Name: 효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 효소 기반 마이크로전극 어레이(MEA)를 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델의 해마에서 토닉 및 파직 글루타메이트 변화를 측정하는 방법을. 이 기술은 최소 침습적이며 실시간 신경전달물질 모니터링이 가능합니다.

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(; U54GM104942 MNR), NIA (MNR, R15AG045812), 알츠하이머 협회 (MNR, NIRG-12-242187), WVU 교수 연구 상원 그랜트 (MNR) 및 WVU PSCOR 보조금이 작품은 국립 일반 의학 연구소에 의해 지원되었다 (MNR).

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<li>Hefendehl, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+synaptic+glutamate+transporter+dysfunction+in+vivo+to+regions+surrounding+Abeta+plaques+by+iGluSnFR+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging.</a> Nat Commun. 7, 13441(2016).</li>
<li>Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+in+the+regulation+of+extracellular+glutamate+by+neurons+and+glia+in+the+rat+striatum+two+days+after+diffuse+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury.</a> J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).</li>
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<li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3970435/">An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex.</a> J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).</li>
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<li>Hunsberger, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riluzole+rescues+glutamate+alterations%2C+cognitive+deficits%2C+and+tau+pathology+associated+with+P301L+tau+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression.</a> J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).</li>
<li>Hunsberger, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+restricted+viral+challenge+elevates+extracellular+glutamate+and+enhances+synaptic+transmission+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus.</a> J Neurochem. , (2016).</li>
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<li>Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+brain+penetration+injury+associated+with+microdialysis+and+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).</li>
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<li>Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+studies+of+basal+and+potassium-evoked+release+of+L-glutamate+in+the+anesthetized+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain.</a> J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).</li>
<li>Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29-dependent+glutamate+transporters+EAAT1%2C+EAAT2%2C+and+EAAT3%29+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier.</a> J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).</li>
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</ol>

GG는이 연구에서 글루탐산 측정에 사용되는 FAST-16 기록 시스템을 만드는 Quanteon, LLC의 유일한 소유자입니다. JEQ는 Quanteon에 대한 유료 컨설턴트이다.

MEA를 기술은 시험 관내 및 생체 내에서 신경 전달 물질 방출 및 흡수 빠른 반응 속도의 측정을 허용한다. 따라서, 기술 토닉 신경 전달 물질의 농도를 포함하는 데이터 출력 유발 신경 전달 물질 방출, 및 신경 전달 물질 간극 다양한 생산한다. MEA의 사용이 상대적으로 복잡한 과정이기 때문에, 성공적인 사용을 위해 최적화 될 필요가있다 수많은 요인이있다. 예를 들어, 교정 중에 하나에는 신호 파형 (동경 스크린) 또는 자극에 대한 반응이 최소, 또는 부재 있음이 없는지주의있다. 가능성 시스템 레코딩 시스템을 다시 시작 오작동, 또는 컴퓨터로 인해이 문제를 해결할 수 있습니다. 또한, 문제는 연결 오류 일 수 있습니다. 교정하기 전에, MEA 및 기준 전극 연결부가 적절히 연결되어 있는지 다시 확인과 관련된 것이다. headstage에 DIP 소켓의 교체는 MEA 연결 문제를 해결할 수 있습니다.접합체 용액이 완전히 없거나 불완전 유지 기준 전극을 사용하는 경우, 이들은 또한 ...

뇌의 신경 전달 물질의 변화를 측정하는 것은 종종 신경 전달 물질 조절 곤란을 특징으로 중추 신경계 (CNS) 질환을 연구 신경 과학자을위한 필수적인 도구입니다. 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC / EC)와 함께 미세 투석은 세포의 신경 전달 물질의 레벨 1, 2의 변화를 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법 하였지만 3, 4, 미세 투석 프로브의 공간 및 시간 해상도는 신경 전달에 적합하지 않을 수도 이러한 단단히 외 공간 (5, 6)에 규정되는 글루타메이트 등. 때문에 유전 촬상 최근의 진보, 생체 내에서의 글루타메이트를 매핑하는 데 사용할 수있는 추가의 방법이있다. 유 전적으로 인코딩 된 글루타메이트 형광성 리포터를 사용하여 (iGluSnFR)를D 이광자 촬상 연구자들은 시험 관내 및 생체 7, 8, 9 모두 뉴런 및 성상으로의 글루타메이트 방출을 시각화 할 수있다. 특히,이보다 넓은 시야에서 기록이 가능하며 뇌의 고유 연결을 방해하지 않습니다. 이러한 새로운 광학 기술의 글루타메이트 반응 속도와 감각 유발 반응과 신경 활동의 측정 시각화 할 수 있지만, 그들은 분리 된 뇌 영역의 세포 외 공간에서의 글루타메이트의 양을 정량화 할 수있는 능력이 부족하다. 다른 방법은 선택적으로 자기 - 참조 기록 방식의 사용을 통해 이러한 세포 외 글루타메이트 신경 전달 물질의 수준을 측정 할 수있는 효소 - 결합 된 미세 배열 (MEA)이다. MEA를 기술은 외상성 뇌 다음 세포의 글루타메이트의 변화를 연구하는 데 사용되었습니다노화 부상 10, 11, 12, 13, 14, 스트레스 (15, 16), 간질 (17), (18), 알츠하이머 병 (19), (20), 및 바이러스 성 미믹 (21)의 주입은 미세 투석에 내재하는 공간 및 시간 제한에 비해 개선을 나타낸다. 미세 투석은 시냅스 (22,23) 근처에 측정 할 수있는 능력을 제한하는 반면, MEA의 세포 외 글루타메이트의 선택적 유출 대책 근처 24, 25 시냅스 허용하는 높은 공간 해상도를 가지고있다. 둘째, 미세 투석 낮은 시간 해상도 (1 - 20 분)을 조사 할 수있는 능력을 제한범위 제 26 밀리 초에서 발생 글루타메이트 방출 및 클리어런스의 신속한 역학. 글루타메이트의 방출 또는 간극의 차이 글루타메이트 농도 쉬고 토닉의 측정에서 분명하지 않을 수도 있기 때문에 글루타메이트 방출 및 클리어런스를 직접 측정하는 것이 필수적 일 수있다. MEA를 인해 높은 시간 분해능 (Hz의 2)의 검출 하한 (&lt;1 μM)에 조치 허용한다. 셋째, MEA를는 래트 나 마우스 해마 같은 특정 뇌 영역 내에서 신경 전달 물질의 소 변형 검사 허용한다. 예를 들어, 세포 외 글루타메이트의 소 차이를 조사하기 위해, 우리는 별도로 치아 이랑 (DG)와, trisynaptic 회로 (27)를 통해 연결되어 해마의 cornu의 ammonis 3 (CA3)와 cornu ammonis 1 (CA1)를 타겟팅 할 수있는 MEA를을 사용. 주입 28 &lt;기인 - (4 mm 길이 1) 및 손상으로 인해 미세 투석 프로브의 크기/ SUP&gt;, 29, 소 지역적 차이는 해결하기 어렵다. 또한, 광학 시스템은 예컨대 자극 소 7을 허용하지 않는 수염 자극 또는 광 플리커 등의 외부 자극을 통해 자극을 허용한다. 다른 방법을 통해 다자간 환경의 최종 이익은 외적인 연결을 방해하지 않고 생체 내에서 이러한 하위 영역을 연구 할 수있는 기능입니다. 여기서는 세라믹 기반 다중 미세 이루어지는 MEA를 함께 결합하는 기록 시스템 (예 FAST16mkIII)는, 차분 검출 및 분석 신호로부터 제거 될 에이전트의 간섭을 허용하는 기록 위치에 도포 할 수있는 방법을 설명한다. 우리는 이러한 배열을 기초 amperometry-DG, CA3 내의 생체 글루타메이트 규제 연구 및 마취 RTG의 해마 CA1의 하위 영역에 사용할 수있는 증명 (TauP301L) 4510 마우스, 일반적으로 사용되는 m알츠하이머 병의 여러개 모델. 또, 릴루 졸과 쥐를 치료함으로써 글루타메이트 방출 및 클리어런스의 빠른 동역학에 MEA 시스템의 감도의 확인을 제공 시험관에 나타내는 약물 글루타메이트 방출을 감소시키고 글루타메이트 흡수 30, 31, 32, 33을 증가시키기 그리고 TauP301L 마우스 모델에서 생체 내에서 이러한 각각의 변화를 보여주는.

<table><tbody><tr><td>FAST-16mkIII-8 채널</td><td>Quanteon</td><td>16mkIII</td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 어레이</td><td>CenMet</td><td>W4 또는 8-TRK</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A-3059</td><td>10g(1개월 후 유효기간)</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>G-6257</td><td>100mL(6개월 후 만료)</td></tr><tr><td>글루타메이트 산화효소</td><td>US Biological 또는 시그마 알드리치</td><td>G4001-01 또는 100646</td><td>50 UI (6개월 후 만료)</td></tr><tr><td>Hamilton Syringes</td><td>Hamilton</td><td>#80383</td><td>2 주사기</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>BDH</td><td>UN1230</td><td>4 L</td></tr><tr><td>m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD)</td><td>ACROS Organics</td><td>1330560250</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Reference Electrodes (RE-5B)</td><td>BAS</td><td>MF-2079</td><td>3 electrodes</td></tr><tr><td>Battery-powered Magnetic 교반 플레이트</td><td>Cole-parmer</td><td>EW-04804-01</td><td>다른 공급 업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1626</td><td>100g</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>TCI</td><td>50-81-7</td><td>500g</td></tr><tr><td>도파민 염산염</td><td>Alfa Aesar</td><td>62-31-7</td><td>5g</td></tr><tr><td>과염소산</td><td></td><td>VWR UN2920</td><td>500mL</td></tr><tr><td>염화포스타슘</td><td>VWR</td><td>7447-40-7</td><td>1kg</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR</td><td>7647-40-7</td><td>1kg</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>MP</td><td>153502</td><td>100g</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>BDH</td><td>1310732</td><td>500g</td></tr><tr><td>유리 압력 배출 피펫</td><td>CenMet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>끈적끈적한 왁스</td><td>Kerrlab</td><td>625</td><td>다른 공급업체</td></tr><tr><td>에서 구입할 수 있습니다.Microsyringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>모델링 점토</td><td>월마트는</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>AM systems</td><td>#786500</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>BDH</td><td>7647010</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>플래티넘 와이어</td><td>AM 시스템</td><td>778000</td><td></td></tr><tr><td>솔더 건</td><td>Lowes 또는 Home Depot</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>멀티 미터</td><td>월마트</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td> 다른 <td>공급 업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>입체 장치</td><td>Stoelting</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>Digital Lab Standard</td><td>Stoelting</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>Meiji EMZ 현미경</td><td>Meiji</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>Micro</td><td></td></tr><tr><td>Metricide</td><td>Metrex</td><td>102800</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>VWR</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구매 가능</td></tr><tr><td>수술 가위</td><td>VWR</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>멸균 면봉</td><td>Puritan</td><td>25806</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>눈 연고</td><td>Puralube Vet 연고</td><td></td><td>수의사로부터 얻습니다</td></tr><tr><td>요오드 면봉</td><td>VWR</td><td>S48050</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>알코올 면봉</td><td>지역 약국</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>멸균 수술 드레이프</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>멸균 식염수</td><td>Teknova</td><td>S5815</td><td>필터를 사용하여 자체 솔루션을 만들 수 있습니다</td></tr><tr><td>과산화수소 (3 %)</td> <td>현지 약국</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>월마트</td><td></td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다 다른 곳에서 구입할 수 있습니다 공급 업체</td></tr></tbody></table>

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 phasic이 품목을 측정하는

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

신경 전달 물질 중단은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 우울증, 불안의 기초가되는 병리의 역할을 주로 중추 신경계 (CNS) 질환의 주요 구성 요소입니다. 전통적으로, 미세 투석은이 질환에서 발생하는 신경 전달 물질의 변화를 검사하는 가장 일반적인 (찬양) 기술하고있다. 미세 투석은 조직의 넓은 영역에 걸쳐 천천히 1-20분 변화를 측정 할 수있는 능력을 가지고 있기 때문에, 그것은 잠재적으로 뇌와 느린 샘플링 기능 내에서 고유 연결을 파괴, 침입의 단점이있다. 비교적 새로운 기술은 미세 전극 배열 (MEA)가 그들이 발생하는 공간적 및 시간적 정확한 접근하게 이산 뇌 영역 내의 특정한 신경 전달 물질의 변화를 측정하기위한 많은 장점을 갖는다. 또한, MEA의를 사용하여 생체 내에서 신경 전달 물질의 변화의 측정을 허용 최소 침습적이다. 저희 연구실에서는, 우리는 헥타르알츠하이머 병의 병리와 관련된 신경 전달 물질 인 글루타메이트의 변화에 ​​특별히 관심을했습니다. 따라서, 여기에 설명 된 방법은 알츠하이머 병의 유전자 변형 마우스 모델에서의 글루타메이트의 잠재적 인 해마 중단을 평가하기 위해 사용되었다. 간단히, 방법은 관심과 배경 잡음 및 간섭 물질을 뺄 자체 참조 사이트를 사용하는 신경 전달 물질에 매우 선택적 효소와 다중 사이트 미세 전극을 코팅 포함 사용. 도금 및 교정 한 후, MEA는 마이크로 피펫으로 구성 될 수 있고, 정위 장치를 이용하여 관심있는 뇌 영역으로 낮췄다. 여기서, 상기 방법은 RTG (TauP301L) 4510 마우스를 마취하고 정확하게 해마의 서브 영역 (DG, CA1 및 CA3)를 대상으로하는 정위 장치를 사용하는 것 설명.

이 기술은 같은 외상성 뇌 손상, 노화, 스트레스, 그리고 간질 동물 모델의 많은 종류의 신호 글루타메이트의 변화를 측정 할 수 있지만, 여기에 우리는 MEA 기술은 유전자 변형 마우스 모델에서 글루타메이트의 변화를 검사하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다 인간 타우 병증 (19), (20). RTG를 (TauP301L)는 4510 마우스 염색체 17에 연결 측두엽 치매 및 파킨슨 병에 관련된 타우에서 P301L 돌연변이를 표현하고, 일반적으로 알츠하이머 병, 퇴행성 신경 퇴행성 신경과 측두엽 치매와 관련된 타우 병리학을 연구하는 데 사용됩니다. 우리는 또한 글루타메이트 신호는 약리 개입에 의해 수정 될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 릴루 졸과 TauP301L 마우스를 처리, 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)에 대한 FDA의 승인을 질병 변경 약물의 안정화에 의...

여기서는 토닉과 효소 결합 된 미세 배열 (MEA)를 사용하여 생체 내 세포 외 글루타메이트 phasic 변화를 측정하는 공간적 및 시간적 정확한 방법에 대한 설치 소프트웨어 탐색 및 데이터 분석을 기술한다.

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

본 절차의 전반적인 목표는 효소 연결 마이크로전극 어레이(MicroElectrode Arrays)를 사용하여 생체 내(in vivo)에서 긴장성 및 위상성 세포외 글루타메이트 변화를 측정하는 것입니다. 이 방법은 세포외 신경전달물질 수치와 신경전달물질 방출 및 제거의 빠른 역학이 질환 상태에서 변화하는지 여부와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마이크로전극 어레이가 특정 뇌 영역 내의 특정 신경전달물질 변화를 측정할 수 있어, 침습성을 최소화하면서도 공간적 및 시간적으로 정밀한 접근이 가능하다는 점입니다.본 실험 절차는 본 연구실의 Holly Hunsberger와 Ryan Heslin이 시연하겠습니다. 절차를 시작하기 위해, MEA의 한 쌍의 기록 사이트에는 원하는 효소를 코팅하고, 다른 한 쌍의 기록 사이트에는 비활성 단백질 매트릭스를 코팅하십시오. 그 다음, 10 µL Hamilton 시린지를 사용하여 글루타메이트 산화효소 또는 단백질 매트릭스를 흡입하십시오.플런저를 살짝 눌러 시린지 팁에 용액을 작은 방울 형태로 분출합니다. 해부 현미경 하에서 MEA 기록 부위를 대상으로, 용액 방울을 해당 기록 부위에 잠시 접촉시켜 용액을 도포하며, 이는 한 층에 해당합니다. 기록 부위에 코팅을 적용할 때마다 1분 간격으로 타이머를 설정하십시오.이제 기준 전극을 플라스틱 암의 개구부를 통해 배치하십시오. 기준 전극을 PBS가 들어 있는 비커에 넣고, 비커 바닥에 닿지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 기준 전극을 헤드 스테이지에 연결하고 MEA를 헤드 스테이지에 장착된 mPD에 연결하십시오.MEA 팁 부분만 용액에 잠기도록 MEA를 비이커의 용액 속으로 내립니다. MEA 팁을 검은색 기포 너머까지 용액에 담그지 마십시오. 그렇게 하면 MEA가 손상될 수 있습니다.그런 다음, 바탕화면에서 전기도금 아이콘을 선택합니다. 전기도금 도구 메뉴에서 설정값이 올바르게 입력되었는지 확인하십시오. 이후, 소프트웨어 종료를 선택하여 전기도금을 마칩니다.mPD 도금 전극 팁을 초순수(DI water)로 헹구고 보정 전 24시간 동안 보관하십시오. 이 절차에서는 가열 패드를 37 °C로 켜고 헤드 스테이지를 기록 제어 시스템에 연결합니다. 그런 다음, 교반 중인 0.5 M PBS 40 mL에 MEA 팁을 삽입하십시오.다음으로, 기준 전극을 헤드 스테이지에 연결합니다. 기준 전극 팁을 가볍게 털어 기포가 없는지 확인합니다. 그 후, 기록 프로그램을 열어 설정이 정확한지 확인하고, MEA 번호를 선택한 다음 Calibration을 클릭하고 시작을 누릅니다.평형 상태에 도달하도록 5분에서 10분 동안 기다린 후, 베이스라인이 안정되면 교정을 시작하십시오. 다음으로, Baseline을 선택하고 500 µL의 ascorbic acid를 첨가합니다. 그 후, 전류가 새로운 안정된 고평부(plateau)에 도달하면 Interferent를 선택하십시오.MEA가 적절하게 전기 도금되었다면, 아무런 변화가 관찰되지 않아야 합니다. 다음으로, 20 millimolar L-glutamate 40 microliters를 첨가합니다. 전류가 새로운 안정된 고원(plateau) 상태에 도달하면, 첫 번째 첨가분을 분석물로 표시합니다.글루타메이트 첨가를 총 3회 수행하기 위해 이 과정을 세 번 반복합니다. 그 후, 도파민 40 microliters를 첨가합니다. 그리고 Test Substance를 선택합니다.그 다음, 40 µL의 과산화물을 첨가합니다. Test Substance를 선택하고 캘리브레이션이 완료되면 정지 버튼을 누릅니다. 이 단계에서는 마이크로피펫을 4개의 백금 기록 사이트 중앙에 배치하고, 점착성 왁스와 모델링 클레이를 사용하여 MEA 상단 50 ~ 100 µm 높이에 장착합니다.DC 어댑터를 사용하여, 적색 양극선을 금 핀 쪽의 준비된 은선에 연결하고, 흑색 음극선을 백금 수조 음극에 연결합니다. 그런 다음, DC 어댑터의 전원을 연결하고 도금 과정이 제대로 진행되는지 확인합니다. 수조 전극에 기포가 발생해야 하며, 기준 전극은 은회색으로 변해야 합니다.이 절차에서는 동물을 정위 고정 장치에 배치하고 이어 바(ear bar)를 사용하여 머리를 고정합니다. 동물이 단단히 고정되어 머리가 움직이지 않는지 확인하십시오. 그런 다음, 멸균 면봉을 사용하여 안연고를 도포합니다.그 후, 트리머로 머리를 깎습니다. 그리고 작은 외과용 가위를 사용하여 귀 주변의 털을 제거합니다. 이어서 두피에 요오드와 알코올을 세 번씩 교대로 도포합니다.이어서 두피 중앙에 절개창을 내고 피부를 벌립니다. 멸균 면봉으로 혈액을 흡수시키고 과산화수소를 도포하여 브레그마(bregma)와 람다(lambda)가 잘 보이게 합니다. 브레그마와 람다의 배-복측 및 내-외측 거리를 측정하여 머리가 정확하게 위치했는지 확인하십시오.브레그마(bregma) 좌표를 0으로 설정하고 목표 좌표를 표시합니다. 다음으로, 표시한 지점 주변을 천공합니다. 그 후, MEA를 헤드 스테이지에 부착합니다.원하는 첫 번째 용액을 피펫에 다시 채웁니다. 배출되는 용액을 관찰할 수 있도록 피펫 내부에 용액이 없는 빈 공간을 남겨두어야 합니다. 그런 다음, 유리 마이크로피펫에 튜브를 연결합니다.MEA가 장착된 상태에서 bregma를 찾아 좌표를 0으로 설정합니다. MEA를 원하는 좌표로 이동시키고, 팁이 뇌에 닿을 때까지 MEA를 천천히 내립니다. 다음으로, 배측-복측(dorsal-ventral) 좌표를 0으로 설정한 후 MEA를 뇌 속으로 천천히 삽입합니다.회로를 완성하기 위해 기준 전극을 뇌와 액체 접촉 상태를 유지하면서 MEA에서 떨어진 곳에 배치합니다. 기록 프로그램에서 보정이 완료된 원하는 전극을 클릭한 다음, '실험 수행(perform experiment)'을 클릭하여 기록을 시작합니다. 안정적인 기저선(baseline)을 확보한 후, 압력 분사기를 0.6초 및 0.5 psi로 설정하고 압력 분사기의 빨간색 버튼을 눌러 분사합니다.주입 시트에 시간과 압력, 그리고 이동한 부피 눈금을 기록하고 필요한 경우 메모를 작성하십시오. 그 후, 마이크로피펫이 부착된 상태의 MEA를 제거하여 DI water로 헹구고, 모든 혈액이 제거될 때까지 PBS에 하룻밤 동안 담가 두십시오. 해마의 CA3 및 CA1 영역에서 tonic glutamate 수치는 vehicle 처리된 TauP301L 마우스에서 유의하게 증가했으며, 이러한 효과는 riluzole 처리에 의해 완화되었습니다.여기에서, 염화칼륨으로 유도된 CA3의 글루타메이트 방출에 대한 기선 보정 대표 기록 결과, riluzole 처리가 Vehicle-TauP301L 마우스에서 관찰된 글루타메이트 방출 진폭의 유의미한 증가를 완화시켰음을 보여주었습니다. 염화칼륨의 국소 투여는 세포 외 글루타메이트의 강력한 증가를 유도했으며, 이는 빠르게 기저 수준으로 돌아왔습니다. Vehicle을 처리한 TauP301L 마우스에서 염화칼륨 국소 투여 후 DG, CA3 및 CA1에서 관찰된 유의미하게 증가된 염화칼륨 유도 글루타메이트 방출은 riluzole 처리에 의해 완화되었습니다.크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색된 이 해마 단면은 CA3 및 CA1 내 MEA 트랙의 위치를 확인해 줍니다. 이 절차를 수행할 때는 논문에 기재된 문제 해결 단계를 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 노이즈 신호를 줄이려면 시스템 접지를 실시하고 각 단계를 적시에 수행하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

AD의 형질 (TG) 마우스 모델을 어떻게 그리고 왜 Aβ 또는 타우 수준 CSF의 변화에​​ 질병이 인간의 환자에서 진행됨에 따라 조사를 위해 좋은 기회를 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 시리얼 CSF 샘플링을위한 세련된 cisterna 마그나 찔린 기법을 보여줍니다.

Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

AD의 병리 학적 특징 중 하나는 아밀로이드 β 단백질의 긍정적인 neuritic plaques의 형성이다. immunohistochemical 감지 thioflavin S 얼룩 방법을 사용하여 ABC​​와 DAB 방법과 형광 검출을 사용하여이 프로토콜에서 우리는 유전자 변형 AD 모델 마우스에서 neuritic plaques를 감지하는 두 가지 방법을 설명합니다.

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지

이 비디오에서는 글루타메이트 산화효소로 코팅된 MEA(Multielectrode Array)를 마취된 마우스의 뇌 조직에 이식합니다. 글루타메이트 용액은 MEA가 글루타메이트 수치를 감지하는 세포 외 공간에 주입되어 성상세포의 글루타메이트 흡수를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다.

효소로 코팅된 미세전극 어레이를 사용한 In vivo 실시간 글루타메이트 모니터링

여기에는 β- 아밀로이드증 및 타우 병증 유전자 변형 마우스 모델에서인지 및 기능 운동 행동에 대한 생체 내 효능을 나타내는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수있는 단계적 행동 스크리닝 방법이 기재되어있다. 이 방법은 단기 및 작업 메모리 작업에서 활동을 위해 화합물을 스크리닝하기 위해 최적화됩니다.

아밀로이드 -β 및 타우 신경 병증의 유전자 변형 마우스 모델에서 자발적 교대, 새로운 대상 인식 및 사지 걸림의 평가

이 문서 내용을 사용 하 여 탄소 섬유 전극 효소 바이오 센서 기술에 자연적인 보상 행동 동안 도파민과 높은 시간 해상도와 조미료의 릴리스를 측정 하는 고정 잠재력 amperometric 녹음의 사용은 여자는...

자연스럽 게 여성 시리아 햄스터에 동작을 보람 있는 하는 동안 Extracellular 신경 전달 물질의 생체 내에서 변화를 측정

우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

여기에서 우리는 시험관 외 Ca에서 측정 하는 프로토콜을 제시2+ 중간 뇌 뉴런에서 플럭스와 1 차 마우스 중간 두뇌 문화를 사용 하 여 caspase-3에 그들의 다운 스트림 효과. 이 모델은 중뇌 뉴런에서 비정상적인 Ca2+ 활동과 관련된 병리학적 변화를 연구하고, 세포세포 항세포 특성에 대한 새로운 치료법을 선별하기 위해 사용될 수 있다.

기본 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 플럭스와 다운스트림 효과를 정량화

우리는 뇌 전기장 측정 및 관련 바이오마커-대뇌 혈류의 관점에서 두개외 자극에 대한 용량-반응 곡선을 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뇌에 침습적인 전극 배치를 포함하기 때문에 전신 마취가 필요하며 통제된 호흡보다는 자발적 호흡이 선호됩니다.

두개외 자극 전극의 배치 및 마취된 마우스의 대뇌 혈류 및 두개내 전기장 측정

알츠하이머병 중 하나는 기능은 Aβ의...

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

우리는 periventricular leukomalacia (PVL), periventricular 흰색 물질 병변을 특징으로 조기 유아의 지배 뇌 손상의 마우스 모델을 만들었습니다. 와 / 전신 감염없이 Hypoxia / 국소 빈혈은 PVL의 주요 원인입니다. 일방적 경동맥 내고과 lipopolysaccharide 주입없이 /로 hypoxia 노출 P6 생쥐의 PVL과 같은 병변을 만듭니다.

Periventricular Leukomalacia의 마우스 모델

학습하세요 효소 기반 마이크로전극 어레이(MEA)를 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델의 해마에서 토닉 및 파직 글루타메이트 변화를 측정하는 방법을. 이 기술은 최소 침습적이며 실시간 신경전달물질 모니터링이 가능합니다.

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

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