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. PVDF 멤브레인의 작은 영역에 정확한 양의 샘플을 로딩하려면 세심한 주의가 필요합니다.

다음으로, 5% nonfat milk가 첨가된 TBST 버퍼를 사용하여 상온에서 30분 동안 가볍게 흔들어주며 멤브레인을 블로킹합니다. 5% nonfat milk가 첨가된 TBST 버퍼로 RGM56 단일클론 항체를 희석합니다. 그리고 항체 용액을 멤브레인에 첨가합니다.

완만한 진탕과 함께 37°C에서 1시간 동안 막을 배양합니다. 배양 후 항체 용액을 제거합니다. 그 후 완만한 진탕과 함께 TBST 버퍼로 5분 동안 막을 두 번 세척합니다.

그 다음, 5% 탈지분유가 포함된 TBST 버퍼에 희석한 2차 항체 용액을 막에 첨가합니다. 부드럽게 흔들어주며 37°C에서 1시간 동안 막을 배양합니다. 배양이 끝나면 항체 용액을 제거하고, 부드럽게 흔들어주며 TBST 버퍼로 막을 5분씩 두 번 세척합니다.

그 다음, 상온의 암실에서 기질 용액을 이용하여 15분 동안 멤브레인을 발색시킵니다. 신호가 나타나면 2차 증류수로 멤브레인을 세척하여 반응을 중단시킵니다. 멤브레인을 공기 중에서 건조시킨 후, 이미징 시스템을 사용하여 도트 블롯 이미지를 캡처합니다.

마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 도트-블롯(dot-blot)의 강도를 측정합니다. 여기에는 1번부터 338번 아미노산으로 구성된 전체 길이의 nervous necrosis virus 외피 단백질과 그 순차적 절단 변이체들이 제시되어 있습니다. 형질전환된 박테리아 세포 내 단백질 발현을 확인하기 위해 anti-6XHis 항체를 이용한 도트-블롯 분석을 수행하였으며, 조사 대상인 모든 단백질이 존재함을 확인하였습니다.

그 다음, RG-M56 단클론 항체를 이용한 dot-blot hybridization으로 재조합 단백질을 분석하였습니다. 분석 결과, 해당 항체가 인식하는 단백질 에피토프가 펩타이드 195~338 영역에 존재하는 것으로 나타났습니다. 최종적으로, 펩타이드 스캐닝을 통해 20개 또는 8개의 아미노산 잔기로 구성된 에피토프를 식별하였습니다.

알라닌 스캐닝(Alanine scanning) 결과, 197번과 199번 위치의 발린(valine) 잔기 및 201번 위치의 시스테인(cystine)을 치환했을 때 에피토프의 결합 능력과 닷 블롯(dot-blot) 하이브리다이제이션이 소실되는 것으로 나타났습니다. 이와 유사하게, 결합 강도 분석에서도 결합 친화도의 감소가 관찰되었으며, 이를 통해 확인된 잔기들이 RGM56 단클론 항체에 대한 에피토프 결합에 필수적임을 확인하였습니다. 이러한 펩타이드 식별 기술은 치료용 펩타이드 약물 또는 펩타이드 의약품 개발에 활용될 수 있습니다.