조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

이 프로토콜의 전반적인 목적은 3D 인비트로(in vitro) 세포 배양 모델이나 세포 전달 시스템의 재생 촉진 스캐폴드로 활용하기 위해, 조직 특이적 세포외 기질에서 유래한 비화학적 가교 폼 또는 마이크로 캐리어를 적정 크기로 제작하는 것을 돕는 것입니다. 이 방법은 3D 세포 미세환경이 세포 기능과 조직 재생을 어떻게 매개하는지와 같이 응용 세포 생물학 및 조직 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 추가적인 가교 과정 없이도 천연 조직 특이적 ECM 조성을 모방하고 장기 배양 시 안정성을 유지하며, 기하학적 구조 조절이 가능한 스캐폴드 제작이 가능하다는 점입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 조직 유래 ECM을 동결건조한 후, 날카로운 수술용 가위를 사용하여 탈세포화된 조직을 잘게 다집니다. 처리된 조직을 저온 분쇄하려면, 실험실용 볼 밀 시스템의 25 milliliter 스테인리스강 밀링 챔버에 다져진 동결건조 ECM을 채우고, 10 milliliter 스테인리스강 밀링 볼 두 개를 넣습니다. 충전된 밀링 챔버를 닫고 액체 질소에 3분 동안 완전히 담급니다.

그 다음, 냉동된 샘플을 30 Hertz에서 3분 동안 분쇄합니다. ECM이 고운 가루가 될 때까지 액체 질소 침전과 분쇄 과정을 반복합니다. 잘게 다져졌거나 동결 분쇄된 ECM 250 milligrams를 정밀하게 측정하여 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

원심분리 튜브에 22 M NaH2PO4 완충액 5 mL를 넣고 튜브에 액체 높이를 표시합니다. 그런 다음 22 M NaH2PO4 완충액 1 mL에 alpha amylase 7.5 mg을 넣어 alpha amylase 표준 용액을 준비합니다. 다음으로, 샘플에 alpha amylase 표준 용액 100 µL를 첨가합니다.

그 다음 22 molar NaH2PO4를 추가하여 최종 부피를 10 milliliters로 맞춥니다. 현탁액을 상온에서 300 RPM으로 72시간 동안 지속적으로 교반합니다. 현탁액을 1500 times G에서 10분 동안 원심분리합니다.

소화된 ECM 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하여 상층액을 수집하고 폐기합니다. 그 다음, 이중 증류수로 희석한 5% NaCl 10 milliliters를 사용하여 펠렛 물질을 재현탁하고 300 RPM에서 10분 동안 계속해서 교반합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복한 후, 이중 증류수 10 milliliters를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다.

그 다음, 현탁액을 상온에서 300 RPM으로 10분 동안 지속적으로 교반합니다. 샘플을 다시 원심분리한 후, 소화된 ECM 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하여 상층액을 수집하고 제거합니다. 5 mL 표시선까지 2 M 아세트산을 첨가합니다.

그리고 볼텍싱합니다. 그 다음 현탁액을 120 RPM, 37 °C에서 밤새도록 지속적으로 교반합니다. 다음 날, 10 mm 너비의 톱니형 프로브가 장착된 핸드 헬드 균질기를 사용하여, 가시적인 파편이 남지 않을 때까지 실온에서 10초 간격으로 ECM 현탁액을 균질화합니다.

과열을 방지하기 위해 균질화 간격 사이에 현탁액을 차가운 물이 담긴 비커에 넣어두십시오. 현탁액이 따뜻해질 때까지 120 RPM으로 계속 교반하며 37 °C에서 ECM 현탁액을 배양하십시오. 그런 다음 2 M 아세트산을 사용하여 시료 현탁액을 원하는 농도로 희석하십시오.

3 mL 주사기와 18게이지 바늘을 사용하여 원하는 몰드에 ECM 현탁액을 채웁니다. 폼은 몰드의 모양에 따라 다양한 기하학적 구조로 제작할 수 있습니다. 몰드를 덮고 -20°C 또는 -80°C에서 동결시킵니다.

그런 다음 몰드를 동결건조 플라스크에 넣습니다. 플라스크를 실험실 동결건조 시스템에 연결하고 몰드를 24시간 동안 또는 완전히 건조될 때까지 건조합니다. 동결분쇄된 ECM 현탁액을 100 RPM으로 지속적으로 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다.

3 mL의 ECM 현탁액을 3 mL 루어 락(luer lock) 시린지에 충전하고, 시린지 보어에 윙드 인퓨전 세트(winged infusion set)를 연결합니다. 시린지 펌프 내에 시린지를 고정합니다. 그런 다음 바늘을 레토르트 스탠드에 고정하고, 바늘 끝을 저형 듀어 플라스크(low formed Dewar flask) 상단에서 4~6 cm 떨어진 위치에 수직으로 배치합니다.

다음으로 악어 클립 전극을 바늘 끝에 부착하고, 이때 악어 클립이 고전압 전원 공급 장치의 양극 단자에 연결되어 있는지 확인하십시오. 알루미늄 호일 조각을 진공 플라스크 가장자리에 덮어 접습니다. 그런 다음 두 번째 악어 클립 전극을 호일의 바깥쪽 가장자리에 부착하십시오.

이를 전원 공급 장치의 접지 소스 단자에 연결하십시오. 듀어 플라스크에 액체 질소를 상단에서 약 1cm 높이까지 채워 호일의 4분의 3이 잠기게 합니다. 그다음 시린지 펌프의 주입 속도를 30 milliliters per hour로 설정하고, 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 전기 분무하십시오.

주입이 완료되면, 마이크로 캐리어가 동결 상태를 유지할 수 있도록 약 25 milliliters의 액체 질소를 남기고 듀어(Dewar)에서 과잉 액체 질소를 조심스럽게 따라냅니다. 그 다음, 한 번의 매끄러운 동작으로 액체 질소와 함께 마이크로 캐리어를 50 milliliter 원심 분리 튜브로 즉시 옮깁니다. 이후 스쿠풀라(Scoopula)를 사용하여 듀어에 남아 있는 냉동 마이크로 캐리어를 모두 수집합니다.

이들을 원심분리기에도 추가하십시오. 동결건조를 준비하기 위해, 작은 구멍이 뚫린 알루미늄 호일로 원심분리 튜브를 덮습니다. 덮개 처리된 원심분리 튜브를 동결건조기 플라스크에 넣으십시오.

그런 다음 즉시 플라스크를 동결건조기에 연결하고 샘플을 밤새 건조합니다. 동결건조된 폼을 과량의 absolute ethanol이 들어 있는 50 milliliter 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 마찬가지로, 수집 시 사용했던 원래의 원심분리 튜브 내에서 동결건조된 마이크로 캐리어를 과량의 absolute ethanol에 재현탁합니다.

세롤로지컬 피펫을 사용하여 마이크로 캐리어를 정해진 메쉬 크기의 스테인리스 체로 걸러 새로운 50 milliliter 원심분리 튜브에 담아 응집물을 제거하고 원하는 크기 범위를 선택합니다. 샘플을 4 °C에서 4시간 동안 또는 거품이나 마이크로 캐리어가 원심분리 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 배양합니다. 그 후, 무균 조작법을 적용하여 라미나 플로우 후드 아래에서 세롤로지컬 피펫을 이용해 스캐폴드에서 절대 에탄올을 제거하고, 멸균 PBS로 희석한 과량의 95% ethanol을 첨가합니다.

지지체를 4 °C에서 4시간 동안 또는 지지체가 재수화 용기 바닥으로 가라앉을 때까지 배양합니다. 에탄올 시리즈를 통해 지지체를 점진적으로 재수화합니다. 각 단계에서 용액을 교체하기 전, 지지체가 용기 바닥으로 가라앉을 때까지 4 °C에서 배양합니다.

잔류 에탄올을 제거하기 위해 멸균 PBS로 두 번 더 헹구어 교체합니다. 세포 배양 준비 시까지 샘플을 100% 멸균 PBS에 넣고 4°C에서 보관하십시오. 재수화 후 1~2주 이내에 스캐폴드를 사용하십시오.

탈세포화된 지방 조직을 사용하여 제작된 ECM 유래 폼과 마이크로 캐리어의 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 돼지의 탈세포화된 진피 조직과 돼지의 탈세포화된 좌심실의 예입니다. 이는 다양한 탈세포화 조직을 ECM 소스로 사용하여 조직 특이적 바이오 스캐폴드를 생성하는 데 해당 기술을 적용할 수 있음을 보여줍니다.

냉동분쇄(cryomilling) 또는 세절, 효소 소화 및 균질화 후, 샘플을 동결 및 동결건조 전 용기에 분배할 수 있습니다. 이 그림은 48-웰 조직 배양 플레이트 몰드에서 합성된, 재수화된 DAT, DDT 및 DLV 분쇄 폼을 나타냅니다. 이 DAT, DDT 및 DLV 폼은 35 mg/mL 농도의 냉동분쇄된 ECM과 -80 °C의 동결 온도로 제작되었습니다.

전기 분무 기술을 이용하여 ECM 유래 마이크로 캐리어를 제작하기 위해, 각 ECM 소스 현탁액 농도에 따라 니들 게이지, 주입 속도 및 전압을 조정하여 제어된 재수화 후 직경이 350에서 500 µm 범위인 개별적인 구형 마이크로 캐리어를 생성할 수 있습니다. 마지막으로, SEM으로 확인한 DAT, DDT 및 DLV 마이크로 캐리어는 탈세포화된 ECM 소스에 따라 크기의 미세 구조가 달라질 수 있음을 보여줍니다. 이 비디오에서 제시된 방법은 탈세포화된 조직을 매트릭스 소스로 사용하여 화학적으로 가교되지 않은 순수 ECM으로 구성된 다양한 조직 특이적 마이크로 캐리어와 폼을 제작하는 데 사용될 수 있습니다.

이러한 절차를 통해, 정적 또는 동적 조건에서 폼과 마이크로 캐리어에 세포를 시딩할 수 있으며, 이를 인비트로(invitro) 세포 배양 및 인비보(invivo) 응용을 위한 세포 지시성 기질로 적용할 수 있습니다.