Name: BrUTP 가닥 특정 전사 런타임에 (TRO) 접근 방식을 사용하여 전사의 종료의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 배우세요 BrUTP 가닥 특정 전사 런타임(TRO) 접근법을 사용하여 RNA 중합효소 II의 전사 종료를 분석하는 방법을. 이 기법은 효모에서 전사 종료 인자의 역할을 규명하고 고등 진핵생물로 확장 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

안사리 연구실의 연구는 연구 보조금(No. MCB 1020911)는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)에서 발췌했습니다.

참고 :이 방법은 Medler, S 및 안사리, A. 2에보고 된 연구 문서에서 사용되었다. 1. 배양 및 수확 세포 <ol><li> 갓 줄무늬 사카로 마이 세스 세레 비지 판에서 YPD 배지 (10g / L의 효모 추출물, 20g / L 펩톤, 2 % 덱 스트로스)에있는 세포의 5 mL의 문화를 시작합니다. </li><li> 30 ° C, 250 rpm으로 궤도 통에 하룻밤 세포를 성장. </li><li> 250 ㎖의 배플 플라스크 내의 성장 밤새 배양을 YPD 배지 100 ㎖의 최종 부피는 100 배 희석. 참고 : 문화 100 ㎖의 총 TRO 반응에 따라 필요합니다; 여러 반응이 필요한 경우에, 배양의 더 큰 부피를 사용해야한다. </li><li> 0.8의 광학 밀도로 세포를 성장 - 1.0 600 nm에서 (A (600) ~ 0.8 - 1.0). </li><li> 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 4 ° C에서 5 분 동안 820 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> 차가운 얼음 TMN의 BU 10ml에 세포를 재현 탁ffer (10 mM 트리스 - 염산 pH를 7.5, 5 밀리미터의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨)과 5 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 820 XG에 원심 분리기 세포 펠렛합니다. 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다. </li></ol> 분석 실행 기능 2. Permeabilizing 및 준비 세포 <ol><li> 로 pipetting 아래로 부드럽게 절단 된 P 1000 팁을 사용하여 0.6 %의 sarkosyl 용액 1 ㎖의 세포를 재현 탁. 냉장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 플랫폼 통에 25 분 동안 4 ° C에서 부드럽게 세포를 흔들어. 주 : 마이크로 원심 튜브는이 단계에서 발생하는 프로모터에서 새로운 개시 이벤트의 가능성을 피하기 위해, 차가운 온도를 유지하기 위해 얼음과 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 충전한다. </li><li> 탁상 냉장 원심 분리기를 사용하여 4 ° C에서 6 분 동안 1,200 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 당에서 초과 액체를 제거하기 위해 뜨는을 대기음meabilized 세포 펠렛. </li></ol> 3. 전사 런타임에 반응 <ol><li> 전사의 150 μL를 추가 실행에 버퍼 (50 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 100 mM의 KCl을 10 mM의의 MgCl 2, 2 mM의 DTT (디티 오 트레이 톨), 0.75 mM의 ATP, CTP, GTP, 및 BrUTP, 200 U의 RNase 각 투과성이 세포 펠렛에 억제제). </li><li> 최대 피펫 팅에 의해 잘린 P 200 팁을 사용하여 아래로 부드럽게 섞는다. 참고 : 여러 샘플을 처리하는 경우, 모든 샘플이 준비가 될 때까지 얼음에 모든 것을 유지하고 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 수욕에서 30 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션. 참고 : 초기 RNA에 BrUTP의 최적의 통합을 보장하기 위해 1 ~ 5 분 사이의 배양 시간을 조정합니다. </li><li> 냉간 즉시 사용 RNA 분리 시약 500 μL를 첨가하여 반응을 정지. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li></ol> 4. RNA 추출 <ol><li> 셀 suspensi에 산 세척 유리 구슬 200 μL를 추가(34 단계)와, 볼텍스 믹서에 4 ° C에서 20 분 동안 격렬하게 진탕에. </li><li> 핫 22 G 바늘을 사용 microcentrifuge 관의 바닥에 구멍 및 15 mL의 멸균 원뿔 관의 상단에 배치. </li><li> 4 ° C에서 1 분 300 XG에 원심 분리기는 세포 용 해물을 수집합니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포 용 해물을 전송. </li><li> 차가운 RNA 분리 시약 500 μL와 세포 용 해물을 클로로포름 200 μL를 추가한다. 4 ° C에서 20 분 동안 16,168 XG에 소용돌이 믹서 및 원심 분리기에 대한 내용을 섞는다. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 위 수성 위상을 전송합니다. </li><li> pH를 4-5 이소 아밀 알코올 / (: 24 1 125) 차가운 페놀 / 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 4 ℃에서 15 분 동안 16,168 XG에 소용돌이 믹서 및 원심 분리기에 적극적으로 흔들어. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 위 수성 상을 포함하는 RNA를 전송합니다. 단계를 반복 4.6 두 번 더. </li><li> 최종 RNA 함유하는 수성 상에 5 M의 NaCl를 추가 STOCM. 0.3의 최종 농도는 RNA를 침전을 3 회 냉 에탄올의 양을 추가 얻을 케이. <ol><li> 1 시간 동안 또는 밤새 -20 ℃에서 인큐베이션. 참고 : - 안티 BrdU의 비드 (단계 5.3 참조) 차단 배양되는 동안 4.11 단계 4.9을 수행합니다. </li></ol></li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 16,168 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 DEPC (디 에틸 피로 카보) 물 100 μL의 RNA 펠렛을 재현 탁. </li><li> 통합되지 않은 BrUTP 뉴클레오티드에서 RNA를 분리하는 RNA 분리 미니 키트를 사용합니다. 의 RNase가없는 물 100 μL로 열로부터 RNA를 용출시킨다. </li><li> 5 분 동안 65 ° C의 물을 용기에 RNA를 부화 한 후, 적어도 2 분 동안 얼음으로 옮긴다. </li></ol> BrUTP 표지 RNA 5. 선호도 정화 <ol><li> 25 μL에 안티 BrdU의 추가, 구슬 해결 500 0.25 배씩 SSPE (나트륨 염 인산 EDTA) 결합 버퍼 (20 배 SSPE의 μL : 3 M의 NaCl, 0.2 M의 NaH 2 PO 4 </sub&gt; 0.02 M EDTA, pH 7.4의 1 mM의 EDTA, 0.05 % 트윈 (Tween), 37.5 mM의 염화나트륨). 4 ° C에서 30 초 동안 200 XG에 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 단계를 반복 5.1 세 번. </li><li> 구슬 (1 mg의 울트라 순수 소 혈청 알부민 (BSA) 버퍼, 0.1 %의 폴리 비닐 피 롤리 돈, 1 배 결합) 버퍼를 차단의 500 μL를 추가하고 부드럽게 1 흔들어 - 플랫폼 흔드는에 4 ° C에서 2 시간. </li><li> 단계 5.1에 기술 된 바와 같이, 결합 완충액 500 μL로 구슬을 두 번 더 씻는다. </li><li> 구슬에 버퍼를 바인딩의 400 μL를 추가합니다. </li><li> 구슬에 직접 (단계 4.11)에서 RNA의 100 μL를 전송합니다. 플랫폼 흔드는에 4 ° C에서 2 시간 - 부드러운가 1 진탕 품어. </li><li> 결합 완충액 500 μL, 낮은 소금 버퍼 500 μL (0.2 배씩 SSPE, 1 mM의 EDTA, 0.05 % 트윈), 높은 소금 버퍼 500 μL (0.25 배씩 SSPE, 1 mM의 EDTA, 0.05 % 트윈와 구슬 순차적으로 세척, 100 mM의 염화나트륨), 회 TET 완충액 500 μL (1X TE, 0.05 % 트윈)에서 회전하는각 세척 사이에 4 ° C에서 30 초 동안 200 XG. </li><li> 150 μL로 두 번 순차적으로 비드의 BrUTP 표지 된 RNA를 용출 번 용출 완충액 (20 mM의 DTT, 150 mM의 염화나트륨, 50mM 트리스 - 염산 pH를 7.5, 1 mM의 EDTA, 0.1 % SDS) 200 μL와 함께 배양하여 상층 액에서 구슬을 분리 짧은 스핀 다음 수욕에서 42 ° C에서 4 분. </li></ol> BrUTP 레이블 RNA의 6 강수량 <ol><li> 이소 아밀 알코올 / 차가운 페놀 / 클로로포름 500 μL를 추가 (: 24 : 125 1) pH가 4-5을 BrUTP 정제 선호도로는 RNA를 표시. 4 ° C에서 15 분 동안 16,168 XG에 소용돌이 믹서 및 원심 분리기에 섞는다. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 위 수성 위상을 전송합니다. </li><li> RNA의 침전을 냉 에탄올, 0.3 M의 3 배 부피의 최종 농도를 얻기 위해 5 M NaCl을 주식을 추가한다. </li><li> -20 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 4 ° C에서 30 분 동안 16,168 XG에서 원심 분리하여 침전 된 RNA를 수집합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 상층 액을 제거하고 10 분 동안 공기 건조에 펠렛을 할 수 있습니다. </li><li> DEPC 물 26 μL의 RNA 펠렛을 재현 탁. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 최종 RNA 농도를 결정한다. 또한, 280 분의 260 비율을 결정합니다. 비율 ~ 2 순수 RNA 시료를 나타낸다. </li><li> cDNA 합성에 필요한 때까지 -80 ° C에서 분취 량의 RNA 샘플을 저장합니다. </li></ol> BrUTP 표지 RNA의 7 역전사 <ol><li> 100 NG에 RNA 농도를 조정 / μL은 DEPC 물을 사용. 각 cDNA 합성 반응에 RNA 0.5 μg의를 사용합니다. 참고 : RNA 템플릿의 농도는 최적의 cDNA 합성을 달성하기 위해 0.5 ~ 1.0 μg의 다를 수 있습니다. </li><li> 도 3a에 도시 된 바와 같이 하류 폴리 (A)에 위치 (종료 위치)의 여러 설계 역방향 프라이머를 이용하여 RNA를 역 전사. </li><li> 각각 역전사 반응, RNA의 templat 5 μL를 추가E (0.5 μg의), 1 μL의의 dNTP 믹스 (10 mM의 각), 역방향 프라이머 C, D, E, F 또는 G 2 μL (50 μM 각) 및 클레아 자유 수 (도 3a 참조). 각 튜브의 최종 반응 부피가 13 μL이다. 주 : 역전사 반응의 수는 cDNA 합성에 사용되는 역방향 프라이머의 수에 의존 할 것이다. 예를 들어, ASC1 다섯 역방향 프라이머를 사용 하였다 따라서 오 역전사 반응을 설정 하였다. cDNA 합성에 사용되는 역방향 프라이머를 기초 C, D, E, F 및 G로 튜브 라벨. </li><li> 어떤 차 구조 형태를 제거하는 5 분 동안 65 ° C에서 열 순환기에 RNA 템플릿의 dNTP 믹스와 프라이머를 포함하는 튜브를 품어, 적어도 2 분 동안 4 ° C에 다음 차가운. </li><li> 1 μL는 효소 (200 U / μL)를 역 추가, 4 μL는 버퍼와 RNA 템플릿과 프라이머를 포함하는 각각의 튜브에 0.1 M DTT의 2 μL (7.4 단계). 위아래로 부드럽게 피펫 팅에 의해 섞는다. </li><li> 60 분 동안 42 ℃에서 열 순환기에서 반응 혼합물을 배양하여 역전사 반응을 수행한다. </li><li> 20 분 동안 65 ℃에서 역전사 효소를 불 활성화. </li><li> -20 ° C에서의 cDNA를 저장하거나 다음 단계로 진행합니다. </li></ol> cDNA를 8. 증폭 <ol><li> 단계 7.8, 1.0 μL 포워드 프라이머 B (10 μM), 1.0 μL의 3.0 μL의 cDNA 주형을 다음과 같이 단계 7.8에서 (ASC1위한 C, D, E, F 및 G 표시) 각각의 cDNA 제제의 증폭을위한 PCR 반응을 수행 역방향 프라이머 C 또는 D 또는 E 또는 F 또는 G (10 μM), 2.5 μL 10 배 중합 효소 PCR 버퍼, 0.5 μL의의 dNTP 믹스 (10 mM의 각), 1.0 μL의 MgCl 2 (2.5 mM)을 15.5 μL PCR 등급 물, 0.5 μL 열 안정성 중합 효소. 참고 : 5 1 : 1까지의 cDNA 템플릿의 다른 희석 (100)는 PCR 제품 수율을 최적화하기 위해 테스트해야합니다. 단일 프로모터 근위 정방향 프라이머는 cDNA를 증폭하기 위해 사용될다른 역방향 프라이머를 이용하여 얻어진. 예를 들어, 프로모터 근처에 위치한 하나의 전방 프라이머 B는 G에 대한 ASC1 C에서 5 역방향 프라이머와 조합하여 사용 하였다. BC는, BD는,도 3a에 도시 된 바와 같이, BF와 BG는 각각 C, D, E, F 및 G로 표시 튜브에 사용하여, 될 수있다. </li><li> 다음 열 사이클링 매개 변수를 사용하여 PCR을 실행하여 1주기를 2 분 동안 95 ° C (중합 효소의 활성화를위한 핫 스타트), 30-40 사이클 30 초 (변성), 15 초 동안 54 ° C 95 ° C (어닐링) 1 분 (연장), 1 사이클 5 분 동안 68 ° C (최종 확장) 68 ° C. 주 : 소둔 온도는 사용되는 특정 프라이머에 따라 달라질 것이며, 연기 시간이 예상되는 제품의 크기에 따라 달라진다. </li><li> 0.8 %, 1.5 %, 또는 제품의 예상 크기에 따라 2 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분리한다. </li><li> 엘 Kaderi 동부 등의 설명에 따라 PCR 생성물을 정량화. (20)12 11. 참고 : 다른 방법으로, 초기 성적의 양을 정량 실시간 RT-qPCR에 전략을 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li>
<li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586(2015).</li>
<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
<li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disengaging+polymerase%3A+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li>
<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

여기서 사용 가닥 특이 TRO 프로토콜은 포유 동물 세포에서 12 GRO-SEQ (글로벌 도망 시퀀싱) 분석을 위해 사용 된 프로토콜에서 적응시켰다. 우리는 성공적으로 효모 신진에서 초기 전사를 연구하는 프로토콜을 수정했습니다. 특히 전사 종결 결함을 분석하기 위해, 우리는 RNA 가수 분해 공정 치우는하여 상기 프로토콜을 조정했다. 이것은 우리가 특히 프로모터 영역 근처의 전사 개시 부위에서 시작 전장 초기 전 사체를 검출 할 수 있었다. 의미있는 결과를 얻기 위해 최대한주의해서 수행해야 프로토콜의 여러 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 프로토콜은 기하 급수적으로 증가 효모로 수행되어야한다. 로그 단계에서 세포 (A 600 ~ 0.8-1.0)이 단계에서 세포의 대부분으로주는 최상의 결과를 적극적으로 성장하고 강력한 전사를 전시하고 있습니다. 둘째, RNA 분리 성4 °의 C - EP 2의 온도에서 가능한 한 빨리 ...

진핵 전사 사이클은 세 가지 주요 단계로 구성; 개시, 신장 및 종료. RNA 중합 효소 II에 의한 전사의 종료는 두 가지, 상호 의존적 인 3 단계로 구성되어 있습니다. 첫 번째 단계는 템플릿에서 분열, 및 폴리아 데 닐화 mRNA를 분리를 포함하고, 바로 템플릿 폴리머의 결합 해제에 의해 표시된 두번째 단계로 이어진다. 적절한 종료와 RNA (4, 5)를 비 - 코딩 전반의 전사를 제한함으로써 점검 비정상적인 전사를 유지하는 하류 유전자의 전사와 간섭을 방지하기 위해, 전사 개시 / 재개시하는 동안 폴리머의 재활용을 위해 중요하다. 최근의 진보에도 불구하고, 종료는 RNA 중합 효소 II 전사주기까지 상기 단계에 의해 이해된다. 안정적인 종단 분석은 메커니즘 underlyin 연구를위한 필수적이다생체 내에서 RNA 중합 효소 II에 의한 전사의 g 종료. 실험적인 접근 방법은 생리 조건 하에서 활발히 유전자 전사 종결 결함을 검출하기 위해 사용된다. 이 북부 오 점, 종료 인자 칩 (염색질 면역 침전) 및 기존의 TRO 분석을 포함한다. 이들 기술은 각각 장단점을 갖는다. 사용되는 전통적인 TRO 분석은 생체 내 1에서 전사 종결 결함의 검출을위한 가장 신뢰할 수 있고 중요한 방법이 될 수 있습니다. 이 분석은 세포 내부 유전자의 상이한 영역의 전사적 활성 폴리머 분자 편재. 정상적인 조건에서 분석은 엄격히 유전자 (그림 1A)의 프로모터와 터미네이터 영역 사이에 분산 된 전사적으로 참여 중합 효소 분자를 보여줍니다. 결함 종료시 그러나, 폴리머는 종료 신호를 판독 할 수없는상기 유전자 (도 1b)의 3 &#39;말단의 하류 영역에서 검출된다. 전사 종결 결함이 프로모터 근위 영역으로부터 시작된 센스 속기 폴리머의 존재 하에서 적하하고, 종료 신호를 읽을 수 되,도에 도시 된 바와 같이, 유전자의 3 &#39;말단의 하류 영역을 전사 계속 2A. 진핵 게놈 및 유전자 6, 7, 8, 9, 약 10 압도적 보급 점에서 전사뿐만 아니라 안티센스 방향을 나타낸다 실현으로 곧 전통적인 TRO 분석 검출 할 수없는 것은 명백되었다 폴리머 IF 신호 유전자의 하류는 프로모터 시작 성적 증명서 (그림 2A) 또는 솜을 시작 탈선 RNA를 나타냅니다유전자 또는 종단 요소 (도 2b) 또는 유전자 (도 2c)의 3 &#39;말단에서 안티센스 방향의 폴리머 속기 하류의 중간 ewhere. 관찰 readthrough 중합 효소 신호가 프로모터 시작 확장 된 감각의 mRNA 또는 시험에서 유전자의 하류를 시작 안티 센스 성적표를 나타내는 경우 사용 BrUTP는 여기에 설명 된 가닥 특정 TRO 분석은 구별 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 효모 2 신진에서 전사 종료에 Kin28 키나제의 역할을 보여주기 위해이 방법을 사용하고 있습니다. 여기에 방법을 사용하는 우리는 같은 단백질이 효모 신진에서 ASC1의 전사의 종료를 위해 필요하다는 것을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>페놀 - 클로로포름 - 이소 아밀 알코올 혼합물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>77619</td><td>pH 4-5</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제, 인간 태반</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>New England Biolabs</td><td>M03368L</td><td>또는 이에 상응하는 효소</td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerraz Mix</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>또는 이와 동등한 효소</td></tr><tr><td>5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>초순수 소 혈청 알부민(BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>ASC1 F</td><td></td><td></td><td>CTATGGAATGGGGGGTTTAAG</td></tr><tr><td>ASC1 G</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5' 5s reverse</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3' 5s reverse</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

brutp 가닥 특정 전사 런타임에 (tro) 접근 방식을 사용하여 전사의 종료의 분석

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

이 원고는 생체 내에서 전사 종결 결함을 검출하는 프로토콜을 설명한다. 사용 BrUTP 여기서 설명한 가닥 특이 TRO 프로토콜은 생리 학적 조건 하에서 전사 종결 결함 분석을위한 강력한 실험 방법이다. 전통적인 TRO 분석 마찬가지로 전사 종결 결함 하나의 지표로서 유전자의 3 &#39;말단을 넘어 전사적 활성 폴리머의 존재에 의존한다. 그것은 기존의 TRO 분석으로 발생하는 두 가지 주요 문제를 극복한다. 첫째, 종료 신호를 통해 판독 효소가 프로모터 근위 부위에서 전사를 개시 한 경우, 검출 또는 수 단순히 어딘가에 본문에서 비특이적 개시된 pervasively 전사 효소 또는 3 &#39;을 나타내는 경우 유전자의 끝. 둘째, 구별 할 수 있습니다 경우 넘어 전사적으로 활성 효소 신호터미네이터 영역은 진정으로 readthrough 감지 mRNA의 전사 중합 효소 또는 터미네이터 시작 비 코딩 안티센스 RNA 신호이다. 간략하게, 프로토콜, 기하 급수적으로 성장하는 효모 세포 permeabilizing 친화 방식으로 BrUTP 표지 RNA 정제의 BrUTP 염기의 존재 하에서 신장 생체 내에서 개시 사체 허용 수반 정제 초기 RNA를 전사하고 cDNA를 증폭하여 역방향 프로모터와 유전자 (2)의 종결 영역을 플 랭킹 가닥 특이 적 프라이머.

전사 종결 결함을 검출에 BrUTP 가닥 특정 TRO 절차의 적용을 설명하기 위해, 우리는 같은 단백질의 종료 불량, 온도에 민감한 돌연변이가 rna14-1라고 사용. RNA 중합 효소 II에 의한 전사 종료에 같은 단백질의 역할은 선택된 유전자 1 터미네이터 - 인접 지역에서 RNA를 검출 기존의 TRO 분석을 이용하여 증명되었다. 비 - 허용 온도에서 rna14-1 돌연변이의 터미네이터 영역 이후 RNA 신호의 검출을 종료 결함으로 해석 하였다. 관측 된 신호는, 그러나,도 2b에 도시 된 바와 같이 대체로 유전자의 3 &#39;말단 부근에서 전사를 개시 pervasively 속기 폴리머에 기인 할 수있다. 결정적으로 종료에 같은 단백질의 역할을 설명하기 위해, 우리는 rna14-1에 BrUTP 가닥 특정 TRO를 수행돌연변이와 ...

우리는 발아 효모에서 가닥 특이적 전사 런온(TRO) 접근법에 의해 BrUTP를 사용하여 생체 내에서 RNA 중합효소 II에 의한 전사 종료를 분석하기 위한 기본 실험적 접근 방식을 설명합니다. 이 프로토콜은 효모와 고등 진핵생물 모두에서 다른 RNA 중합효소에 의한 전사 종결을 연구하도록 확장될 수 있습니다.

BrUTP 가닥 특정 전사 런타임에 (TRO) 접근 방식을 사용하여 전사의 종료의 분석

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

이 절차의 전반적인 목표는 접근 방식에서 실행되는 가닥 특이적 전사에 의해 생체 내 조건에서 RNA 중합효소에 의한 발아 효모로의 전사 종료를 연구하는 것입니다. 이 방법은 유전자의 3 프라임 말단을 넘어 검출된 전사 활성 중합효소가 프로모터 영역에서 시작된 것인지 여부에 대한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 방법의 주요 장점은 mRNA 전사 중합효소와 전사를 시작하고 유전자의 3 프라임 말단에 있는 널리 전사하는 중합효소를 구별할 수 있다는 것입니다.이 기술은 다른 RNA 중합효소 및 효모에 의한 전사 종결을 연구하기 위해 확장될 수 있는데, 이는 다른 중합효소에 의한 종결의 보존 특성으로 인해 발생합니다. 이 방법은 효모 전사 주기에서 종결 인자의 정확한 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 더 높은 진핵생물의 종결을 연구하기 위해 확장될 수도 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 세포 투과화 및 전사 실행에 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 신중한 실행이 필요하고 초기 전사체도 정제하기 어려울 수 있기 때문입니다.이 방법에 대한 아이디어는 가닥 특이적 방식으로 전사 활성 중합효소의 위치에 대한 게놈 전체 스냅샷을 제공하는 GRO 탐색 접근 방식에서 처음 떠올랐습니다. 이 방법의 시각적 시연은 초기 전사체의 양이 적고 불안정한 특성으로 인해 전사 실행 및 RNA 정제를 수행하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 반응을 통해 전사를 실행하기 전에 기하급수적으로 성장하는 효모 세포를 성장, 수확 및 투과화하여 투과화된 세포 팔레트를 얻습니다.반응을 시작하려면 버퍼에서 실행되는 150마이크로리터의 전사를 투과화된 세포 팔레트에 추가합니다. 잘린 P-200 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.모든 샘플이 buffer의 transcription에 재현탁된 후 수조에서 섭씨 30도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 각 샘플에 바로 사용할 수 있는 500마이크로리터의 저온 RNA 분리 시약을 첨가하여 반응을 중지합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.각 세포 현탁액에 200마이크로리터의 산성 세척 유리 구슬을 추가하고 섭씨 4도에서 20분 동안 와류 믹서에서 격렬하게 흔들어 RNA 추출 절차를 시작합니다. 20분 후 뜨거운 22게이지 바늘을 사용하여 각 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 구멍을 뚫고 튜브를 15ml 멸균 원뿔형 튜브 상단에 놓습니다. 섭씨 4도에서 1분 동안 300배 G로 원심분리하고 세포 용해물을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.500마이크로리터의 저온 RNA 분리 시약과 200마이크로리터의 클로로포름을 세포 용해물에 추가합니다. 와류 믹서에 내용물을 섞은 다음 섭씨 4도에서 20분 동안 16, 168회 G로 원심분리합니다. 상부 수성상을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.같은 부피의 차가운 페놀 클로로포름 이소 아밀 알코올을 첨가하십시오. 와류 믹서에서 세게 흔든 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 16, 168회 G로 원심분리합니다. RNA를 포함하는 상부 수성상을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 전달합니다.같은 부피의 차가운 페놀, 클로로포름, 이소아밀 알코올, 와류 및 원심 분리기를 다시 추가합니다. 수성상을 포함하는 최종 RNA에 적절한 부피의 5몰 염화나트륨 스톡을 추가하여 0.3 어금니의 최종 농도를 얻습니다. 차가운 에탄올 부피의 3배를 첨가하여 RNA를 침전시킵니다.섭씨 20도에서 1시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. RNA 침전이 완료되면 섭씨 4도에서 20분 동안 G를 16, 168배로 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 RNA 팔레트를 100마이크로리터의 DEPC 물에 재현탁합니다.RNA 분리 키트를 사용하여 통합되지 않은 브로모리딘 삼인산 뉴클레오티드에서 RNA를 분리하고 100마이크로리터의 RNAse 자유수로 컬럼에서 RNA를 용리합니다. RNA를 섭씨 65도의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 최소 2분 동안 얼음 속에 옮겨 담습니다.RNA가 침전되는 동안 anti bromo DU beads를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 각 샘플에 대해 500 마이크로 리터의 0.25 X 나트륨 식염수 인산염 EDTA 결합 완충액을 25 마이크로 리터의 침전 비드에 추가합니다. 섭씨 4도에서 30초 동안 200배 G로 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.바인딩 버퍼로 비드를 세 번 씻습니다. 3차 세척으로 상층액을 제거한 후 비드에 500마이크로리터의 블로킹 버퍼를 첨가하고 플랫폼 쉐이커에서 섭씨 4도에서 1-2시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 500마이크로리터의 결합 버퍼로 비드를 두 번 더 세척합니다.두 번째 세척에서 상등액을 제거하고 비드에 400마이크로리터의 결합 완충액을 추가합니다. 100마이크로리터의 RNA를 비드에 직접 전달합니다. 플랫폼 쉐이커에서 섭씨 4도에서 1-2시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.섭씨 4도에서 30초 동안 G의 200배로 돌린 다음 상층액을 제거합니다. 다음으로, 비드에 500마이크로리터의 결합 완충액을 추가합니다. 섭씨 4도에서 30초 동안 G의 200배로 회전하여 상층액을 제거합니다.이러한 방식으로 결합 완충액, 저염 완충액, 고염 완충액으로 비드를 순차적으로 세척하고 TET 완충액으로 두 번 세척합니다. 비드에서 RNA로 표지된 브로모리딘 삼인산을 용리화하기 위해 150마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 수조에서 섭씨 42도에서 4분 동안 배양합니다. 잠시 스핀다운하고 상층액을 수집합니다.이러한 방식으로 150마이크로리터로 두 번, 200마이크로리터의 용리 완충액으로 한 번 순차적으로 용리합니다. 각 샘플에서 약 500마이크로리터의 친화성 정제 브로모리딘 삼인산 표지 RNA를 얻어야 합니다. 친화성 정제 브로모리딘 삼인산(labeled RNA)을 침전시키기 위해 각 샘플에 500마이크로리터의 차가운 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올을 첨가합니다.와류와 원심 분리기는 섭씨 4도에서 15 분 동안 16, 168 번 G입니다. 상부 수성상을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 적절한 부피의 5몰 염화나트륨 스톡을 추가하여 최종 농도 0.3 어금니를 얻습니다.그런 다음 차가운 에탄올 부피의 3배를 추가합니다. RNA를 침전시키기 위해 섭씨 20도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 침전된 RNA를 섭씨 4도에서 30분 동안 16, 168배 G에서 원심분리하여 채취합니다.상층액을 제거하고 팔레트를 10분 동안 자연 건조시킵니다. RNA 팔레트를 26마이크로리터의 DEPC 물에 재현탁합니다. 분광 광도계를 사용하여 260나노미터에서 흡광도를 측정하여 최종 RNA 농도를 측정합니다.RNA 샘플과 부분 표본을 cDNA 합성에 필요할 때까지 섭씨 80도에서 보관합니다. 접근 방식에서 bromouridine triphosphate strand specific transcription run은 발아 효모에서 ASC1 유전자의 전사 종결을 위한 RNA 14의 요구 사항을 테스트하는 데 사용되었습니다. RNA 14-1 돌연변이 및 이의 동종 야생형 세포로부터 브로무리딘 트리포스페이트 표지된 RNA를 정제하고 프라이머 C, D, E, F 및 G로 역전사 및 해당 cDNA를 프라이머 쌍 B 및 C, B 및 D, B 및 E, B 및 F, B 및 G를 사용하여 PCR 증폭하고 아가로스 겔 상에서 분획했습니다.돌연변이체에서 프라이머 쌍 B와 E, B와 F, B와 G로부터 PCR 증폭 산물이 존재한다는 것은 종결 판독 표현형을 반영합니다. 그러나 야생형 세포에서는 신호에 대한 전사 실행이 종결자 요소까지 제한되었으며 종결자 영역을 넘어서는 신호에 대한 검출 가능한 전사 실행이 없었습니다. 이 그래프는 5개의 S RNA를 정규화 대조군으로 사용한 겔의 정량화를 보여줍니다.야생형 세포가 아닌 돌연변이에서 종결 신호를 읽는 프로모터 개시 초기 전사체의 검출은 RNA 14가 종결 인자임을 확인합니다. 이 기술을 숙달하면 3일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 반응에 대한 전사 실행이 성공적인 결과를 얻는 데 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 종결 요인의 게놈 전체 역할과 같은 추가 질문에 답하기 위해 GRO 탐색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 전사 분야의 연구자들이 효모 및 고등 진핵 시스템에서 다른 RNA 중합효소에 의한 종결을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 반응에 대해 전사를 실행하고 초기 라벨링된 전사체를 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.RNA는 매우 불안정할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑 착용, 섭씨 4도 정도의 온도 유지, RNAse 자유 제제 사용과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

analysis-termination-transcription-using-brutp-strand-specific

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Telomeres는 염색체의 안정성을 위해 필수이며 telomere G - 오버행 구조는 telomerase - 중재 telomere의 유지 보수를 위해 필수적입니다. 우리는 최근 telomere G - 오버행 구조의 검출을위한 두 가지 방법을...

Telomere G - 오버행 구조의 시험 Trypanosoma brucei</em

RNA 중합 효소 II는 성숙의 mRNA의 3 '말단 확장되는 전구체 RNA를 합성한다. 성숙한 RNA의 끝은 절단 복합체의 효소 활동을 통해 RNA 염기 서열에 의해 결정 사이트에서 cotranscriptionally 생성됩니다. 여기에 세부 사항에게 체외에서 분열 반응을 연구하는 방법을 우리는.

사전 mRNA의 기판의 3 &#39;끝 분열 : 휴대폰 무료 시스템을 사용하여 RNA 가공 반응 분석<em&gt; 시험관</em

여기에서는 자동화된 겔 시퀀서를 사용하여 생체 내에서 박테리아 전사체 및 RNA 처리에서 전사 시작점을 결정하기 위한 형광 기반 프라이머 확장 방법을 설명합니다.

형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 RNases의 쪼개짐 사이트를 확인하는 생체

이 프로토콜은 Golden Gate Assembly와 plasmid pGR-blue를 사용하여 in silico에서 발견되는 터미네이터의 강도를 빠르게 정량화합니다.

PGR - 블루 플라스미드와 골든 게이트 어셈블리를 사용하여 터미네이터의 신속한 확인

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Toeprinting 목표 체 외에서 의 능력을 측정 하는 다양 한 조건에서 리보솜과 양식 번역 개시 복합물에 RNA를 복사할 수 있습니다. 이 프로토콜 toeprinting 포유류 RNA에 대 한 메서드를 설명 하 고 모자-종속 및 IRES 기반 번역 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.

원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

본질적으로 무질서한 도메인은 온코겐융합 전사 인자 기능에 중요합니다. 이러한 단백질을 치료적으로 표적으로 하기 위해서는 이러한 도메인에 의해 사용되는 규제 메커니즘에 대한 보다 상세한 이해가 필요합니다. 여기서는 전사학을 사용하여 유잉 육종에서 본질적으로 무질서한 EWS 도메인의 중요한 구조적 특징을 매핑합니다.

전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

이 프로토콜은 사용자가 CUT&amp;RUN 염기서열분석 데이터의 초기 분석 및 검증을 완료할 수 있도록 하는 입문용 CUT&amp;RUN 분석 파이프라인을 통해 생물정보학 초보자를 안내합니다. 여기에 설명된 분석 단계를 다운스트림 피크 주석과 함께 완료하면 사용자는 크로마틴 조절에 대한 기계론적 통찰력을 얻을 수 있습니다.

CUT&#38;RUN 염기서열분석 데이터의 입문 분석 및 검증

이 원고에서는 세균 전사를 표적으로 하는 항균제의 전사 및 억제 활성을 기능적으로 검사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

배우세요 BrUTP 가닥 특정 전사 런타임(TRO) 접근법을 사용하여 RNA 중합효소 II의 전사 종료를 분석하는 방법을. 이 기법은 효모에서 전사 종료 인자의 역할을 규명하고 고등 진핵생물로 확장 가능합니다.

BrUTP 가닥 특정 전사 런타임에 (TRO) 접근 방식을 사용하여 전사의 종료의 분석

더 많은 동영상 탐색