Name: 조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 배우세요 조직 특이적 세포외기질 유래 거품과 마이크로담체를 화학적 가교 없이 제조하는 방법을. 동결건조, 크라이오밀링, 전기분무 기술을 활용하여 3D 세포 배양 및 재생의학 연구에 적용 가능한 생체재료를 만듭니다.

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캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)와 캐나다 보건 연구소(CIHR)가 이 작업을 위한 자금을 제공했습니다. 저자들은 전기분무 시스템을 사용한 Amin Rizkalla 박사, SEM 이미징 장비를 사용한 Western University의 Nanofabrication Facility, 돼지 조직 샘플을 제공한 Mount Brydges Abattoir, 이 연구를 지원하기 위한 임상 협력을 해준 Aaron Grant, Brian Evans 및 Robert Richards 박사에게 감사를 표합니다.

1. 조직 처리 탈세 포화 <ol><li> 탈세 포화 및 동결 건조 <ol><li> 설립 프로토콜 다음 관심의 Decellularize 조직 (들). 참고 : 본 연구의 발판은 인간의 DAT (28), 돼지 DDT 8 및 돼지 DLV (32)에 대한 발표 탈세 포화 프로토콜에 따라 작성되었습니다. 50 ㎎ / ㎖ - 시판 불용성 콜라겐은 또한 (10)의 농도 범위에 걸쳐 성공적으로 사용되어왔다 소 힘줄로부터 공급 콜라겐 마이크로 발포체를 제조하는데 사용될 수있다. 다른 불용성 콜라겐 소스가 이용 될 수 있지만, 안정적인 발판을 얻을 것 농도 범위를 식별하는 데 최적화가 필요할 수 있습니다. </li><li> t, 조직 잠수함 충분한 증류수 (DDH 2 O)을 겸자로 50 mL의 원심 분리 튜브에 수화 탈세 포화 된 조직 또는 정제 된 콜라겐을 옮기고 추가35 mL의 OA의 최대 총량. </li><li> 후속 동결 건조 중에 승화 표면적을 최대화하기 위해 냉동 중에 가로 배치 된 원심 분리 튜브에, -80 ° C에서 밤새 샘플을 동결. </li><li> 원심 분리기 튜브의 캡을 제거하고 동결 건조 항아리에 냉동 샘플을 전송합니다. </li><li> 72 시간 또는 완전히 건조 될 때까지 - (48)에 대한 실험실 동결 건조기를 사용하여 샘플을 동결 건조. 참고 : 시간을 건조하는 것은 다른 lyophilizers 및 탈세 포화 된 조직에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> (- 3 ~ 2mm 1) 날카로운 수술 가위를 사용하여 미세하게 작은 조각으로 동결 건조 된 ECM 말하다. </li><li> 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 데시 케이 터에서 다진 ECM을 저장합니다. 참고 : 다진 ECM 환경에서 수분 흡수를 방지하기 위해 즉시 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> Cryomilling (거품 제조를위한 선택 사항) <ol><li> laborato에 대한 25 mL의 스테인레스 스틸 밀링 챔버 채우기리 볼 밀 다진 동결 건조 ECM와 시스템이 개 10mm 스테인레스 스틸 밀링 공을 추가합니다. </li><li> 완전히 닫고 3 분간 액체 질소에서로드 밀링 챔버 잠수함. </li><li> 밀 30 헤르츠 (Hz, 1,800 RPM)에서 3 분의 냉동 샘플. </li><li> 전자 재료가 미세 분말로 분쇄 될 때까지 반복 1.2.2와 1.2.3 단계를 반복합니다. 참고 :이 단계는 ECM 소스 사이에 다를 수 있습니다 반복하는 회수입니다. 예를 들어, DAT는 일반적으로 미세 분말을 생성하는 3 밀링 사이클을 요구한다. </li><li> 유리 바이알에 scoopula를 사용하여 분말을 전송 단단히 밀봉하고, 데시 케이 터에 보관. </li></ol></li><li> ECM 서스펜션 준비 <ol><li> ECM (또는 마이크로 발포체 용) 중 (발포체) 또는 다진 cryomilled 250 mg의 칭량하고, 15 mL의 원심 분리 튜브로 옮긴다. 각각 다진 ECM 및 cryomilled ECM의 준비 1.1.6 절 단계 1.2 참조. 주 :이 프로토콜은 50 ㎎ / ㎖ ECM suspen을 준비하도록 설계, 시온 인간의 DAT, 돼지 DDT 및 돼지 DLV 권장된다. 특정 ECM 소스에 따라, 균일 한 현탁액은 높거나 낮은 출발 농도로 생성 될 수있다. </li><li> 0.22 M의 NaH 2 PO 4 (PH 5.4)을 원심 분리 튜브에 버퍼 튜브의 유체 레벨을 표시 5 mL를 추가한다. </li><li> 1 mL의 0.22 M의 NaH 2 PO 4 (PH 5.4) 완충액으로 α 아밀라아제 7.5 mg을 첨가하여 α 아밀라아제 원액을 준비한다. , α 아밀라아제 원액 100 μL를 추가 상기 샘플 (α 아밀라아제 0.75 mg을 0.3 % / 드라이 조직 w w). 10 ㎖의 최종 부피를 얻기 위해 0.22 M의 NaH 2 PO 4를 추가한다. </li><li> 실온에서 72 시간 동안 300 rpm에서 계속 교반 현탁액. </li><li> 10 분 동안 1,500 XG에서 현탁액을 원심 분리기. 조심스럽게 수집하고 소화 ECM 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. DDH 2 O. 희석 5 % 10 ㎖의 염화나트륨에 펠릿을 재현 탁 소재 </li><li> DDH 2 O. 5 % 염화나트륨 린스 두 개의 단계를 반복 1.3.5 </li><li> 상층 액을 제거하고 2 DDH O. 10ml에 펠렛을 재현 탁 소재 </li><li> RT에서 10 분 동안 300 rpm에서 계속 교반 현탁액. </li><li> 10 분 동안 1,500 XG에서 현탁액을 원심 분리기. 조심스럽게 수집하고 소화 ECM 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. </li><li> 단계 1.3.2에서 제조 된 5 ㎖ 마크 0.2 M 아세트산을 추가한다. </li><li> 37 ° C에서 120 RPM의 O / N에서 연속적으로 현탁액을 교반한다. </li><li> 보이는 단편이 남아 있지 않을 때까지 톱니 폭 10㎜ 프로브가 장착 된 휴대용 균질기를 사용하여 10 초 간격으로 실온에서 ECM 현탁액 균질화. 과열을 방지하기 위해 균질화 간격 사이 찬물 비이커에 서스펜션을 배치. 주 : ECM 소스에 따라, 0.2 M 아세트산에 추가로 희석하여 균일 현탁액을 얻는 것이 요구 될 수있다. 이자형전자 재료 현탁액 xcessive 냉각 효율 균질화를 방해 할 수있는 점도가 증가 될 수있다. 점도의 증가가 주목되는 경우, 샘플은 37 ° C에 다시 가온하고 추가 처리를 실시 할 수있다. </li><li> 최대 1 개월 전 폼 또는 미세 전달체 제조에 4 ° C에서 보관. </li></ol></li></ol> 2. ECM 파생 폼 제작 <ol><li> 현탁액 따뜻한까지 120 rpm에서 계속 교반하면서 37 ℃에서 단계 1.3.13의 ECM 현탁액 (또는 다진 cryomilled)을 인큐베이션. </li><li> 원하는 농도 0.2 M 아세트산 산성의 ECM 현탁액을 희석. 주 : DAT, DDT와 DLV에 권장 범위의 50 ㎎ / ㎖ - - 15, 100 ㎎ / ㎖ 전자 재료 소스에 따라, 안정한 발포체 (10)의 범위로 제조 될 수있다. 일반적으로, 더 높은 농도로 제조 된 발포체는 약간 덜하지만 다공성 배양에 더 안정적이고 취급이 쉬워진다. </li><li> 3 ml 주사기 w 사용전자 재료 현탁액 중의 기포 형성을 방지하기 위해 18 G 바늘 i 번째의 ECM 서스펜션 원하는 주형을 채우기. 상기 DAT, DDT 및 DLV 발포체를 제조 48- 웰 세포 배양 - 처리 된 플레이트에 35 ㎎ / ㎖의 ECM 현탁액 400 μL를 분배한다. 주 : 선택된 금형의 형상 및 ECM 현탁액의 부피는 생성 된 거품의 형상을 결정한다. </li><li> 커버와에 배치 -20 C ° 또는 -80 C 냉동고 °에서 하룻밤 금형을 동결. 주 : 동결 온도가 폼의 다공성에 영향을 미칠 수 있습니다. -80 ° C에 비해 샘플 인해 큰 얼음 결정 (33)의 형성을 -20 ℃에서 냉동 될 때 더 큰 기공이 예상된다. 균일 한 기공 구조를 가진 발포체를 제조하기 위해, 몰드 방향 냉각 방지 도전성 표면과 접촉하지 않는 것을 보장한다. </li><li> 동결 건조기 플라스크에 냉동 샘플을 포함하는 금형을 놓습니다. LABORAT에 동결 건조기 플라스크를 연결합니다ORY 동결 건조기 시스템과 24 시간 동안 건조. 참고 : 샘플 전에 동결 건조에 냉동 상태를 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> 필요한 때까지 데시 케이 터에서 동결 건조 된 폼을 저장합니다. </li></ol> Electrospraying를 통해 3 ECM 파생 미세 전달체 제조 참고 : 설정 한 electrospraying의 개요는 그림 2에 표시됩니다. <ol><li> 100 RPM의 O / N에서 계속 교반하면서 37 ℃에서 단계 1.3.13의 cryomilled ECM 현탁액 인큐베이션. 참고 Cryomilled ECM이 현탁액에 더욱 균일 성을 보장하고 electrospraying 중에 막힘을 방지하기 위하여 ECM 유래 마이크로을 제조하는데 사용된다. </li><li> 부하 (3) 3 ML 루어 로크 시린지로 ECM 현탁액 mL의 주사기의 구멍에 주입 세트 날개 부착. 주 : 니들 게이지의 범위가 선택 얻어진 마이크로 크기 및 형상에 영향을 미칠 수 있음을 인식하고 사용할 수있다. fabricat하려면전자 날엔, DDT 및 DLV의 마이크로, 25 G 바늘을 사용합니다. </li><li> 주사기 펌프 내에 주사기를 고정합니다. 레토르트 스탠드 바늘을 고정 및도 4의 거리에서 수직으로 바늘 끝 위치 - 로우 형 듀어 플라스크의 상단에서 6cm (250 - 500 ㎖ 크기 범위 권장). </li><li> 바늘의 팁에 악어 클립 전극을 부착하고, 상기 고전압 전원의 양극 단자에 연결한다. </li><li> 진공 플라스크의 가장자리 위로 알루미늄 포일 (12 X 5cm)의 스트립을 접어. </li><li> 호일의 외부 가장자리에 제 악어 클립 전극을 부착하고 전원의 그라운드 소스 단자에 연결한다. </li><li> 호일이 잠기도록 ¾의 상단으로부터 약 1cm에 액체 질소 듀어 플라스크를 채운다. 참고 : 액체 질소로 가득 듀어 플라스크를 유지하는 것이 중요합니다. 액체 질소의 표면은 electrospraying의 사전 처리 동안 플라스크의 상부로부터 2cm보다 덜 없어야에스. 액체 질소의 충진은 연속 electrospraying 동안 일정한 수준을 유지하는 것이 요구된다. </li><li> 30 ㎖ / H의 주입 속도로 시린지 펌프를 설정한다. 참고 : 주입 속도를 변화하면 미세 전달체 모양 및 직경을 변경할 수 있지만, 권장 범위는 25 수 - 35 ㎖ / 시간. 이 현탁액의 점도에 크게 의존하지만, 25 ㎖ / 시간 이하의 유속이 큰 마이크로 생성 될 수있다. 매우 낮은 유속에서, 마이크로 크기와 모양이 덜 균일해질 수있다. 35 mL의 / h를 상기 주입 속도로, electrospraying 통해 생성 액 적의 균일 성이 더 넓은 크기 분포 34와 비구면 마이크로 결과, 중단 될 수있다. </li><li> 20 kV로의 전압을 적용하고 electrospraying을 시작하기 위해 주사기 펌프를 켭니다. 주 : 전압 조정 상기 마이크로 크기를 다양하고 경향 될 수는 infusio보다 직경에 큰 영향을 미칠N 비율. 25 kV의 - 권장 전압 범위는 15입니다. 마이크로 캐리어 직경의 감소는 전압 (35)의 증가에 따라 예상된다. </li><li> 주입이 완료되면, 신중 냉동 유지하기 위해 액체 질소 ~ 25 mL의 일시 중단 마이크로 떠나는 듀어에서 초과 액체 질소를 부어. </li><li> 즉시 한 부드러운 동작으로 주입하여 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 액화 질소와 마이크로 옮긴다. scoopula로 듀어에 남아있는 냉동 마이크로를 수집하고 원심 분리기 튜브에 추가합니다. 참고 듀어의 크기에 따라 액체 질소에 마이크로 처음 중형 용기에 주입 한 다음, 50 mL의 원심 관에 즉시 전송 될 수있다. </li><li> 동결 건조 제제 용의 작은 구멍 뚫린 알루미늄 호일로 액체 질소의 미세 전달체를 포함하는 원심 분리 튜브 커버. </li><li> 피복 된 원심 분리기를 놓습니다동결 건조기 플라스크에 넣고 튜브. 즉시 동결 건조기 플라스크를 연결하고 샘플 O / N을 건조. 참고 : 해동 붕괴 및 / 또는 통합 될 수 있습니다 것처럼, 그들은이 단계 전에 해동하지 않도록하기 위해 액체 질소에 현탁 마이크로을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 500 ㎛ 크기 - 상술 electrospraying 조건을 사용하여 35 ㎎ / ㎖의 농도로 제조 DAT, DDT와 DLV 마이크로 일반적으로 수화 된 직경 (350) 사이의 범위가된다. 크기 분포는 ECM 소스에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 필요한 때까지 데시 케이 터에서 동결 건조 된 마이크로를 저장합니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig2.jpg" /> 그림 미세 전달체 제조에 사용되는 Electrospraying 장치의 2 개요. A : 주사기 펌프를 포함하여 키 electrospraying 장비의 배치를 도시 이미지고전압 전원 장치뿐만 아니라, 액체 질소 듀어 니들 상대적인 위치. B는 : 전압, 주입 속도 및 거리에 대한 권장 범위를 포함한 회로도 Electrospraying. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 세포 배양 4. 준비 거품과 마이크로 담체 <ol><li> 재수 <ol><li> (에탄올의 비율은 1 ~ 5 발포체)를 초과 무수 에탄올 (~ 99.9 %)를 함유하는 50 mL의 원심 분리 튜브에 집게 동결 건조 발포체 옮긴다. 마찬가지로, 수집에 사용 된 원래 원심 분리 튜브 내에서 과량의 무수 에탄올을 동결 건조 된 마이크로 재현 탁. 혈청 학적 피펫을 사용하여 임의의 응집물을 제거하고, 원하는 크기 범위에 대해 선택하는 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 정의 메쉬 크기의 체를 통해 스테인레스 마이크로 필터. 참고 : 폼이 FPC 기판 플레이트 내에서 제조되는 경우, 이러한 혈관에서 직접 재수 할 수 있습니다. </li><li> 4 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션하거나 또는 마이크로 발포체가있을 때까지 중력은 원심 관의 바닥에 침전. 멸균 시약 및 적절한 무균 기술을 사용하여 층류 후드에서 모든 후속 단계를 수행한다. </li><li> 혈청 학적 피펫을 사용하여 무수 에탄올을 제거하고 과량의 추가 골격 내지 (5 1 비율) 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석하고 95 % 에탄올. 4 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션하거나 ECM 유래 골격은 재수 화 용기의 바닥에 가라까지. </li><li> 점차적 (멸균 PBS로 희석하여 90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 및 0 %), 에탄올 시리즈를 통해 지지체를 재수. 골격이 용액을 변경하기 전에, 용기의 바닥에 가라까지의 각 단계에서, 39 ° C에서 배양한다. 골격 내의 버블 형성 OBS 경우 광 진공하에 발판을 탈기erved. </li><li> 잔류 에탄올을 제거하기 위해 2 개의 추가 헹굼을 위해 멸균 PBS를 교체합니다. </li><li> 세포 배양을위한 준비가 될 때까지 4 ° C에서 100 % 멸균 PBS에 보관하십시오. 재수 다음 이주 - 1 내에서 비계를 사용합니다. </li></ol></li><li> 셀 시드를위한 준비 <ol><li> 종래 시딩 당일, 세포 배양 웰 처리 된 플레이트 또는 트랜스 웰 인서트에 겸자를 사용하여 발포체를 전송 완전히 골격 (예를 들면, 2.5 ㎖ / 지지체하여 잠수함 (관심의 세포 유형에 따라 선택)에 충분한 세포 배양 배지를 추가 12- 웰 플레이트). 마이크로 중간 : 1 비율 마찬가지로, 중력에 마이크로 신중, 원심 튜브 내의 맺은 마이크로을주지 않고 혈청 피펫을 사용하여 PBS를 제거하고, (5)를 달성하기 위해, 세포 배양 배지를 추가 할 수 있습니다. 주 : 인간의 ASC를 시드, 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)를 이용한다 : 햄 F12 영양소 혼합물로 보충10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신. </li><li> 하나 개 린스의 총 세포 배양 배지를 교체합니다. </li><li> 37 ℃에서 세포 배양 배지에 비계 밤새 평형. 공사장 공중 발판 다음날 시딩 셀에 대한 준비가 될 것입니다. 주 : 발포체 정적 세포 배양 용 삽입 또는 조직 배양 웰 플레이트 (29)에 시드 또는 동적 실험용 진탕 기 (36)를 이용하여 시드 될 수있다. 전자 재료 소스, 처리 방법 및 현탁액의 농도에 따라 동적 시드 초기 세포 부착, 증식과 침윤을 향상시킬 수있다. 마이크로은 스피너 배양 시스템 (11)을 이용하여 동적으로 파종 될 수있다. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

2D FPC 기판에 기초한 합성 골격 또는 표준 배양 모델에 비해 일반적으로, 탈세 포화 조직 유래 bioscaffolds 더 밀접 원시 세포 미세 환경에서의 ECM의 복잡한 3D 구조 및 조성에 근접 할 수있다. 앞서 설명한 바와 같이, 셀 ECM 상호 작용 문화와 본체 (1)의 셀룰러 행동을 중재에서 매우 중요하다. 전자 재료의, 생화학, 생물 물리학 및 생체 역학적 특성이 각 조직에 고유 한 것을 인식뿐만 아니라 더의 개발, 조직 공학을위한 생체 재료의 설계에 조직 특이 적 접근 방식을 적용하기위한 이론적 근거를 지원하기 위해 증거가 증가하고있다 시험관 실험 (20)에 대한 생리 학적으로 관련 문화 모델. 출발 물질로서 탈세 포화 된 조직을 활용하여 우리의 방법은 더 CUST 내의 조직 특이 ECM의 복합체 조성물을 포함 할omizable 비계 형식을 지원합니다. 기계적 및 효소 처리 단계는 기본 ECM의 미세 구조의 손실이 발생되지만, DAT와 이전 연구는 bioscaffold 조성물이 중요한 매개체임을 시사 지방 유래 ECM의 유익한 효과는 이들 지지체 형식으로 보존되어 있음을 보여 주었다 세포 기능 (11), (29). 본래의 탈세 포화 된 조직과 비교하여 세포 배양 용 기재와 ECM 유래 발포체 마이크로을 사용하는 중요한 장점은 셀 분포 및 세포 - 세포 / 세포 ECM 상호 작용의 균일 성을 개선 할 수있는,보다 균일하다는 것이다. 여기에 설명 된 방법은 세포 배양과 조직 공학적 응용에 사용하기위한 조직 특이 bioscaffolds 광범위한 어레이를 생성하는데 이용 될 수있다. 예를 들어, DAT, DDT 및 DLV뿐만 아니라, 우리의 실험은 성공적으로 3D의 포를 생성하기 위해 이러한 기술을 적용하고있다탈세 포화 된 뼈, 연골, 수핵 및 고리 섬유증뿐만 아니라, 소 힘줄에서 파생 된 시판, 불용성 콜라겐을 사용하여 조직 구성 단위 폼. 체외 관점에서 볼 때, 이러한 bioscaffolds는 높은 처리량 약물 검사 플랫폼 (39), 또는 줄기에 대한 교육적 행렬의 생리 활성 기판으로, 세포 생물학, 생리학 또는 질병 병리학 (38)을 조사하기위한 높은 충실도 3D 문화 모델의 근거로 사용될 수 세포 분화 (40), (41). (25)의 농도로 제조 DAT, DDT와 DLV 발포체 - 50 mg의 / ㎖가 (이십팔일까지 시험) 시험 관내 배양에서 장기적으로 안정하다. 적어도 2 주 - (15 RPM 10) 또한, 마이크로 모든 세 가지 유형의 저 - 전단 로딩 배양 시스템에서 동적 조건 하에서 세포 부착 및 증식을 지원할 수있다. 생체 내 응용 프로그램의 경우, 생체 적합성 및 biodegradaBLE ECM 파생 폼 및 마이크로 건설적인 조직 리모델링 및 재생 (11), (29)을 자극하는 기성 제품으로 약속을 누르고 있습니다. 또한, 세포 접착 성 지지체는 세포 치료제 전달 시스템 (42), (43)로서 사용될 수있다. 예로서, DAT 발포체는 동종의 ASC로 접종하고 면역 쥐 모델 (29)에 피하 주입시 혈관 및 지방 형성을 촉진하는 것으로 하였다. 이들은 12 주까지 흡수가 숙주 조직에 통합 거의 완료되었다로서 그대로 DAT에 상대적으로 더 높은 처리 DAT 체적 50 % 감소로, 더 빠르게 저하 발포체 3주에 주목했다. 그러나, 발포체는 또한 효소 소화 ECM 독특한 친 재생 효과를 시사 한 것으로, 더욱 강력한 혈관 신생 반응을 유도. 마찬가지로, ECM 유래 마이크로 체외로 사용될 수 &lt;/ EM&gt; 동적 시스템 내의 배양 세포 배양 기질과 같은 주사 세포 전달 비히클 11, 30, 44. 세포 생존율을 지원 주입 (30)의 부위에 세포 보존을 증가시킬 수있는 매트릭스를 제공하면서보다 구체적으로, 마이크로 작은 직경과 큰 표면 영역은, 소량의 셀의 많은 양의 전달을 가능하게 할 수있다. 모든 살아있는 시스템에서 사용하기에 앞서 소스 ECM 부정적인 응답하여 호스트 (7)를 트리거 할 수있는 항원 세포 성분 및 / 또는 잠재적으로 독성 탈세 포화 시약 거의없는 것을 보장하기 위해 중요하다. 단백질 분해 효소 펩신은 일반적 ECM 유래 하이드로 겔 (15)의 제조에 사용된다. 펩신은 콜라겐과 다른 ECM 단백질 int로 소화하는 비특이적 프로테아제작은 조각 45 O. 펩신 소화 ECM에서 제조 된 하이드로 겔은 세포 유익한 영향을 미칠 것으로보고되었지만, 한정이 물질 (46)이 매우 기계적으로 약한 경향이 있다는 것이다. 미세 전달체 DAT 당초 개발에서는 펩신 소화 DAT는 알긴산과 함께 구형 비드 (30)를 형성하기 위해 CaCl2를 적하시킨 합성 방법을 이용했다. 비드이어서 광 가교이었고, 알긴산 나트륨 시트 레이트를 사용하여 추출 하였다. 950 μm의 30 - 화학적 가교 결합에 대한 요구 외에도, 키 제한이 방식으로 제조 된 마이크로 (900)의 크기 범위보다 열악한 안정성 것으로했다. 펩신 대신에, 여기에서 제시된 방법은 telope에서 탄수화물 군을 절단하도록 가정된다 α 아밀라아제 당분 해 효소와 ECM보다 가벼운 분해를 이용콜라겐 ptide 영역하여 아세트산 37의 용해도를 증가시킨다. 이 방법은 화학적 가교 결합 또는 다른 첨가물없이 순수 ECM 파생 폼과 마이크로를 생성하는 데 사용할 수 있습니다 높은 중합 콜라겐의 분리를 가능하게한다. 이러한 bioscaffolds 네이티브 ECM의 미세 콜라겐 유사 잘 보존 콜라겐 원 섬유 사이에 물리적 인 상호 작용 및 수소 결합을 통하여 안정화된다. 발포체는 선택된 특정 몰드 형상에 따라 넓은 범위로 제조 될 수있는 매우 유연한 플랫폼이다. 세포 배양 연구의 경우, 폼은 코팅 또는 다양한 두께의 3 차원 인공 지지체를 형성하기 위해, FPC 기판의 웰 플레이트에 직접 주조 할 수있다. 매우 균일 한 표면을 갖는 3 차원 발포체를 제조하기 위해서는 정의 몰드 플라스틱 또는 유리 슬라이드 양면에 밀봉 할 수 있도록 설계하는 것이 좋다. 어느 다진 또는 cryomilled ECM을 합성하는데 사용될 수있다발포체. 일반적으로, 우리는 cryomilled 발포체 거시적 연약하고, 낮은 농도 31 36보다 파괴 미세 구조를 갖는 경향이 있음을 발견 하였다. 조직 공급원에 따라, 추가적인 기계 가공 단계는 세포의 기능에 영향을 미칠 수있는 ECM의 조성에 변화가 발생할 수있다. 예를 들어, 이전 연구에서, 라미닌은 다진 DLV 폼에서 검출하지만, DLV (31) 거품이 cryomilled되지 않았습니다. 대조적으로, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 및 피브로넥틴 다진 모두 검출 DAT 36 cryomilled 발포 하였다. 기계 가공 단계에 더하여, 발포체의 기공율 및 기공 크기는 ECM 현탁액 농도 및 동결 온도 (47)을 변화시켜 어느 정도 조정될 수있다. 일반적으로, 농도가 낮은 발포체 (~ 10-15 ㎎ / ㎖)을 정 성적으로 더 다공성이지만 빠르게 수축있다 불량이장기 배양 31, 36의 안정성. 유사하게, 일반적으로 더 높은 냉동 온도에 의해 달성 느린 냉동 속도, 29 인해 제조시 형성되는 얼음 결정의 크기 발포체의 큰 공극을 초래할 수있다. 이러한 매개 변수는 모두 부착, 침투 및 리모델링을 포함하는 물질로 세포 상호 작용에 영향을 미칠 수있다. 예를 들어, ECM 높은 농도로 제조되는 발포체에 세포 성장, 특히 다진 ECM 소스와 정적 인 배양 조건 하에서 (36) 표면 영역에 제한 될 수있다. 마이크로 들어, 튜닝 될 수있는 주요 파라미터는 더 높은 농도는 일반적으로 장기 배양 동적하에 더 안정한 마이크로 항복과 ECM 현탁액 농도 게이지 바늘 및인가 전압이다. electrospraying의 개시에 따라, ECM의 suspens이온 액 빠르게 알루미늄 박 집 전체의 방향을 향하여, 플라스크의 중심에 해당한다. 응집을 방지하기 위해, 상기 비드에 앞서 호에 액체 질소를 문의하는 것이 중요하다. 바늘과 액체 질소의 표면 사이의 거리가 이러한 요건을 충족하도록 조정될 수있다. 안정된 bioscaffolds를 생성 농도 범위를 선택하는데 그 최적화는 특히, 각각의 ECM 특정 소스의 특성에 따라 요구 될 수있다 중요하다. 또 다른 중요한 요소는 ECM 또는 부정적인 결과 발포체 마이크로의 안정성에 영향을 미칠 수있는 잔여 시약 (예를 들면, 계면 활성제)의 존재 하에서 저하 탈세 포화 방법으로, 출발 물질을 생성하는 데 사용되는 탈세 포화 프로토콜이다. 문제는 bioscaffold 안정성,보다 점진적으로 수분 보충 프로세스를 사용하여 포함 조사 할 수있는 옵션, 전자 재료 SUSP 증가와 함께 발생하는 경우ension 농도, 그리고 cryomilled ECM 대 다진 조사 등도. 이러한 모든 옵션이 문제를 해결 못하면, 탈세 포화 프로토콜 또는 ECM 소스 대안을 모색 할 필요가있다. 비계 생산시 재현성을 보장하기 위해 특별한주의가 프로토콜의 특정 단계에서주의해야합니다. 탈세 포화 조직 cryomilling하면은 밀링 인해 환경으로부터의 수분의 흡수에 즉시 입자 응집의 가능성을 줄이기 위해 건조한 환경에서 동결 건조 후에 실시하는 것이 권장된다. 미세 전달체 제조 동안에, 상기 바늘의 막힘을 초래할 수있는 샘플 냉각 문제를 방지하기 위해, 현탁액을 3 ㎖의 최대 양으로 소량의 electrosprayed 것을 제안한다. 또한,이 마이크로는 electrospraying 과정 후 해동 할 수 없습니다 것이 필수적이다. 그 구면 형상 및 기계적 안정성의 microcarri을 유지할ERS는 액체 질소 충전 용기 반송 액체 질소에서 수집하고, 즉시 동결 건조한다. 마지막으로, 폼 및 마이크로 모두, 재수 단계가 여러 일의 기간에 걸쳐 서서히 수행하는 것이 중요합니다. 빠른 재수는 다량 및 / 또는 마이크로 스케일 구조물이 붕괴 될 수있다. 또한, 재수 광 진공 하에서 탈기에 상당한 시간을 필요로 할 수 골격 내의 작은 기포의 형성을 방지하기 위해 천천히 발생한다. 결론적으로,이 글에서 제시 한 방법은 순수, 비 화학 가교 ECM 이루어지는 조직 특이 발포체의 다양한 마이크로 어레이를 제조 할 수있다. 생물학적 연구를위한 장점은 bioscaffolds 취급이 용이하며 조직학, 면역 조직 화학, 또는 유전자 발현 및 단백질 분석과 같은 기술을 사용하여 분석을 수행 할 때 조직과 유사하게 처리 될 수 있다는 것이다.또한, ECM 유래 골격 시드 세포 집단을 추출하는 효소 적으로 분해 될 수 있거나 분해 생체 세포 전달 비히클로서 직접 사용할 수있다. 전반적으로,이 유연한 플랫폼 기술은 세포 확장 기판 등의 세포 기능을 조사 3D 세포 배양 연구에 등 다양한 애플리케이션을위한 훌륭한 유틸리티를 보유하고 프로 재생 bioscaffolds.

세포 외 기질 (ECM)는 단백질, 당 단백질, 다당류 (1)의 복잡한 3 차원 네트워크로 구성된다. 일단 주로 골격 구조로 간주 이제 잘 ECM 중요한 기능적 역할 2 생체 활성 분자의 다양한 배열을 포함하는 것이 인식된다. ECM 세포의 상호 작용은 세포 생존, 부착, 이동, 증식 및 분화를 지시 할 3. ECM 거대 분자의 주요 클래스는 일반적으로 잘 조직 종에 걸쳐 보존되어 있지만, 각 조직에 고유 매트릭스 조성 및 구조 (4)를 구비하고있다. 전반적으로, 조직 특이 ECM은 조직 / 기관의 스케일 (5)에 세포 내에서 기능을 매개 유익한 미세 환경을 제공한다. 때문에 세포 기능을 중재에서 ECM의 중요한 역할로, 드에 대한 관심이 증가하고있다조직 공학 및 재생 의학에 응용 프로그램에 대한 ECM-파생 bioscaffolds의 velopment. 특히, 탈세 포화하는 방법은 광범위하게 조직 재생 및 세포 전달 5, 6, 7에 대한 발판 재료로서 사용하기위한 조직의 넓은 범위에서 ECM을 획득하는 수단으로 탐구하고있다. 탈세 포화는 통상적으로 이상적인 ECM (8)의 3 차원 구조와 구성에 최소한의 변경을 일으키는 반면, 세포 및 세포 성분을 제거 대상으로 기계적, 화학적 및 / 또는 생물학적 치료 일련의 단계를 포함한다. 문헌 조사를 통해, 다양한 탈세 포화 프로토콜은 몸 (7) 거의 모든 조직에 대해 식별 할 수 있습니다. 탈세 포화 된 이식 조직을 3 차원 골격 또는 세포 배양 용 기재로 직접 사용할 수 있지만 세포 침투 월ECM 치밀한 구조 (9)의 조직에서 한정 될 수있다. 또한, ECM의 자연적 이종성 잠재적 세포 응답 (10)에 영향을 미칠 수있는 탈세 포화 된 행렬 내의 세포 부착 및 분포의 변화를 일으킬 수있다. 전반적으로, 자신의 본래 형태로 탈세 포화 된 조직을 적용, 일부 응용 프로그램에 대한 약속은 제한된 형태, 다공성 및 강성을 포함한 조정 발판 속성의 측면에서 다양성뿐만 아니라 생체 내 응용 프로그램에 대한 전달의 모드를 제공하면서. 이러한 한계를 회피하기 위해, 다수의 연구 그룹은 기재로서 탈세 포화 된 조직을 사용하여 사용자 정의 골격 포맷을 생성하기 위해 상기 처리 방법을 적용한다. 가장 간단한 형태에서, 이것은 주 조직 특이 ECM 입자 (11)를 생성하는 조직을 탈세 포화 cryomilling 포함 할 수있다. 이러한 ECM 입자는 세포 INSTRU로 통합 될 수있다이러한 하이드로 겔 12, 13, 14, 가교 시츄 다른 생체 재료와 복합 지지체에 성분이 뽑은. 기계 가공 이외에, 탈세 포화 된 조직은 3D 인쇄 효소 단백질 분해 및 / 또는 ECM 유래 히드로 겔, 폼, 미세 전달체를 제조 당분 해 효소, 및 코팅 (15, 16), (17)와 소화뿐만 아니라 합성 bioinks을 실시 할 수있다 (18). 조직 공학 응용 프로그램뿐만 아니라, ECM-파생 bioscaffolds 생물학적 연구를위한 체외 모델에서 더 높은 충실도의 생성을위한 큰 잠재력을 보유. 더 나은 기본 세포 미세 환경 (19) 요점을 되풀이 3D 세포 배양 시스템을 개발하기 위해 상당한 필요가있다. 대부분의 체외 C최신 엘 배양 연구는 생체 조직 (20) 내에서 발견되는 생물학적 복소 동적 셀룰러 환경과 거의 상관성을 갖는 조직 배양 폴리스티렌 (FPC 기판) 상에 수행된다. 이러한 단순화 된 2D 경질 기판 상에 세포를 조절 된 환경에서 세포의 상호 작용을 연구하는 동안 배양 편리 22 세포 부착 및 형태뿐만 아니라, 두 세포 - 세포 및 세포 - ECM을 변경한다 (21)의 상호 작용. 2D FPC 기판 관찰 셀룰러 적응 생체 내 시스템 (23)에 2 차원 모델링 연구의 관련성 묻지 생존, 증식, 이동 및 분화를 포함하여 다양한 세포 기능을 조절하는 세포 내 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수있다. 휴대 행동이 3D 시스템 24 대 2D 매우 다양하고, 생화학 및 양방향 그 수 증가 인식이 있었다전자 재료와 omechanical 신호는 세포의 기능 (25)의 중요한 매개체이다. 많은 그룹은 콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴 등의 ECM 구성 요소와 FPC 기판을 코팅에 의해 설립 2D 시스템의 한계를 극복하려고했습니다. 이러한 전략은 세포 부착을 향상시킬 수 및 세포 반응을 변경할 수 있지만,이 모델은 기본 ECM (26), (27)의 복잡한 공간 조직 또는 생화학을 모방하지 않습니다 자신의 2D 구성에 의해 제한 상태로 유지됩니다. 우리의 생명 공학 연구소는 3 차원 세포 배양 및 조직 공학 응용을위한 기판으로 ECM 파생 bioscaffolds의 개발에 관심이있다. 특히, 우리는 지방 재생 (28)을위한 발판 플랫폼으로 탈세 포화 지방 조직의 사용 (DAT)를 개척했다. 또한, 우리는 D를 이용하여 3 차원 마이크로 다공성 발포체를 합성하는 방법을 확립단백질 분해 효소 펩신이나 당분 해 효소로 분해 AT α 아밀라아제 29, 30, 31. 특히, 우리는 지방 유래 ECM 문화에서 인간 지방 유래 줄기 / 기질 세포 (ASC를)의 지방 세포 분화 유도 미세 환경을 제공 이러한 지지체 형식의 모든 걸쳐 증명하고있다. 최근에, 우리는 (32. 웨인 라이트 등 각색 탈세 포화 방법) 좌심실 (DLV) 탈세 포화 α 아밀라아제 소화 돼지로부터 3 차원 다공성 발포체를 생성하기 위해 제조 방법을 확장하고, 그들이 초기 cardiomyogenic을 유도하는지지 플랫폼을 제공하는 것으로 나타났다 인간의 심낭 지방 유래의 ASC (31) 마커 식입니다. 이 문서 상세 순수 유래 비 화학 가교 발포체 차원 다공성 및 미세 전달체 합성 방법을 설명시험관 내에서 세포 배양 기질에 생물학적으로 복잡한 3D로 사용 및 조직 재생 용 생체 재료로 ECM을 α 아밀라아제 소화. 이론적으로, 고 분자량의 콜라겐을 함유하는 임의의 ECM 소스는 이러한 기술을위한 출발 물질로서 사용될 수있다. 이 방식의 유연성을 설명하기 위해, 방법은 인간 DAT를 이용한 조직 - 특이 bioscaffolds 생성에 적용되어, 탈세 포화 된 돼지의 피부 조직 (DDT) 8, 대표적인 예로서 돼지 DLV. 도 1은 ECM 유래 발포체 용 마이크로 제조 공정의 개요를 시각적으로 제공한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig1.jpg" /> 그림 조직 고유의 ECM 파생 거품과 마이크로 담체의 제조 방법 1. 개요. 1. 조직의 탈세 포화 확립에 따라 제조 감속lularization 프로토콜은, 조직 - 특이 ECM 유래 bioscaffold 제조에 사용될 수있다. 육안 이미지, 돼지 DDT (플린 2,010 28에 기술 된 바와 같이 제조) (Reing, JE, 등에 기술 된 바와 같이 제조. 2010 8) 수화 인간 DAT로 도시되고, 웨인 라이트 등의 설명에 따라 돼지 DLV는 (제조. 2010 32 ) 출발 물질로서 사용될 수있다 ECM 소스의 대표적인 예로서. 스케일 바는 3cm를 나타냅니다. 2. 탈세 포화 된 조직은 동결 건조 된 후, 3. 기계적으로 다진. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. 4. 다진 ECM은 발포체 제조에 대해 선택적이다, cryomilled하지만 미세 전달체 합성에 요구 될 수있다. 스케일 바는 3mm를 나타낸다. 제 다진 또는 cryomilled ECM이어서 α 아밀라아제로 분해하고 ECM 균질 현탁액을 만들 균질화. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. <str옹&gt; 폼 제조용 6A)는 ECM 현탁액은 잘 정의 된 형상을 갖는 다공성 3 차원 지지체를 생성하기 위해 사용자 정의 형, 냉동 및 동결 건조에 전송된다. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. 6B) 미세 전달체의 제조를 들어, ECM cryomilled 현탁액 이산 구면 마이크로 electrosprayed를 생성한다. 스케일 바는 2mm를 나타낸다. 제 발포체는 서서히 마이크로 재수 세포로 접종 될 수있다. 대표적인 이미지 (생세포 = 녹색) 인간의 ASC로 나타낸 DAT 발포체 (왼쪽)과 DAT의 미세 전달체 (오른쪽)에 시딩 하였다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>아세트산, 빙하</td><td>BioShop</td><td>ACE222.500</td><td></td></tr><tr><td>앨리게이터 클립 리드</td><td>VWR</td><td>470149-728</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-aspergillus</td><td>aryzae의</td>아밀라아제 <td>시그마</td><td>101074694</td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004251</td><td>15 & 50 mL 원심분리기 튜브용 스윙 버킷 로터 포함</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(15mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(50mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>소 아킬레스건에서 추출한 콜라겐(불용성)</td><td>Sigma</td><td>C9879&nbsp;</td><td>또는 유사한 불용성 콜라겐 공급원; 폼 및 마이크로 캐리어를 제조하기 위해 탈세포 화 된 조직의 대안으로 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>크라이 밀링 시스템</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>MM 400</td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>8624426</td><td>동결 건조 ECM 및 바이오 스캐폴드 저장</td></tr><tr><td>DMEM : F12 Hams</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>증식 매체에 사용</td></tr><tr><td>듀어 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-196-6</td><td>낮은 형태; 250 - 500 mL의 부피 범위</td></tr><tr><td>이중 증류수(ddH2O)</td><td></td><td></td><td>Barnstead GenPure xCAD 정수 시스템</td></tr><tr><td>D-PBS(인산염 완충 식염수)</td><td>Wisent</td><td>311425125</td><td></td></tr><tr><td>ECM(세포외 매트릭스)</td><td></td><td></td><td>Flynn et al. 2010에 설명된 바와 같이 인간 지방 조직, 돼지 진피 또는 돼지 심근에서 분리, Reing et al. 2010 및 Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Greenfield Specialty Alcohols Inc.</td><td>P016EAAN</td><td>앱솔루트</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Wisent</td><td>80150</td><td>증식 매체에 사용</td></tr><tr><td>집게</td><td>VWR</td><td>37-501-32</td><td>폼 이송용</td></tr><tr><td>냉동고 (-20 &deg; C)</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td></td></tr><tr><td>냉동고 ( -80 &deg; C)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EXF40086A</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-26D</td><td>동결 건조 cryomilled ECM</td></tr><tr><td>휴대용 균질화 저장</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>속도 : 8,000 - 30,000 rpm</td></tr><tr><td>균질화 장치 액세서리 : 톱니 바닥 발전기 프로브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-17</td><td>10 x 95 mm</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td>전기 분무용</td></tr><tr><td>동결건조기</td><td>Labconco</td><td>7750021</td><td>FreeZone4.5</td></tr><tr><td>밀링 챔버</td><td>Retsch</td><td>02.462.0213</td><td>25 mL 용량 권장</td></tr><tr><td>밀링 볼</td><td>VWR</td><td>16003-606</td><td>10 mm 직경, 스테인리스강 권장</td></tr><tr><td>18 G 니들</td><td>VWR</td><td>C ABD305185</td><td>ECM 현탁액을 금형에 디스펜싱하기 위해</td></tr><tr><td>궤도 인큐베이터 쉐이커</td><td>SciLogex</td><td>832010089999</td><td>온도 제어 (37 &deg; C)</td></tr> <tr><td>페니실린 - 스트렙토 마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140-122</td><td>증식 매체에 사용</td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>Mandel Scientific</td><td>DRU-4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>레토르트 스탠드</td><td>VWR</td><td>470019-526</td><td></td></tr><tr><td>레토르트 스탠드 클램프</td><td>VWR</td><td>21573-606</td><td></td></tr><tr><td>Safety-Lok 주사기</td><td>BD</td><td>309606</td><td>마이크로캐리어 제작 및 분주용 3mL Luer lock 주사기 ECM 현탁액</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫(10&nbsp; mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫 (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>monobasic BioShop</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>VWR</td><td>89259-968</td><td>마이크로캐리어 수집용</td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>VWR</td><td>82027-590</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>VWR</td><td>10117-490</td><td>마이크로 프로세서 제어</td></tr><tr><td>고전압 전원 공급 장치</td><td>감마 고전압 연구</td><td>ES30P-5W / DDPM</td><td>권장 15-25 kV 전압 범위</td></tr><tr><td>12 웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565321</td><td>폼 제조 중 금형으로 사용; 다른 크기 또는 사용자 정의 금형도 선택할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>날개 달린 주입 세트</td><td>Terumo</td><td>22258092</td><td>30cm 튜빙 길이, 25G 3/4 인치 권장; 다른 니들 게이지를 사용할 수 있으며 마이크로캐리어 직경에 영향을 줄 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

세포 기능은 복합 조직의 특정 구성 및 구조를 가지고있는 세포 외 기질 (ECM)과의 상호 작용에 의해 매개된다. 이 기사의 초점은 체외 세포 배양 모델 또는 조직 공학 및 재생 의학을위한 프로 재생 지지체와 세포 전달 시스템과 같은 고급 3D로 생물학적으로 관련 기판으로 사용하기 위해 ECM 파생 된 다공성 폼과 마이크로 제조 방법에있다. 시작 물질로 탈세 포화 된 조직 또는 정제 된 불용성 콜라겐을 사용하는 기술은 맞춤형 형상으로 조직 특이 bioscaffolds의 광범위한 합성에 적용 할 수있다. 접근은 기계적 처리 및 제어 동결 및 동결 건조 방법을 통하여 입체 또는 마이크로 발포체를 제조하는데 사용되는 ECM 현탁액을 수득 온화한 소화 효소를 포함한다. 이 순수한 ECM 파생 발판 chemic 필요없이 다공성, 아직 안정알 부정적인 세포 기능에 영향을 미칠 수있는 제제 또는 다른 첨가제를 가교 결합. 스캐 폴드 성질 같은 ECM 현탁액 농도, 기계적 가공 방법, 합성 또는 상태 변화 요인에 의해 어느 정도 조정될 수있다. 일반적으로, 발판은 견고하고 취급이 용이하며, 네이티브 ECM 성분을 모방하는 다양하고 사용자 친화적 인 3D 세포 배양 플랫폼을 제공, 대부분의 표준 생물학적 분석을위한 조직으로 처리 할 수 ​​있습니다. 전체적으로 정의 ECM 유래 마이크로 발포체의 제조 방법이 간단하게는 시험 관내 및 생체 내 적용에서 조직 - 특이 적 세포 유익 플랫폼으로서 모두 생물학 및 생물 의학 엔지니어가 관심을 가질 수있다.

본 연구에서 우리는 기술들은 ECM 소스로 탈세 포화 된 다양한 조직을 (사용 조직 특이 bioscaffolds를 생성하도록 적용될 수 있다는 것을 보여주는 대표적인 예로서, 인간 DAT, 돼지 DDT 및 돼지 DLV를 이용하여 ECM 유래 발포체 미세 전달체를 제조 한 도 1). 모두 거품 미세 전달체의 제조를 위해, α 아밀라아제 37 당분 해 효소 콜라겐 가용화의 니시 기술은 제어 동결 및 동결 건조 방법을 통하여 bioscaffolds을 합성하는 데 사용되는 탈세 포화 된 조직을 출발 물질로부터 점성 ECM 현탁액을 생성하도록 하였다. 발포체를 제조하기 위해, 조직을 탈세 포화 기계적 닦지 또는 효소 분해 전에 표면적을 증가 cryomilling 하나를 통해 처리 될 수있다. 수행원45; 처리 및 균질화 아밀라제, ECM 생성 된 현탁액을 동결하고 동결 건조되는 사용자 정의 형으로 분배된다. 골격은 연장 된 기간 동안 건조 상태로 안정적으로 저장 될 수있다. 세포 배양 실험에 사용하기 전에 동결 건조 된 지지체 순수한 ECM (도 3a)로부터 유도 된 다공성 및 높은 수화 균질 발포체를 수득 제어 재수 화 처리를 실시해야한다. 발포체가 너무 빨리 재수하는 경우, 급속한 팽창은 무결성 및 구조 붕괴의 손실이 발생, 섬세한 구조적 특징에 손상을 줄 수 있습니다. 일반적으로, 발포체는 원형 금형 재수 다음에 의해 정의 된 형상을 유지하며 화학적 가교를 필요로하지 않고 안정하다. 그림 3B DAT, DDT를 나타내는 주 사형 전자 현미경 (SEM) 이미지를 나타내고, DLV 35 ㎎ / ㎖의 농도 -80 #의 동결 온도 cryomilled ECM으로 제조 된 폼176; C. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" /> 도 -80 ° C에서 35 ㎎ / ㎖ 및 냉동의 농도 Cryomilled ECM 현탁액과 DAT, DDT, 및 제조 한 발포체 DLV 3. 대표적인 이미지. A : DAT, DDT 및 DLV의 육안 도면 재수 다음 48- 웰 조직 배양 접시 형으로 합성 발포체를 분쇄. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. B : 균일 한 다공성 미세 구조를 나타내는 DAT, DDT 및 DLV 폼의 SEM 이미지. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> cryomilled ECM 현탁액은 또한도 2의 (electrospraying 기법을 통해 순수 ECM 유래 마이크로을 생성하기 위해 사용될 수있다 </str옹&gt;). 재수 제어 (도 4A) 다음의 직경이 500㎛ 인 - 각 ECM 소스 현탁액 농도 니들 게이지, 주입 속도, 및 전압 (350)에서부터 개별 구면 마이크로을 생성하도록 조정될 수있다. 마이크로은 동결 건조 상태로 저장 될 수 있지만, 이는 그들이 분배 또는 에탄올에 재현 탁 다음, 원하는 크기 범위로 체질되어 취급 용이성을 위해 권장된다. SEM 영상은 마이크로 담체의 미세 구조 조직을 탈세 포화 된 소스 (도 4b)에 따라 달라질 수 있음을 시사한다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" /> 도 35 ㎎ / ㎖, 0.5 ㎖ / 분 주입 속도 및 20 kV의인가 전압의 농도로 현탁 Cryomilled ECM과 DAT, DDT 및 DLV 마이크로 담체 제조 한 항 대표 이미지. A : 육안보기 오수화 DAT, DDT 및 DLV 미세 전달체 F. 스케일 바는 4mm를 나타냅니다. B : 미세 구조와 크기가 ECM 소스에 따라 달라질 수 있음을 보여주는 DAT, DDT 및 DLV 미세 전달체의 SEM 이미지. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 골격의 기계적 특성은 ECM 소스에 의존하는 처리의 방법은, (예 cryomilling 대 닦지)가 ECM 현탁액 농도 및 냉동 온도를 적용 하였다. 일반적으로, 지지체가 1 내지 영률으로 부드럽고 준수 - (- 50 ㎎ / ㎖ 20) (31) 및 &lt;1 5 kPa로는 DAT (50 및 100 ㎎ / ㎖) 29 DLV 발포체보고 마이크로에 대한 kPa의. cryomilled 폼은 일 일반적으로 부드러운이다그들보다 더 혼란 특성으로 인해 다진 폼. 매우 민감한로드 셀을 갖춘 전문 기계 테스트 시스템은 압축 특성의 정확한 특성 필요합니다. 일반적으로, 폼 및 마이크로 때문에 소화 효소 및 균질화뿐만 아니라 골격의 비 공유 가교 특성을 포함한 제조에 관련된 추가 처리 단계에 기본 탈세 포화 된 조직보다 낮은 계수를 가질 것이다. 그러나,이 관심의 조직에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 이전의 연구에서는 다진 DAT ECM 높은 농도로 제조 된 폼 (100 ㎎ / ㎖)을 네이티브 지방 조직 (29)와 유사한 모듈러스를 남겼. 재수 ECM 유래 발포체 마이크로은 시험 관내 세포 배양 물 연구 및 / O 셀에 대한지지 플랫폼을 제공하는 정적 또는 동적 조건 하에서 배양 세포에 접종 할 수있다생체 내 세포 전달의 R. 공사장 공중 발판은 일반적으로 세포 부착을 지원하는 반면, 시딩 효율은 ECM 소스, 비계의 구조 및 다공성, 관심의 세포 유형에 따라 달라집니다. 이와 같이, 시드 방법 및 밀도는 사용자 정의 된 조건에 따라 최적화를 필요로한다. 세포 침윤을 향상 오비탈 진탕 동적 시드로, 1 × 106 세포 / 지지체 - 발포체 상술 들어, 0.25의 범위의 출발 세포 농도를 권장합니다. 스피너 배양 플라스크 (11)에 동적 조건으로 파종하여, 50,000 세포의 마이크로 ㎎ / - 마이크로 들어, 25,000 범위의 초기 접종 농도를 제안한다. 도 1의 하단에 도시 된 이미지는 공 초점 마이크로 시각화 인간의 ASC는 (오른쪽, 아민 - 반응성 염료 prelabeled 13 청색 표시)는 DAT 발포체 (왼쪽) 또는 미세 전달체 DAT에 시드 대표SCOPY 형광 세포 생존 염색하여 (적색 생균 = 녹색, 사균 =를, 스케일 바는 100 μm의 표현). 공 초점 현미경은 두께 2mm까지 발포체의 표면 상에 시드 세포를 시각화하는데 사용될 수 있지만, 상기 지지체의 중앙 영역에 가시화들은 불투명 한 성질에 의해 제한된다. 그러나, 발포체는 마이크로 조직으로 처리 될 수 있고, 파라핀 또는 냉동 절편의 조직 학적 및 면역 세포에 대한 분포와 마커의 발현을 시각적으로 분석한다.

조직 특이 적 세포 외 기질 (ECM)는 세포 기능의 중요한 매개체이다. 이 문서에서는 순수 ECM 파생 폼 및 체외 세포 배양 모델에서 고급 3D 애플리케이션 또는 프로 재생 bioscaffolds 화학적 가교 결합을위한 필요없이 문화에 안정 마이크로을 합성하는 방법을 설명합니다.

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

이 프로토콜의 전반적인 목적은 3D 인비트로(in vitro) 세포 배양 모델이나 세포 전달 시스템의 재생 촉진 스캐폴드로 활용하기 위해, 조직 특이적 세포외 기질에서 유래한 비화학적 가교 폼 또는 마이크로 캐리어를 적정 크기로 제작하는 것을 돕는 것입니다. 이 방법은 3D 세포 미세환경이 세포 기능과 조직 재생을 어떻게 매개하는지와 같이 응용 세포 생물학 및 조직 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 추가적인 가교 과정 없이도 천연 조직 특이적 ECM 조성을 모방하고 장기 배양 시 안정성을 유지하며, 기하학적 구조 조절이 가능한 스캐폴드 제작이 가능하다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 조직 유래 ECM을 동결건조한 후, 날카로운 수술용 가위를 사용하여 탈세포화된 조직을 잘게 다집니다. 처리된 조직을 저온 분쇄하려면, 실험실용 볼 밀 시스템의 25 milliliter 스테인리스강 밀링 챔버에 다져진 동결건조 ECM을 채우고, 10 milliliter 스테인리스강 밀링 볼 두 개를 넣습니다. 충전된 밀링 챔버를 닫고 액체 질소에 3분 동안 완전히 담급니다.그 다음, 냉동된 샘플을 30 Hertz에서 3분 동안 분쇄합니다. ECM이 고운 가루가 될 때까지 액체 질소 침전과 분쇄 과정을 반복합니다. 잘게 다져졌거나 동결 분쇄된 ECM 250 milligrams를 정밀하게 측정하여 15 milliliter 원심 분리 튜브로 옮깁니다.원심분리 튜브에 22 M NaH2PO4 완충액 5 mL를 넣고 튜브에 액체 높이를 표시합니다. 그런 다음 22 M NaH2PO4 완충액 1 mL에 alpha amylase 7.5 mg을 넣어 alpha amylase 표준 용액을 준비합니다. 다음으로, 샘플에 alpha amylase 표준 용액 100 µL를 첨가합니다.그 다음 22 molar NaH2PO4를 추가하여 최종 부피를 10 milliliters로 맞춥니다. 현탁액을 상온에서 300 RPM으로 72시간 동안 지속적으로 교반합니다. 현탁액을 1500 times G에서 10분 동안 원심분리합니다.소화된 ECM 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하여 상층액을 수집하고 폐기합니다. 그 다음, 이중 증류수로 희석한 5% NaCl 10 milliliters를 사용하여 펠렛 물질을 재현탁하고 300 RPM에서 10분 동안 계속해서 교반합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복한 후, 이중 증류수 10 milliliters를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다.그 다음, 현탁액을 상온에서 300 RPM으로 10분 동안 지속적으로 교반합니다. 샘플을 다시 원심분리한 후, 소화된 ECM 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하여 상층액을 수집하고 제거합니다. 5 mL 표시선까지 2 M 아세트산을 첨가합니다.그리고 볼텍싱합니다. 그 다음 현탁액을 120 RPM, 37 °C에서 밤새도록 지속적으로 교반합니다. 다음 날, 10 mm 너비의 톱니형 프로브가 장착된 핸드 헬드 균질기를 사용하여, 가시적인 파편이 남지 않을 때까지 실온에서 10초 간격으로 ECM 현탁액을 균질화합니다.과열을 방지하기 위해 균질화 간격 사이에 현탁액을 차가운 물이 담긴 비커에 넣어두십시오. 현탁액이 따뜻해질 때까지 120 RPM으로 계속 교반하며 37 °C에서 ECM 현탁액을 배양하십시오. 그런 다음 2 M 아세트산을 사용하여 시료 현탁액을 원하는 농도로 희석하십시오.3 mL 주사기와 18게이지 바늘을 사용하여 원하는 몰드에 ECM 현탁액을 채웁니다. 폼은 몰드의 모양에 따라 다양한 기하학적 구조로 제작할 수 있습니다. 몰드를 덮고 -20°C 또는 -80°C에서 동결시킵니다.그런 다음 몰드를 동결건조 플라스크에 넣습니다. 플라스크를 실험실 동결건조 시스템에 연결하고 몰드를 24시간 동안 또는 완전히 건조될 때까지 건조합니다. 동결분쇄된 ECM 현탁액을 100 RPM으로 지속적으로 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다.3 mL의 ECM 현탁액을 3 mL 루어 락(luer lock) 시린지에 충전하고, 시린지 보어에 윙드 인퓨전 세트(winged infusion set)를 연결합니다. 시린지 펌프 내에 시린지를 고정합니다. 그런 다음 바늘을 레토르트 스탠드에 고정하고, 바늘 끝을 저형 듀어 플라스크(low formed Dewar flask) 상단에서 4~6 cm 떨어진 위치에 수직으로 배치합니다.다음으로 악어 클립 전극을 바늘 끝에 부착하고, 이때 악어 클립이 고전압 전원 공급 장치의 양극 단자에 연결되어 있는지 확인하십시오. 알루미늄 호일 조각을 진공 플라스크 가장자리에 덮어 접습니다. 그런 다음 두 번째 악어 클립 전극을 호일의 바깥쪽 가장자리에 부착하십시오.이를 전원 공급 장치의 접지 소스 단자에 연결하십시오. 듀어 플라스크에 액체 질소를 상단에서 약 1cm 높이까지 채워 호일의 4분의 3이 잠기게 합니다. 그다음 시린지 펌프의 주입 속도를 30 milliliters per hour로 설정하고, 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 전기 분무하십시오.주입이 완료되면, 마이크로 캐리어가 동결 상태를 유지할 수 있도록 약 25 milliliters의 액체 질소를 남기고 듀어(Dewar)에서 과잉 액체 질소를 조심스럽게 따라냅니다. 그 다음, 한 번의 매끄러운 동작으로 액체 질소와 함께 마이크로 캐리어를 50 milliliter 원심 분리 튜브로 즉시 옮깁니다. 이후 스쿠풀라(Scoopula)를 사용하여 듀어에 남아 있는 냉동 마이크로 캐리어를 모두 수집합니다.이들을 원심분리기에도 추가하십시오. 동결건조를 준비하기 위해, 작은 구멍이 뚫린 알루미늄 호일로 원심분리 튜브를 덮습니다. 덮개 처리된 원심분리 튜브를 동결건조기 플라스크에 넣으십시오.그런 다음 즉시 플라스크를 동결건조기에 연결하고 샘플을 밤새 건조합니다. 동결건조된 폼을 과량의 absolute ethanol이 들어 있는 50 milliliter 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 마찬가지로, 수집 시 사용했던 원래의 원심분리 튜브 내에서 동결건조된 마이크로 캐리어를 과량의 absolute ethanol에 재현탁합니다.세롤로지컬 피펫을 사용하여 마이크로 캐리어를 정해진 메쉬 크기의 스테인리스 체로 걸러 새로운 50 milliliter 원심분리 튜브에 담아 응집물을 제거하고 원하는 크기 범위를 선택합니다. 샘플을 4 °C에서 4시간 동안 또는 거품이나 마이크로 캐리어가 원심분리 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 배양합니다. 그 후, 무균 조작법을 적용하여 라미나 플로우 후드 아래에서 세롤로지컬 피펫을 이용해 스캐폴드에서 절대 에탄올을 제거하고, 멸균 PBS로 희석한 과량의 95% ethanol을 첨가합니다.지지체를 4 °C에서 4시간 동안 또는 지지체가 재수화 용기 바닥으로 가라앉을 때까지 배양합니다. 에탄올 시리즈를 통해 지지체를 점진적으로 재수화합니다. 각 단계에서 용액을 교체하기 전, 지지체가 용기 바닥으로 가라앉을 때까지 4 °C에서 배양합니다.잔류 에탄올을 제거하기 위해 멸균 PBS로 두 번 더 헹구어 교체합니다. 세포 배양 준비 시까지 샘플을 100% 멸균 PBS에 넣고 4°C에서 보관하십시오. 재수화 후 1~2주 이내에 스캐폴드를 사용하십시오.탈세포화된 지방 조직을 사용하여 제작된 ECM 유래 폼과 마이크로 캐리어의 예시가 여기에 제시되어 있습니다. 돼지의 탈세포화된 진피 조직과 돼지의 탈세포화된 좌심실의 예입니다. 이는 다양한 탈세포화 조직을 ECM 소스로 사용하여 조직 특이적 바이오 스캐폴드를 생성하는 데 해당 기술을 적용할 수 있음을 보여줍니다.냉동분쇄(cryomilling) 또는 세절, 효소 소화 및 균질화 후, 샘플을 동결 및 동결건조 전 용기에 분배할 수 있습니다. 이 그림은 48-웰 조직 배양 플레이트 몰드에서 합성된, 재수화된 DAT, DDT 및 DLV 분쇄 폼을 나타냅니다. 이 DAT, DDT 및 DLV 폼은 35 mg/mL 농도의 냉동분쇄된 ECM과 -80 °C의 동결 온도로 제작되었습니다.전기 분무 기술을 이용하여 ECM 유래 마이크로 캐리어를 제작하기 위해, 각 ECM 소스 현탁액 농도에 따라 니들 게이지, 주입 속도 및 전압을 조정하여 제어된 재수화 후 직경이 350에서 500 µm 범위인 개별적인 구형 마이크로 캐리어를 생성할 수 있습니다. 마지막으로, SEM으로 확인한 DAT, DDT 및 DLV 마이크로 캐리어는 탈세포화된 ECM 소스에 따라 크기의 미세 구조가 달라질 수 있음을 보여줍니다. 이 비디오에서 제시된 방법은 탈세포화된 조직을 매트릭스 소스로 사용하여 화학적으로 가교되지 않은 순수 ECM으로 구성된 다양한 조직 특이적 마이크로 캐리어와 폼을 제작하는 데 사용될 수 있습니다.이러한 절차를 통해, 정적 또는 동적 조건에서 폼과 마이크로 캐리어에 세포를 시딩할 수 있으며, 이를 인비트로(invitro) 세포 배양 및 인비보(invivo) 응용을 위한 세포 지시성 기질로 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

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ECM 현탁액 제제: 조직 유래 세포외 기질에서 균질한 현탁액을 얻는 기술

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하이드로겔 마이크로캐리어의 시공을 가능하게 하는 점성 관성력을 번갈아 가며 구동되는 온화한 3D 프린팅 기술이 여기에 제시되어 있다. 수제 노즐은 유연성을 제공하므로 다양한 재료와 직경을 쉽게 대체할 수 있습니다. 직경 50-500 μm의 세포 결합 마이크로 캐리어는 추가 배양을 위해 얻어서 수집할 수 있습니다.

점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅

배우세요 조직 특이적 세포외기질 유래 거품과 마이크로담체를 화학적 가교 없이 제조하는 방법을. 동결건조, 크라이오밀링, 전기분무 기술을 활용하여 3D 세포 배양 및 재생의학 연구에 적용 가능한 생체재료를 만듭니다.

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