Name: 펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 단클론 항체가 인식하는 선형 B세포 에피토프를 펩타이드 스캐닝과 닷블롯 하이브리드화이제이션으로 확인하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 진단 연구에 활용될 수 있습니다.

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저자는 펩타이드 합성과 DNA 염기서열 분석에 대한 전문 지식을 제공해 준 Academia Sinica의 세포 및 유기체 생물학 연구소(ICOB) 핵심 시설의 Miss Ching-Chun Lin과 Miss Diana Lin에게 각각 감사를 표합니다. 이 연구는 Academia Sinica의 지원을 받았습니다.

단일 클론 항체의 1. 준비 <ol><li> 배양 5 % CO 2 보충 37 ºC에서 175T 플라스크에서 무 혈청 배지에서 RG-M56 마우스 단클론이 하이 브리 도마 세포. 매체의 색상은 배양 5 일 후 노란색으로 바뀌면 뜨는를 수집합니다. 주 : 하이 브리 도마 세포를 소 태아 혈청으로부터 항체의 오염을 피하기 위해, 무 혈청 배지에서 배양 하였다. </li><li> 4 ºC에서 30 분 동안 4,500 XG에 뜨는을 원심 분리기와 세포 파편 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 5 mL의 컬럼 (50 % 슬러리로 제공) 단백질 G 아가로 오스의 2 mL를 넣고 얼음처럼 차가운 PBS의 10 수지 볼륨 (10 mL)로 평형. </li><li> 항체 상층 액의로드 200 ㎖ 칼럼 상 (단계 1.2) 및 통과를 폐기합니다. </li><li> 그것을 씻어 칼럼에 얼음처럼 차가운 PBS의 10 ML을 추가합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 단백질 G-관련된 항체를 용출 컬럼에 50 mM의 글리신, 산도 2.7의 10 ML을 추가합니다. 안부[선택] 배 중화 완충액 100 μL (1 M 트리스, 1.5 M의 NaCl, 및 1 mM의 EDTA, pH를 8.0)를 함유하는 마이크로 원심 튜브에 900 μL 분획. </li><li> -20 ºC에서 0.03 % NaN의 3 50 % 글리세롤에서 정제 된 항체를 저장합니다. </li></ol> 2. 건설 및 직렬로 잘린 재조합 단백질의 발현 <ol><li> (10 배의 Pfu 완충액 5 μL, 각각의 dNTP, 0.2 mM의 0.2 μM 정방향 프라이머 3, 0.2 μM 역방향 프라이머 3, 2 mM의 황산, pET20b-1A59 3 플라스미드 DNA 1 NG 및 2.5 U : PCR 반응 혼합물을 제조 부)의 Pfu DNA 중합 효소; 50 μL의 최종 볼륨 O DDH 2를 추가합니다. <ol><li> 자동 열 자전거 타는 사람에 실행 샘플 다음 매개 변수를 사용하여 : 사이클 1 (5 분 94 ° C); 사이클 2-36 (30 초 94 ºC, 30 초 63 ºC, 60 초 동안 72 ° C); 사이클 37 (7 분 72 ° C). </li></ol></li><li> 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 다음 제한 효소 절단을 용이하게하기 위해 PCR 정제 키트 (5)를 사용하여 제품을 추출한다. </li><li> 이니까 I 및 I을 XhoI 제한 효소로 PCR 증폭 된 DNA 단편을 Nde I 소화하고을 XhoI 효소 절단 된 애완도 20b (+) 벡터에 이러한 DNA 단편을 각각 결찰. 대장균 DH 5α-6-적격 세포로 구조 변환. <ol><li> 소화 버퍼 소화 혼합물을 제조 (20 mM 트리스 - 아세테이트, 10 mM의 마그네슘 (CH 3 COO) 2, 50 mM의 KCH 3 COO, 1 mM의 DTT, pH를 7.9)으로 한 PCR 증폭 된 DNA 또는 애완 동물 (20b)의 μg의 이니까 I 및 I을 XhoI 제한의 (+) 벡터 DNA 및 2 U 20 μL의 최종 부피 효소. </li><li> 부드럽게 소화 혼합물을 혼합하고 신속하게 스핀 다운. 제한의 완전 절단 앉아 보장하기 위해 건조 욕조에 2 시간 동안 37 ºC에서 품어에스. </li><li> 다음 플라스미드의 구축을 용이하게하기 위해 PCR 정제 키트 (5)를 이용하여 제한 효소 소화 DNA 단편을 추출 하였다. </li><li> 결찰 완충액 결찰 혼합물을 준비한다 (66 mM 트리스, 5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 ATP, 5 mM의 DTT, pH를 7.5) predigested, PCR 증폭 된 DNA 100 ng를, predigested 애완 20B 10 NG와 (+) 벡터 DNA, 10 μL의 최종 부피의 5 U T4 DNA 리가. </li><li> 부드럽게 결찰 혼합물을 혼합하고 신속하게 스핀 다운. 수조에서 18 시간 동안 16 ºC에서 품어. </li><li> 지명 타자-5α-유능한 세포 100 μL에 결찰 샘플의 10 μL를 넣고 30 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 배치하기 전에 가볍게 섞는다. 열 충격 (7)을 유도하기 위해 90 초 동안 42 ºC에서 건조 욕조에 microcentrifuge 관을 넣습니다. 즉시 2 분 동안 얼음에 튜브를 전송합니다. </li><li> 0.5 % 박토 효모 extrac 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 (1 % 박토 트립 톤의 900 μL를 추가튜브에 t, 0.5 % 염화나트륨, pH를 7.0). 150 rpm으로 45 분 동안 진탕 37 ºC에서 품어. 10 분 동안 4000 x g에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다. </li><li> LB의 국물의 50 μL와 펠렛을 재현 탁하고 100 μg의 / ML의 암피실린을 포함하는 미리 예열 LB 플레이트에 각각의 변환을 확산. 16 시간 37 ºC에서 번호판을 품어. </li><li> 200 μL 팁을 사용하여 단일 콜로니를 선택하고 느슨하게 덮인 15 mL의 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 3 ㎖의 LB의 국물에 배치합니다. 150 rpm으로 12 시간 동안 진탕 37 ºC에서 품어. </li><li> 각 문화 플라스미드 DNA (8)을 추출하고 순서 9를 확인 T7 프로모터 및 T7 터미네이터 프라이머를 사용하여 시퀀스. </li></ol></li><li> 서열 확인 후, 이러한 애완 동물 20B에서 DNA 10ng의 (+) 회사에 의해 대장균의 BL-21 (DE3) 균주에 YGNNV 코트 단백질 유전자의 다양한 길이를 가진 플라스미드를 변형열 쇼크 방법 7 보내고. 단계에 따라 2.3.6-2.3.8 변환을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 느슨하게 덮인 15 mL의 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 3 ㎖의 LB의 국물로 각각 형질 전환 된 대장균 BL-21 세포에서 하나의 식민지를 전송합니다. 150 rpm으로 흔들면서 37 ºC에서 문화를 품어. </li><li> 배양액의 OD (600)는 약 0.6 일 때 25 ºC로 배양을 냉각시키고, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 0.4 mM의 최종 농도로 IPTG를 추가한다. 200 rpm으로 흔들면서 25 ºC에서 추가로 4 시간 동안 문화를 품어. </li><li> 미세 원심 관에 문화의 한 ML을 전송합니다. 1 분 12,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다. </li><li> 마이크로 피펫 최대 피펫 팅 다운 변성 완충액 100 μL (8 M 우레아, 20 mM 인산 나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH 7.4의)에서 세포 펠렛을 재현 탁. 활발한 텍싱에 의해 섞는다. 참고 : 샘플 졸용액 사용은 이제 도트 오 하이브리드 분석을 위해, 반투명 약간 끈적하고 준비해야한다. </li></ol> 겹치는 펩타이드 3. 설계 및 합성 <ol><li> 디자인 및 각 도트 블로 팅에 의해 RG-M56 단클론 항체의 에피토프 영역을 좁힐 수있는 YGNNV 코트 단백질의 195-338 AA 지역에서 10 AA 잔류 물에 의한 후속과 겹쳐 3 직렬 20 머 펩티드를 합성. </li><li> 설계 및 합성 3 세 8 머 펩티드 (202 195 VNVSVLCR, 197 VSVLCRWS 204, 199 VLCRWSVR 206) 다음의 합성 펩티드 상 6 AA 잔류의 중복과 도트 블로 팅에 의해 195-206 금주의 에피토프 영역을 좁힐 수 있습니다. </li><li> 디자인과 3 ~ 7 머를 합성 (196 NVSVLCR 202, 195 VNVSVLC 201), 6- 메르 (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC (201), 1을 최소화하기 위해 자신의 이웃 펩티드 상에 각각 6, 5의 중복, 4 AA 잔류, 97 VSVLCR 202), 5 머 펩티드 (202 195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, 198 SVLCR) 도트 블로 팅에 의해 에피토프 영역입니다. </li></ol> 4. 도트 오 하이브리드 <ol><li> 10 mg / ml의 최종 농도로 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 각 합성 펩티드를 녹인다. 주 : 합성 펩티드의 용해도 변화를 극복하기 위해, 모든 합성 펩티드를 DMSO에 용해한다. DMSO 완전히 소수성 또는 친수성 펩티드를 용해하는 양 용매이다. </li><li> 2 분 동안 메탄올과 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 담근다. 주 : PVDF 막은 DMSO에 내성이 100 %까지이다; 다른 사람들은 그렇게하지 않을 수 있습니다. </li><li> 수정 Towbin 버퍼 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.3) 용으로 PVDF 막 평형2 분. 주 : ~ 20 % (V / V)의 메탄올는 전송 결과를 개선하기 위해 수정 Towbin 완충액에 첨가 할 수있다. </li><li> 개질 Towbin 완충액 크로마토 종이를 헹군다. 크로마토 그래피 종이 위에 PVDF 막 놓습니다. 수정 Towbin 버퍼가 다음 단계를 계속하기 전에 PVDF 막 표면에서 사라질 때까지 기다립니다. </li><li> 10 μL 팁으로 막에 각각의 펩타이드 샘플 2 μL를 추가합니다. 10 분 동안 크로마토 그래피 용지에 PVDF 멤브레인을 공기 - 건조. 지나치게 확산을 방지하기 위해 막에 천천히 그리고 점차적으로 각 펩타이드 샘플을 추가한다. </li><li> 부드러운 흔들림 실온에서 30 분 동안 5 % 탈지 우유 TBST 버퍼 막 (0.05 % (v / v)의 트윈 20, 20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.4) 차단. </li><li> 막에 5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼에서 1000 : 1의 최종 희석에 RG-M56 단클론 항체를 추가합니다. 부드러운 흔들림과 1 시간 동안 37 ºC에서 막을 품어. </li><li> 그래서 항체를 제거lution. 부드러운 흔들림 5 분 동안 TBST 버퍼에 막 씻으십시오. 두 번 반복합니다. </li><li> 멤브레인을 5 % 탈지 우유 TBST 버퍼에서 5000 : 1의 최종 희석 차 항체 (염소 항 - 마우스 IgG, 된 Fc 공액 알칼리성 포스파타제)을 추가한다. 부드러운 흔들림과 1 시간 동안 37 ºC에서 막을 품어. </li><li> 항체 솔루션을 폐기하십시오. 부드러운 흔들림 5 분 동안 TBST 버퍼에 막 씻으십시오. 두 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 어둠 속에서 15 분 동안 실온에서 BCIP / NBT 기질 용액으로 막을 개발. 신호가 나타날 때 DDH 2 O로 막을 세척하여 현상을 중지합니다. </li><li> 멤브레인을 공기 - 건조 이미지 시스템을 사용하는 도트 블롯 이미지를 캡처. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 3 점 블롯의 강도를 측정한다. </li></ol> 5. 알라닌 스캐닝 및 교체 <ol><li> 디자인과 3 알라닌과 methi을 합성onine 대체 펩티드. VAVSVLCR (202), (195) VNASVLCR (202), (195) VNVAVLCR (202), (195) VNVSALCR (202), (195) VNVSVACR (202), (195) VNVSVLAR (202) 8 메르 펩타이드 195 VNVSVLCR 202 알라닌 각각 AA 잔류 물을 교체하고 합성 펩타이드 195 ANVSVLCR 202, 195, 195 VNVSVLCA (202) . SJNNV 유전자형 에피토프 펩타이드 195 VNVSVMCR (202)를 만드는 메티오닌하는 AA 잔류 류신 (200)를 교체합니다. </li><li> 알라닌 검색 및 치환 돌연변이가 블로 팅 도트 수행하기 위해 제 4 절을 따르십시오. </li></ol>

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이 프로토콜은 단클론 항체 인식 선형 에피토프를 확인하기위한 신속하고 간단한 기술을 제공한다. 고려 펩티드 합성 및 합성 펩티드의 생산 효율의 비용을 고려하여 바이러스 코트 단백질의 항원 성 영역은 펩타이드 주사 분석 전에 연속적으로 절단 재조합 단백질 발현을 감소시켰다. 50-10 사이의 분자량이 kDa의 재조합 단백질은 쉽게 시스템을 통해 표현 될 수 있으므로 따라서, 안정적이고 효율적인 E. 콜라이 애완 동물 발현 시스템이 순차적으로 절단 된 재조합 단백질을 생산하는 데 사용되었다. 이러한 방식으로, 에피토프는 쉽게 관리하기 100~200 AA 영역까지 좁아 질 수있다. 그것은 제조 6xHis 태그 융합 단백질 허용 6xHis-태그의 발현에 대한 코드의 발현을 확인하기 위해 항 6xHis 항체를 사용 immunodetected되도록하는 서열을 함유로서 애완 동물 (20B) (+) 벡터를 구체적으로 선택되었다 재조합 페이지roteins. 생성 된 재조합 코트 단백질은했다 도트 블롯 혼성화 분석을 통하여 RG...

면역계에서 V, D, 및 J 세그먼트의 재조합 항체는 병원균 감염으로부터 숙주를 보호하는 다양한 항원 결합에 대해 상보성 결정 영역 (CDR을)의 상당한 변화를 생성 할 수있다. 항원에 대한 항체의 중화 방어 항체의 CDR을하고 항원의 에피토프 사이의 공간 상보성에 따라 달라집니다. 따라서이 분자의 상호 작용에 대한 이해는 예방 백신 디자인과 치료 펩티드 약물 개발에 도움이 될 것입니다. 그러나,이 중화 상호 작용은 단일 항원 여러 항원 도메인 의해 결과적 에피토프 결정 처리는 더 복잡하게 항체의 복수 개의 CDR에 의해 모두 영향을받을 수있다. 다행히도, 골수종 세포와 개별 항체 생산 세포를 하이 브리 도마 융합 기술의 개발은, 초 셀 끊임없이 나누어 배치 허용모노클로 날 항체 (단클론)로 알려진 하나의 특정 항체 RETE 1. 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항원 항원의 한 영역에 결합하는 이들의 순수한 고 친 화성 모노클로 날 항체를 생산한다. 확립 된 항원 - 항체, 펩티드 주사 등 여러 방식의 관계를, 그 대응하는 단클론 항체를 이용하여 항원의 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수있다. 합성 펩타이드 기술의 최근 발전은 펩타이드 스캐닝 기술은 더 접근하고 수행하는 것이 더 편리 만들었습니다. 간단히, 중복 합성 펩티드의 세트는 표적 항원 서열에 따라 제조되고, 단클론 혼성화 고체지지 막에 관련된다. 펩티드 스캐닝 영역을 결합 항체를 맵핑하는 간단한 방법을 제공하지만, 또한 에피토프 펩티드 각각 AA 잔기 및 항체의 CDR의 결합 상호 작용을 평가하기 위해 잔류 검사 또는 교체를 통해 아미노산 (AA) 돌연변이를 용이 아닙니다. 2, 3, 4를 이용하여 노란색 그루퍼 신경 괴사 바이러스 (YGNNV) 외피 단백질의 선형 에피토프의 효율적인 식별을위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 단클론 항체 제조, 건설, 직렬로 절단 된 재조합 단백질의 발현, 합성 중복 펩티드 디자인, 도트 오 하이브리드, 알라닌 검색 및 치환 돌연변이를 포함한다. 펩티드 합성의 높은 비용을 고려하면, 연속적으로 소망하는 목적 단백질의 재조합 단백질을 절단하는 단계는, 수정하고, 합성 펩티드 배열 도트 블롯 분석이 수행되기 전에 항원 성 영역은 약 100 내지 200 AA 잔기 좁혀졌다.

<table><tbody><tr><td>하이브리드-SFM 매체</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos의 Phophate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA 중합효소&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>EP0502&nbsp;</td><td>버퍼 포함</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>완충액</td></tr><tr><td>포함 NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>완충액</td></tr><tr><td>XhoI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>완충액</td></tr><tr><td>포함 pET-20b(+) 벡터</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH-5&alpha; 유능 세포</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL-21(DE3) 유능 세포</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수&nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필티오-&베타;-D-티오갈락토시드 (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노라우레이트(트윈-20)</td><td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (폴리비닐리덴 플루오라이드, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Agarose Fast Flow</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트,</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP, BioSpectrum 600 이미지 시스템</td>, <td>UVP</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS 분석 소프트웨어 Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 b 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

면역 시스템에 의해 항원 성 에피토프의 확인은 백신 펩타이드 약물의 개발을 용이하게 할 수있다 중화 항체의 보호 메커니즘을 이해할 수있다. 펩티드 스캐닝 노골적 모노클로 날 항체 (단클론 항체)에 의해 인식되는 선형 에피토프를 맵핑하는 간단하고 효과적인 방법이다. 여기에서, 저자는 중화 단클론 항체를 이용하여 신경 괴사 바이러스 코트 단백질의 항원 인식 직렬 절두 재조합 단백질, 합성 펩티드 설계, 도트 블롯 혼성화를 포함하는 에피토프의 결정 방법을 제안한다. 이러한 기술은 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 합성 펩티드 및 모노클로 날 항체의 도트 블롯 하이브리드 화에 의존한다. RG-M56 단클론 항체에 의해 인식 바이러스 외피 단백질 항원의 최소 영역은 6 량체 펩티드 에피토프에 펩티드 맵핑을 트리밍 단계별로 좁힐 수있다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 및 잔여 서브stitution는 에피토프를 구성하는 각각의 아미노산 잔기의 중요성 결합을 특징으로 수행 될 수있다. 에피토프 부위를 플 랭킹 잔기가 펩타이드 형태의 조절에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 동정 된 에피토프 펩티드는 X- 선 회절 연구 및 기능적 경쟁 또는 치료학 대한 에피토프 펩타이드 - 항체 복합체의 결정을 형성하는데 사용될 수있다.

이 실험의 목표는 단클론 항체를 이용하여 블롯을 통해 도트 에피토프를 확인 하였다. 신속하고 효율적으로 단클론 항체에 의해 인식되는 항원 영역을 좁히기 위해, C 말단에 6xHis 융합 태그의 전체 길이와 직렬로 절단 YGNNV 재조합 코트 단백질은 대장균 PET 발현 시스템 (10) (도 1a)에서 발현되었다. 생성 된 재조합 단백질은 도트 블롯 혼성화를 위해 RG-M56 단클론 항체 및 항 6xHis 항체를 이용하여 PVDF 막에 발견되었다. 도트 블롯은 1-338 AA (전체 길이), 51-338 AA 및 195-338 aa는 있지만 1-100 AA 또는 1-200 aa는 재조합 단백질 (그림 1B)에 대해 긍정적 인 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. 도트 배열 항 6xHis 항체에 대해 혼성화 모든 재조합 단백질 발현을 확인 하였다. 이러한 데이...

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

본 프로토콜의 전체적인 목적은 순차적으로 절단된 재조합 단백질과 닷 블롯 하이브리다이제이션(dot-blot hybridization)을 이용한 펩타이드 스캐닝을 통해 단일클론 항체가 인식하는 선형 B 세포 에피토프(linear B-cell epitope)를 식별하는 것입니다. 이 방법은 항원과 항체 사이의 분자 상호작용에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단순성과 효율성입니다.이렇게 확인된 에피토프는 치료 및 진단 응용 분야와 같은 보다 광범위한 연구에 활용될 수 있습니다. 본 절차의 시연은 제 실험실의 박사 후 연구원인 Chien-Wen Chen이 진행하겠습니다. 먼저, 하이브리드 무혈청 배지에서 RGM56 마우스 단일클론 하이브리도마 세포를 배양하십시오.세포 배양물을 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 175 T 플라스크에서 유지합니다. 5일간 배양 후, 배지가 노란색으로 변하면 배양액을 수집하고 상층액을 4°C에서 4,500 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 그 후, 펠렛 형태의 세포 잔해를 제거하여 용액 상태의 항체를 얻습니다.다음으로, 5mL 컬럼에 50% protein G agro slurry 2mL를 넣고, 미리 충전된 레진 부피의 10배에 해당하는 ice cold PBS 10mL로 레진을 평형화합니다. 평형화된 컬럼에 이전에 준비한 항체 용액 200mL를 로딩하고, 컬럼을 통과하여 나오는 분획은 버립니다. ice cold PBS 10mL를 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다.마지막으로, 레진에서 항체를 용출시키기 위해 pH 2.7의 밀리몰 농도 글리세린 용액 10 milliliters를 컬럼에 첨가합니다. 이전에 10X 중화 버퍼 100 microliters를 채워둔 마이크로원심분리 튜브에 900 microliter 분획물을 수집합니다. 정제된 항체는 sodium azide가 첨가된 50% glycerol 용액에 넣어 minus 20 degrees Celsius에서 보관하십시오.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 컨스트럭트를 준비하고 E.coli BL21 세포를 형질전환합니다. 그 다음, 100 µg/mL ampicillin이 첨가된 LB 배지 3 mL가 들어 있는 15 mL 튜브에 단일 콜로니를 옮기고 튜브 캡을 느슨하게 닫습니다. 배양액을 37 °C에서 150 RPM으로 흔들어 배양합니다.600 nm에서 배양액의 광학 밀도를 측정합니다. 광학 밀도가 약 0.6에 도달하면, 배양액을 25 °C로 냉각합니다. 그 다음, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해 0.4 mM의 최종 농도가 되도록 IPTG를 첨가합니다.배양액을 25 °C에서 200 RPM으로 흔들어주며 4시간 더 배양합니다. 배양 후, 박테리아 배양액 1 mL를 마이크로원심분리 튜브에 옮깁니다. 세포를 12,000 ×g에서 1분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.마이크로피펫으로 피펫팅하여 세포 펠렛을 100 µL의 변성 버퍼에 재현탁합니다. 생성된 현탁액을 격렬하게 볼텍싱하여 혼합함으로써 즉시 사용할 수 있는 재조합 단백질 샘플을 준비합니다. 닷 블롯 하이브리드화를 진행하기 위해, 각 합성 펩타이드를 DMSO에 녹여 10 mg/mL 용액으로 만듭니다.그 다음, PVDF 막을 메탄올에서 2분 동안 활성화하고, modified Towbin 버퍼로 2분 동안 추가로 평형화합니다. 크로마토그래피 용지를 modified Towbin 버퍼로 헹군 후, 평형화된 PVDF 막을 그 위에 올립니다. 막 표면에서 버퍼가 사라질 때까지 그대로 둡니다.10 µL 팁을 사용하여 각 펩타이드 또는 재조합 단백질 샘플 2 µL를 멤브레인 위에 첨가하고 10분 동안 자연 건조시킵니다. 멤브레인에 샘플을 점적하는 것은 본 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. PVDF 멤브레인의 작은 영역에 정확한 양의 샘플을 로딩하려면 세심한 주의가 필요합니다.다음으로, 5% nonfat milk가 첨가된 TBST 버퍼를 사용하여 상온에서 30분 동안 가볍게 흔들어주며 멤브레인을 블로킹합니다. 5% nonfat milk가 첨가된 TBST 버퍼로 RGM56 단일클론 항체를 희석합니다. 그리고 항체 용액을 멤브레인에 첨가합니다.완만한 진탕과 함께 37°C에서 1시간 동안 막을 배양합니다. 배양 후 항체 용액을 제거합니다. 그 후 완만한 진탕과 함께 TBST 버퍼로 5분 동안 막을 두 번 세척합니다.그 다음, 5% 탈지분유가 포함된 TBST 버퍼에 희석한 2차 항체 용액을 막에 첨가합니다. 부드럽게 흔들어주며 37°C에서 1시간 동안 막을 배양합니다. 배양이 끝나면 항체 용액을 제거하고, 부드럽게 흔들어주며 TBST 버퍼로 막을 5분씩 두 번 세척합니다.그 다음, 상온의 암실에서 기질 용액을 이용하여 15분 동안 멤브레인을 발색시킵니다. 신호가 나타나면 2차 증류수로 멤브레인을 세척하여 반응을 중단시킵니다. 멤브레인을 공기 중에서 건조시킨 후, 이미징 시스템을 사용하여 도트 블롯 이미지를 캡처합니다.마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 도트-블롯(dot-blot)의 강도를 측정합니다. 여기에는 1번부터 338번 아미노산으로 구성된 전체 길이의 nervous necrosis virus 외피 단백질과 그 순차적 절단 변이체들이 제시되어 있습니다. 형질전환된 박테리아 세포 내 단백질 발현을 확인하기 위해 anti-6XHis 항체를 이용한 도트-블롯 분석을 수행하였으며, 조사 대상인 모든 단백질이 존재함을 확인하였습니다.그 다음, RG-M56 단클론 항체를 이용한 dot-blot hybridization으로 재조합 단백질을 분석하였습니다. 분석 결과, 해당 항체가 인식하는 단백질 에피토프가 펩타이드 195~338 영역에 존재하는 것으로 나타났습니다. 최종적으로, 펩타이드 스캐닝을 통해 20개 또는 8개의 아미노산 잔기로 구성된 에피토프를 식별하였습니다.알라닌 스캐닝(Alanine scanning) 결과, 197번과 199번 위치의 발린(valine) 잔기 및 201번 위치의 시스테인(cystine)을 치환했을 때 에피토프의 결합 능력과 닷 블롯(dot-blot) 하이브리다이제이션이 소실되는 것으로 나타났습니다. 이와 유사하게, 결합 강도 분석에서도 결합 친화도의 감소가 관찰되었으며, 이를 통해 확인된 잔기들이 RGM56 단클론 항체에 대한 에피토프 결합에 필수적임을 확인하였습니다. 이러한 펩타이드 식별 기술은 치료용 펩타이드 약물 또는 펩타이드 의약품 개발에 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를...

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

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이 프로토콜은 고래류의 미오글로빈에 강하게 반응하는 두 개의 IgG 클래스 단클론 항체(mAb)의 개발을 설명합니다. 이러한 mAb는 샌드위치 형식을 기반으로 하는 콜로이드 금 면역크로마토그래피 테스트 스트립에 적용되어 고래류의 Mb를 바다표범 및 다른 동물과 구별합니다.

고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

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Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

B형 간염 바이러스(HBV)유래 펩타이드 매트릭스에 기초하여, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응은 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프의 식별과 병행하여 평가될 수 있었다.

펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석

배우세요 단클론 항체가 인식하는 선형 B세포 에피토프를 펩타이드 스캐닝과 닷블롯 하이브리드화이제이션으로 확인하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 진단 연구에 활용될 수 있습니다.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

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