효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

이 절차의 전반적인 목표는 효소 결합 MicroElectrode Array를 사용하여 생체 내에서 강장 및 위상 세포 외 글루타메이트 변화를 측정하는 것입니다. 이 방법은 질병 상태에서 세포외 신경전달물질 수준과 신경전달물질 방출 및 제거의 빠른 역학이 변경되는지 여부와 같은 신경과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 MicroElectrode Arrays가 개별 뇌 영역 내의 특정 신경 전달 물질 변화를 측정할 수 있어 최소 침습적이면서 공간적으로나 시간적으로 정확한 접근 방식을 사용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 Holly Hunsberger와 Ryan Heslin입니다. 이 절차를 시작하려면 MEA의 한 쌍의 기록 부위에 원하는 효소를 코팅하고 다른 한 쌍의 기록 부위에 비활성 단백질 매트릭스를 코팅합니다. 그런 다음 10마이크로리터 Hamilton 주사기를 사용하여 글루타메이트 산화효소 또는 단백질 매트릭스를 작성합니다.

플런저를 부드럽게 눌러 주사기 팁에 작은 용액 비드를 분배합니다. MEA 기록 부위를 대상으로 하려면 해부 현미경으로 하나의 층을 나타내는 용액 방울과 기록 부위를 잠시 접촉하여 용액을 적절한 기록 부위에 적용합니다. 코팅 작업 사이에 1분 동안 타이머를 설정하여 기록 현장에 연결합니다.

이제 플라스틱 암의 구멍을 통해 기준 전극을 놓습니다. 기준 전극을 PBS가 들어 있는 비커로 내리고 비커 바닥에 닿지 않도록 합니다. 다음으로, 기준전극을 헤드단에 연결하고, 헤드단에 도금된 mPD에 MEA를 연결한다.

MEA 팁만 용액에 잠기도록 MEA를 용액의 비커로 내립니다. MEA 팁을 검은색 거품 이상의 액체에 담그지 마십시오. 그렇게 하면 MEA가 손상될 수 있습니다.

그런 다음 바탕 화면에서 전기 도금 아이콘을 선택합니다. 전기 도금 도구 메뉴에서 올바른 설정이 입력되었는지 확인하십시오. 그런 다음 출구 소프트웨어를 선택하여 전기 도금을 마칩니다.

mPD 도금 전극 팁을 DI 워터로 헹구고 교정하기 전에 24시간 동안 보관하십시오. 이 절차에서는 섭씨 37도에서 가열 패드를 켜고 헤드 스테이지를 녹음 제어 시스템에 연결합니다. 그런 다음 MEA 팁을 40ml의 교반 0.5몰 PBS에 삽입합니다.

다음으로, 기준 전극을 헤드 스테이지에 연결합니다. 기준 전극 팁을 튕겨 기포가 없는지 확인합니다. 그런 다음 녹음 프로그램을 열고 설정이 올바른지 확인하고 MEA 번호를 선택한 다음 보정을 클릭하고 시작을 누릅니다.

평형을 위해 5-10분 정도 기다렸다가 기준선이 안정화되면 보정을 시작합니다. 그런 다음 기준선을 선택하고 500마이크로리터의 아스코르브산을 추가합니다. 그런 다음 전류가 새로운 안정된 안정기에 도달하면 간섭을 선택합니다.

MEA가 제대로 전기도금된 경우 변경 사항이 관찰되지 않아야 합니다. 다음으로, 40마이크로리터의 20밀리몰 L-글루타메이트를 추가합니다. 전류가 새로운 안정 고원에 도달하면 첫 번째 첨가를 분석물로 표시합니다.

글루타메이트를 총 3회 첨가하기 위해 3회 반복합니다. 그런 다음 40마이크로리터의 도파민을 넣는다. 그리고 테스트 물질을 선택합니다.

그런 다음 40 마이크로 리터의 과산화물을 첨가하십시오. Test Substance를 선택하고 보정이 완료되면 중지 버튼을 클릭합니다. 이 단계에서는 마이크로피펫을 4개의 백금 기록 부위 중 중앙에 배치하고 끈적한 왁스와 모델링 점토를 사용하여 MEA 위 50-100마이크로미터에 장착합니다.

DC 어댑터를 사용하여 빨간색 양극을 금핀 쪽에 준비된 은선에 고정하고 검은색 음극을 백금 수조 음극에 고정합니다. 그런 다음 DC 어댑터를 연결하고 올바른 도금 과정을 찾으십시오. 수조 전극에 기포가 나타나야 하고 기준 전극은 은회색으로 변해야 합니다.

이 절차에서는 동물을 입체 장치에 넣고 이어 바를 사용하여 머리를 안정시킵니다. 동물이 고정되어 있고 머리가 움직이지 않는지 확인하십시오. 그런 다음 멸균 면 어플리케이터를 사용하여 안연고를 바릅니다.

그런 다음 트리머로 머리를 면도하십시오. 그리고 작은 수술 용 가위를 사용하여 귀 근처의 털을 제거하십시오. 그런 다음 요오드를 바르고 알코올을 두피에 3회 번갈아 바르십시오.

그런 다음 두피 중앙을 절개하여 피부를 펴줍니다. 멸균 면 팁으로 모든 혈액을 흡수하고 과산화수소를 바르면 브레그마와 람다가 나타나기 쉽습니다. 브레그마(bregma)와 람다(lambda)의 등쪽-배쪽(dorsal-ventral)과 내측(medial-lateral)을 측정하여 머리가 올바른 위치에 있는지 확인하십시오.

브레그마의 좌표를 0으로 설정하고 대상 좌표를 표시합니다. 다음으로 표시 주위를 드릴로 뚫습니다. 그런 다음 MEA를 헤드 스테이지에 부착합니다.

피펫을 첫 번째 원하는 용액으로 다시 채웁니다. 배출되는 용액을 검사할 수 있도록 용액이 없는 피펫에 틈을 두십시오. 그런 다음 튜브를 유리 마이크로피펫에 부착합니다.

MEA가 연결된 브레그마를 찾아 좌표를 0으로 설정합니다. MEA를 원하는 좌표로 이동하고 팁이 뇌에 닿을 때까지 MEA를 천천히 내립니다. 다음으로, 등쪽-복부 좌표를 0으로 만든 다음 MEA를 천천히 뇌로 내립니다.

기준 전극을 MEA에서 멀리 떨어진 위치에 배치하여 회로를 완성하기 위해 뇌와 여전히 액체와 접촉하도록 합니다. 기록 프로그램에서 원하는 보정된 전극을 클릭한 다음 실험 수행을 클릭하여 기록을 시작합니다. 안정적인 기준선을 얻은 후 압력 이젝터를 0.6초 및 0.5psi로 설정하고 압력 이젝터의 빨간색 버튼을 눌러 배출합니다.

주입 시트에서 이동한 부피 눈금뿐만 아니라 시간과 압력을 기록하고 필요한 경우 메모합니다. 그런 다음 마이크로피펫이 부착된 MEA를 제거하고 DI 물로 헹구고 모든 혈액이 사라질 때까지 PBS에 밤새 담가둡니다. 해마의 CA3 및 CA1 영역에서, 비히클 처리된 TauP301L 마우스에서 강장 글루타메이트 수치가 유의하게 증가했으며, 이는 릴루졸 처리에 의해 약화되었습니다.

여기서, CA3에서 글루타메이트 방출을 유발한 염화칼륨의 대표적인 기록과 일치하는 기준선은 릴루졸 처리가 Vehicle-TauP301L 마우스에서 관찰된 글루타메이트 방출의 진폭의 현저한 증가를 약화시켰음을 보여주었습니다. 염화칼륨을 국부적으로 적용하면 세포 외 글루타메이트가 크게 증가하여 빠르게 강장 수준으로 돌아왔습니다. 현저하게 증가된 염화칼륨은 염화칼륨의 국소 적용이 릴루졸 처리로 약독화된 후 차량 처리된 TauP301L 마우스에서 관찰된 DG, CA3 및 CA1에서 글루타메이트 방출을 유발했습니다.

해마의 이 크레실 바이올렛 염색 부분은 CA3 및 CA1에서 MEA 트랙의 위치를 확인합니다. 이 절차를 시도하는 동안 원고에 나열된 문제 해결 단계를 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 잡음이 있는 신호를 줄이려면 시스템을 접지하고 적시에 단계를 따라야 합니다.