Name: Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 학습하세요 심근염 마우스 모델에서 광시트 현미경을 이용한 백혈구 침육의 정량적 시각화 방법을. 이 기술은 전 장기 수준에서 염증의 위치와 정량 분석을 가능하게 하여 심장 부정맥의 세포 기전 연구에 활용됩니다.

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Gunzer 연구소의 연구는 독일 연방 교육 연구부 (부여 0315590 AD)와 독일 연구 재단 (보조금 GU769 / 4-1, GU769 / 4-2)에 의해 지원되었습니다. 우리는 기술 지원에 대한 IMCES와 3D 만화 모델링에 대한 Sebastian Kubat에 감사드립니다.

모든 동물 실험은 EU 지침에 따라 수행되었으며 Essen의 관련 지방 당국 (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Germany)의 승인을 받았습니다. 동물은 SPF (specific pathogen-free) 조건하에 사용 및 보관되었습니다. 1. 디프테리아 톡신 (DTX)에 의한 심근염 유도 <ol><li> DTX 솔루션을 인산 완충 식염수 (PBS)로 1 μg / mL 작동 솔루션으로 희석하여 심근염 유발을위한 DTX 솔루션을 준비하십시오. </li><li> Hasenberg 등이 표시 한대로 8-10 주 된 CD11c.DTR 마우스 ( 약 5ng / g 체중 (bw))에이 용액 100 μL를 천천히 (it) 투여 하십시오. 그것은 곰팡이 포자 현탁액의 적용 20 . 주 : 독소의 복강 내 적용은치명적인 심근염. 그러나이 접근법은 먼저 검증되어야합니다. <ol><li> 그것을 적용하기 위해 100 mg / kg bw ketamine과 10 mg / kg bw xylazine의 복강 내 (ip) 주사에 의해 동물을 마취시킨다. </li><li> 깊은 마취 (발가락 핀치 테스트)에 도달 한 후 구강을 통해 22G 내주 정맥 카테터를 사용하여 동물에게 삽관하십시오. 작은 동물 호흡 보호구로 동물을 환기시켜 렌즈 튜브의 올바른 위치를 확인하십시오. 또한 Hasenberg et.가 보여 주듯이 호흡 당 250μL의 흡입량과 250 회의 호흡량으로 호흡 합니다. al. 20 . 참고 : 올바르게 배치하면 적용된 인공 호흡 설정에 따라 동물의 호흡 률이 변경됩니다. </li><li> 환기 시스템을 분리하고 DTX 용액 100 μL 또는 카테터를 통해 대조군과 같은 양의 PBS를 폐에 주입하고 추가로 1 분 동안 동물의 통풍을 계속하십시오. </li></ol></li><li> 마취에서 회복시키고 4 일 동안 일반적인 건강 상태 및 체중 변화를 모니터링하십시오. 참고 : 유전 적 배경, 마우스 변형 또는 초기 체중에 따라 심근염의 심각성 및 발병 정도가 다를 수 있으므로 먼저 결정해야합니다. </li></ol> 2. Light-sheet 현미경을위한 샘플 준비 <ol><li> 독소를 적용한 지 4 일 후에 기화 된 2 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물로 유도 챔버를 플러싱하여 쥐를 마취시킨다. 레트로 궤도 응용 경로를 사용하여 PBS 50 μL에 직접적으로 표시된 항 CD45 항체 (클론 30-F11, AlexaFluor647 (AF647))의 15 μg을 정맥 주사 (iv) 주사하여 매우 빠르고 정확한 응용을 보장합니다. 항체의 정확한 양. 참고 : 마우스가 기대어 있고 발가락 핀치 테스트에 반응하지 않으면 원하는 마취 깊이에 도달했습니다. </li><li> 배양 2 시간 후, 자궁 경부 전위에 의해 생쥐를 희생시키고d 5 mL의 PBS / EDTA (5 mM)로 원위치 심장 을 관류시킨다. <ol><li> 21 G 카테터를 사용하여 심장을 노출시키고 우뇌로 관류 용액을 주입하십시오. 느리고 일정한 압력으로 흐르는 것과 대동맥을 절개 한 후 혈액을 배출 할 수 있는지 확인하십시오. 참고 :이 심 관류는 기관의 최종 3D 시각화를 방해 할 수있는 사소한 준비 인공물을 초래할 수 있습니다. 따라서, 진보 된 동물 실험자는 복부 대동맥을 절개하여 하대 정맥을 통해 관류를 수행 할 수있다. </li></ol></li><li> 화학적 고정을 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 5 mL를 사용하여 같은 구멍을 통해 심장을 관류하십시오. 카테터를 제 위치에 유지하고 PFA가 채워진 새로운 주사기를 부착하십시오. 느리고 일정한 압력으로 흐르는 관. 주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이있다; 피부, 눈 및 기타 점막과의 접촉을 피하십시오. <ol><li> 부드럽게 톱니 모양 포 셉를 가진 심혼을 움켜 잡으십시오; 우레탄약간 위로; 들어오고 나가는 동맥과 정맥을 포함한 모든 조직 연결을 차단하십시오. 추가 고정을 위해 장기를 4 % PFA에 4 시간 동안 보관하십시오. </li></ol></li><li> 기관을 탈수하려면 암실에서 4 ℃, 12 시간 동안 각각 50 %, 70 % 및 100 %로 두 번 상승하는 에탄올 시리즈에서 심장을 배양하십시오. 여기에 검정색 5 mL 폴리 프로필렌 반응 튜브를 사용하여 공기 방울 형성을 방지하기 위해 저속 회전 속도를 사용하여 튜브 회 전자에서 일정하게 회전 할 수있게하십시오. </li><li> 화학적 제거로 샘플 준비를 완료하십시오. 마음을 투명하게 만들기 위해 밤새 계속 회전하면서 98 % dibenzyl ether (DBE)에서 배양하십시오. 참고 : DBE는 눈, 피부 및 호흡기를 자극합니다. </li></ol> 3. 가벼운 판 현미경 <ol><li> 가벼운 시트 현미경을 사용하여 LSFM을 실시하십시오 (재료 표 참조). 현미경의 표준 샘플 홀더에 샘플을 DBE로 채워진 cuvette은 30mm x 30mm x 15mm까지의 시편에 적합합니다. </li><li> 탈수 및 맑은 아가로 오스 블록을 사용하여 이미지를 수집하는 동안 견본을 제자리에 단단히 고정시킵니다. <ol><li> 아가로 오스 블록을 준비하려면 2 % 용융 아가로 오스를 15mm x 15mm x 5mm의 금형에 붓습니다. 응고 될 때까지 아가로 오스가 식도록하십시오. </li><li> 오름차순 에탄올 시리즈 (50 %, 70 %, 100 %에서 두 번)로 탈수하십시오. 98 % DBE에서 아가로 오스 블록을 밤새 품는다. 그것이 사용될 때까지 DBE에 아가로 오스를 저장하십시오. 참고 : 아가로 오스는 주로 물로 구성되어 있기 때문에 각 탈수 단계의 배양 시간은 블록의 크기에 따라 연장 될 수 있습니다. 참고 : DBE는 눈, 피부 및 호흡기를 자극합니다. </li><li> 필요한 경우 날카로운 메스를 사용하여 준비된 아가로 오스 블록을 원하는 모양으로 자릅니다. 일반적으로 샘플 어댑터의 모서리에 프리즘 또는 쐐기 모양의 양식을 자릅니다. 참고 : 아가로 오스 블록은 탄성이므로,작은 힘으로 밀었을 때 샘플이 제 위치에 유지됩니다. </li></ol></li><li> 적절한 여기 및 방출 필터 설정으로 관심 형광 신호 (여기서는자가 형광 및 항 CD45 항체 염색)를 감지합니다. <ol><li> 결합 조직 유래자가 형광 신호를 검출하기 위해 488 nm의 여기 파장 (OPSL : 50 mW)에서 525/50 nm 밴드 패스 필터를 사용하십시오. AF647 결합 항체로 CD45 염색은 668 nm (밴드 패스 필터 : 680/30 nm) 및 647 nm의 여기 파장 (다이오드 레이저 : 50 mW)에서 검출됩니다. </li><li> 두 개의 개별 z 평면 사이의 거리로 4 μm를 선택하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 후 처리 참고 : 획득 한 디지털 이미지 데이터는 과학적 3D / 4D 이미지 처리 및 분석 소프트웨어로 처리됩니다 (재료 표 참조). <ol><li> 데이터 파일 열기 및 사전 조정. </strong&gt; <ol><li> 분석 소프트웨어를 시작한 후 왼쪽 상단 모서리에서 &quot;능가&quot;버튼을 선택하십시오. 이미지 스택을 열려면 &quot;File (파일)&quot;, &quot;Open (열기)&quot;을 선택하고 첫 번째 획득 한 채널의 데이터가 들어있는 폴더를 선택하십시오. 획득 한 채널을 추가하려면 &quot;편집&quot;및 &quot;채널 추가&quot;를 선택하십시오. 주 : 데이터 크기 및 컴퓨터 시스템에 따라이 프로세스에는 몇 분이 소요될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 2 수집 채널 (autofluorescence 및 AF647)에 대한 모든 단계를 보여줍니다. </li><li> &quot;편집&quot;을 클릭하고 &quot;이미지 속성&quot;을 선택하여 x, y 및 z 복셀 치수를 수정하십시오. 새 창이 열리면 매개 변수를 조정하십시오. 참고 :이 단계는 사용 된 현미경 시스템과 특정 데이터 형식에 따라 다릅니다. 올바른 xyz 값은 후속 크기 및 원거리 측정에 중요합니다. 대부분의 경우 이러한 매개 변수는 현미경 파일에 메타 데이터로 저장됩니다. 그러나, 파일 format는 분석 소프트웨어에서 올바르게 해석 할 수 없으므로 수동으로 픽셀 크기를 입력하는 것이 중요합니다. x 및 y 차원의 픽셀 크기는 카메라 픽셀 크기, 적용될 수있는 비닝 및 렌즈 및 대물 배율에 따라 다릅니다. z의 픽셀 크기는 자체 정의 된 z 단계 크기 ( 예 : 4 μm)와 같습니다. </li></ol></li><li> 채널 조정 <ol><li> 먼저 &quot;Display adjustment&quot;( &quot;Edit&quot;및 &quot;Show Display Adjustment&quot;)를 열어 autofluorescence 신호를 회색조로 변환하십시오. 새 창이 열리면 모든 채널이 표시되고 모든 채널이 표시됩니다. 기본 색상을 변경하려면자가 형광 채널을 선택하고 &quot;흰색&quot;표시 스타일을 선택하십시오. 적용하려면 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 검정 레벨 조정의 경우, &quot;디스플레이 조정&quot;으로 돌아가서 샘플 구조를 나타내지 않는 원치 않는 배경 신호를 제외하도록 검정 레벨 값을 조정하십시오에스. <ol><li> 이렇게하려면 채널 막대의 왼쪽 상단 삼각형을 사용하고 왼쪽에서 오른쪽으로 드래그하십시오. 참고 : 변경 사항은 즉시 시각화됩니다. 샘플에서 파생되지 않는 신호 만 억제하십시오. 추가 계산을 위해 잡음 신호가 필요할 수 있기 때문에 배경의 최소값은 &quot;0&quot;이되어서는 안됩니다. 이미지 획득 후 모든 검은 레벨 변경이 수행되는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 중요한 샘플 정보가 손실 될 수 있습니다. 블랙 레벨 조정은 대표적인 목적으로 만 사용됩니다. 다른 샘플에 대해 동일한 디스플레이 설정을 사용하려면 채널 목록 아래의 &quot;최소&quot;숫자 필드에 정확한 값을 입력 할 수 있습니다. 이는 정량 분석에 매우 유용합니다. </li></ol></li><li> 오른쪽 위 삼각형을 사용하여 각각의 채널 밝기를 조정하거나 채널 아래의 &quot;최대&quot;숫자 필드에 정확한 값을 입력하여 밝기 조정을 수행하십시오난 목록. </li><li> 채널 막대의 가운데에있는 아래쪽 삼각형을 드래그하여 감마 값을 높이거나 낮추거나 정확한 값을 입력하여 대비를 조정하십시오. </li><li> autofluorescence 채널에 따라 AF647 채널을 조정하십시오. 차이점으로, AF647 신호의 시각화를 히트 맵 컬러 룩업 테이블로 설정하십시오. 4.2.1 단계와 유사한 접근 방식으로 채널 모드 &quot;화재&quot;를 선택하여이를 수행하십시오. 참고 : 전체 신호 강도가자가 형광 채널에 비해 상당히 낮기 때문에 검정 레벨은 대개 훨씬 낮은 값으로 조정됩니다. 자기 형광 채널에 관해서는,이 채널의 밝기는 일반적으로 증가합니다. </li><li> &quot;블렌드 모드&quot;를 선택하여 조직 구조를 자세히 시각화하십시오. 동일한 매개 변수 값을 가진 한 시리즈의 모든 샘플을 분석하십시오. </li></ol></li><li> 가상 클리핑 <ol><li> 3D 장면 엑스포 전에 오르간을 실제로 자르려면렌더링 된 3D 객체에 클리핑 평면을 적용합니다. <ol><li> 오브젝트 목록에서 &quot;Clipping Plane&quot;아이콘 (가위)을 클릭하십시오. 이미지보기 내부에는 노란색 프레임과 조작자 (흰색 스핀들)가 나타납니다. 스핀들을 마우스로 끝까지 돌려서 클리핑면의 방향을 변경하고 스핀들의 두꺼운 중간 부분을 이동하여 원하는 클리핑 깊이를 선택합니다. </li><li> 객체 목록 아래의 해당 확인란의 선택을 취소하여 프레임과 조작자를 숨기고 원하는 스냅 샷을 만듭니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

현대 생명 과학에서 생물학적 과정의 현미경 시각화는 점차 중요한 역할을합니다. 이러한 맥락에서 지난 2 세기 동안 많은 발전이 이루어져이 시점까지는 해결할 수없는 질문에 답할 수있었습니다. 첫째, 광학 현미경의 해상도 능력을 근본적으로 높이는 명백한 경향이있었습니다. 한때 가정 된 해상도 제한으로 인해 구조화 된 조명 현미경 (SIM) 21 , 22 , 유도 방출 - 공핍 (STED) 현미경 23 및 광 활성화 된 국소 현미경 (PALM) 24 , 25 또는 확률 적 광학 재구성 현미경 (STORM) 회절 광 ( 27) 은 상당히 파손되었다. 두 번째로 자주 목표로하는 과제는 닮은 환경에서 세포 행동을 관찰하는 것이 었습니다가능한 한 ...

광학 현미경의 진화 과정에서 특정 표본에 대한 시각화 과정의 한계를 최소화하기 위해 개발 된 많은 특수 형태가 나타났습니다. 그러한 방법 중 하나는 Light Sheet 형광 현미경 검사 (LSFM)입니다. 1903 년 Siedentopf와 Zsigmondy 1 에 의해 처음 개발되었으며 1990 년대 초반에 최초의 생물학적 응용을 발견했습니다 2. LSFM은 형광 신호 분해능을 가진 손상되지 않은 마우스 기관과 같은 큰 표본의 시각화를위한 가장 강력한 현미경 도구가되었습니다 세포 수준까지 이러한 이점 때문에 생존 세포 이미징 가능성과 함께 Nature Methods는 LSFM을 &quot;2014 년의 방법&quot;이라고 명명했습니다. 이름에서 알 수 있듯이 LSFM의 샘플 조명은 가벼운 시트에 의해 수행됩니다.이 시트는 사용 된 대상 축에 수직으로 향하게됩니다. f또는 방출 - 광 수집 및 후속 화상 형성을 포함한다. 광 시트는 대개 원통형 렌즈로 광폭의 시준 된 레이저 빔을 초점을 맞추거나 단 하나의 수평 또는 수직 평면 4 , 5 에서 좁고 집중된 레이저 빔의 신속한 옆쪽 이동에 의해 생성됩니다. 이러한 방식으로, 일반적으로 1 ~ 4㎛의 두께로 이미징 광학 기기의 초점 평면 만 조명됩니다. 결과적으로, 조명면에 배치 된 형광 표본의 경우, 산란광의 생성과 초점면 위 또는 아래 영역에서의 광 표백 효과가 모두 제거되거나 크게 억제됩니다. 초점이 맞지 않은 비행기는 모두 비추 지 않기 때문에이 지역에서는 표백 효과가 생략됩니다. 표준 공 촛점 또는 다중 광자 현미경과 달리 조명과 방출 된 빛의 경로는 서로 분리되어 있으므로 최종 이미지 품질<html> 목표물을 통한 여기 광선의 완벽한 집속에 의존하지 않습니다. 근원적 ​​인 질문에 따라, 조명 된 평면의 가장 큰 가능한 영역이 xy 방향으로 움직이는 구성 요소없이 이미지화 될 수 있도록 방대한 FOV (Field of View)와 함께 대상을 사용할 수 있습니다. 최신 LSFM 시스템에서 생성 된 광학 섹션의 형광 이미지는 매우 민감한 전하 결합 소자 (CCD) 또는 CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) 카메라에 캡처되어 FOV (전체 시야) 마이크로 초. 따라서 라이트 시트를 통해 샘플을 이동시키고 정의 된 z 단계에서 이미지를 획득함으로써 합리적인 시간 8 , 9 시간 내에 표본의 전체 3D 정보를 얻을 수 있으므로이 기술을 라이브 셀에 적용 할 수 있습니다 연구 10 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . 그럼에도 불구하고, LSFM이 신속하고, 민감하며, 형광 친화적 인 방법 임에도 불구하고, 표본을 통한 빛 투과는 여전히 중요한 문제이며, 특히 큰 생물학적 샘플이 3D 분석의 타겟 일 때 특히 중요합니다. 빛의 전달은 흡수의 물리적 측면과 굴절률이 다른 구조물의 경계면에서의 광산란으로 결정적으로 변형됩니다 13 . 따라서 샘플을 수 밀리미터 크기로 이미징 할 때 LSFM은 대부분 샘플을 광학적으로 투명하게 만들기 위해 클리어링 프로토콜과 결합됩니다. 이러한 기술은 각각의 생물학적 조직에서 물을 제거하고이를 특정 표적 조직 구성 요소의 굴절률과 협소하게 매치되도록 선택되는 물 또는 유기 용매 기반 침지 매개체와 교환한다는 아이디어를 기반으로합니다. 결과적으로, 측면 광 산란이 최소화되고, 모든 파장의 광은 조직 (13) 을 훨씬 더 효율적으로 통과 할 수있다. 많은 경우, 이와 같이 처리 된 생물학적 표본은 거시적으로 맑아 보입니다. 따라서 긴 작업 거리, 저배율 목표를 사용하여 전체 마우스 기관에서도 LSFM을 수행 할 수 있습니다. 여기, 우리는 심근염의 쥐 모델에서 세포 침투를 조사하기 위해 설립 한 가벼운 시트 현미경 (재료 표 참조)에서 대형 표본 이미징을위한 준비 프로토콜을 제시합니다 15 . CD11c.DTR 마우스는 CD11c 프로모터 16 의 제어하에 영장류 디프테리아 독소 수용체 (DTR)를 발현합니다. 따라서 DTR과 함께 CD11c를 발현하는이 마우스의 세포는 Corynebacterium diphtheria (디프테리아 독소, DTX)의 외독소에 민감하게 반응 합니다. DTX로 이들 동물을 전신 처리하면 모든 CD11c + ce가 고갈됩니다안돼. CD11c는 integrin이며 다양한 다양한 가용성 요소에 대한 세포 표면 수용체로서 주로 단핵구 계통의 세포에서 활성화 및 성숙 과정에 관여합니다 17 . 결과적으로, CD11c.DTR 마우스 모델은 다양한 면역 학적 질문의 맥락에서 수지상 세포 및 대 식세포 서브 세트의 역할을 연구하는데 집중적으로 사용되었습니다. 시간이 지남에 따라 DTX로 전신적으로 치료 된 CD11c.DTR 마우스는 부작용을 일으킬 수 있고 사망률이 급격히 상승 할 수 있다고보고되었습니다 18 , 19 . 최근 우리는 이러한 동물에서 기관 내 DTX 적용 후 극심한 심근염의 발생을 설명하는 근본적인 사망 원인을 규명 할 수 있었다. 독소에 대한 도전은 심장의 자극 전달 시스템의 중앙 부분을 포함하여 세포 파괴를 일으켰습니다. 이것은 거대한 CD45가 동반되었다.+ 백혈구 침윤, 결국 치명적인 심장 부정맥으로 이어진다. 이 경우 백혈구 개체군의 출현이 중요 할뿐 아니라 심장 내부의 공간 분포도 중요했습니다. 이 실험적인 질문은 intravital 항체 염색법과 유기 용제 기반의 광학 제거 프로토콜에 의해 뒷받침되는 light sheet microscopy 접근법으로 해결 한 현대 현미경 영상에 대한 도전 과제입니다.

<table><tbody><tr><td>디프테리아 독소</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 식염수</td><td>Biochrom</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>케타민 [50 mg/mL]</td><td>Inresa</td><td>PZN 4089014</td><td></td></tr><tr><td>자일라진 [2 %]</td><td>Ceva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Braun</td><td>REF 9161502</td><td>Braun Omincan F&nbsp;</td></tr><tr><td>정맥 카테터 내주&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 381923</td><td>BD Insyte Autoguard</td></tr><tr><td>small animal respirator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0044</td><td>MiniVent</td></tr><tr><td>anit-CD45 항체 (AF647)</td><td>BioLegend</td><td>103124</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>catheter (21 G)</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 387455</td><td>BD valu-set</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PE 튜브(5mL)</td><td>Carl Roth</td><td>EKY9.1</td><td>로틸라보</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Carl Roth</td><td>9065.4</td><td></td></tr><tr><td>디벤질 에테르</td><td>시그마-알드리치</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>관 회전기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>MACSmix</td></tr><tr><td>아가로스(저겔화)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>금형 (15 x 15 x 5 mm)</td><td>Tissue Tek</td><td>4566</td><td>Cryomold&nbsp;</td></tr><tr><td>광시트 현미경 시스템</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td>초현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 본체</td><td>Olympus</td><td></td><td>MVX10&nbsp;</td></tr><tr><td>대물렌즈</td><td>올림푸스</td><td></td><td>0.5&nbsp; 북미 MVPLAPO 2XC, WD 5.5&nbsp; mm&nbsp;</td></tr><tr><td>sCMOS 카메라 5.5MP</td><td>Andor Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488nm OPSL(50mW) 레이저</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>647nm&nbsp; 다이오드 레이저(50mW)</td> <td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D 이미지 처리 및 분석 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td></td><td>IMARIS Ver. 8.3</td></tr><tr><td>형질전환 마우스 변형</td><td>Steffen Jung et al.</td><td></td><td>CD11c.DTR</td></tr><tr><td>wt 마우스 스트레인</td><td>Envigo</td><td></td><td>Balb/c Ola Hsd J</td></tr><tr><td>레이저 모듈</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MVPLAPO 2XC 대물 렌즈</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

light sheet microscopy에 의한 심근 성 심근염의 murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

빛샘 형광 현미경 (LSFM)은 화학적 제거 프로토콜과 결합하여 대형 생물 표본에서 형광 표식 구조를 분석하기위한 금본위 제가되었으며 세포 분해능에 이릅니다. 한편 기본 프로토콜의 지속적인 정제와 전문화 된 상용 시스템의 가용성 향상을 통해 우리는 전체 마우스 기관의 미세 구조를 조사 할 수 있었고 다양한 라이브 셀 이미징 접근법에서의 세포 행동의 특성을 고려할 수도있었습니다. 여기, 우리는 염증 마우스 마음에서 CD45 + 백혈구 인구의 공간 전체 마운트 시각화 및 부량에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 치명적인 심장 부정맥을 특징으로하는 치명적인 치명적인 심근염 발달 연구를 위해 강하고 유도 가능한 모델로 작용하는 것으로 최근에 알려진 트랜스 제닉 마우스 균주 (CD11c.DTR)를 사용합니다. 이 프로토콜은 심근염 유도, intravit알 항체 매개 염색, 기관 준비 및 후속 컴퓨터 보조 영상 후 처리를 포함한 LSFM을 포함한다. 우리의 특별한 과학적 질문에 대해 고도로 적응 된 방법으로 제시되었지만,이 프로토콜은 다른 기관의 심지어 다른 종의 형광 구조를 완전히 목표로 할 수있는 쉽게 조정 가능한 시스템의 청사진을 나타냅니다.

제시된 LSFM 접근법은 심각한 심근염 유발시 쥐의 심장에서 백혈구 분포와 양을 분석합니다. 그림 1A 는 심근염 유도에 대한 유전자 변형 CD11c.DTR 마우스의 전처리 프로토콜을 설명합니다. 이 단계는 백혈구를 심근에 모집하는 데 필요한 방아쇠를 나타냅니다. 성공적인 DTX 적용 후, 동물들은 일반적인 약점, 식욕 부진 및 2 ~ 4 일 범위의 체중 감소와 같은 심각한 질병 증상을 나타냅니다. 4 일 후, 백혈구는 iv에 의해 염색된다 . 순환에서 혈액을 제거하기 위해 심근 관류 전에 형광 결합 항 CD45 항체를 적용 성공적으로 수행되면 심장과 다른 기관이 희끄무레하게 변합니다. 이어서, 장기를 절제하고 조직 수를 상승하는 에탄올 행 및 DBE에서의 최종 배양에 의해 DBE와 교환한다. 그림 1B 는 시간표를 보여준다.기관이 상당한 수축을 겪는 개별 배양 단계를 나타낸다. 화학적으로 제...

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 유도된 심부정맥이 있는 마우스의 심장을 화학적으로 투명화하여, 형광 라이트 시트 현미경(Fluorescence Light Sheet Microscopy)을 통해 백혈구 심장 침윤을 전기관 수준에서 시각화하는 것입니다. 이 방법은 세포 해상도 수준에서 보형물 및 구조에 관한 전기관 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전기관 내 염증의 정량화와 국소화를 모두 가능하게 한다는 점입니다.신경 보철물에 대한 상세한 내부 정보를 제공합니다. 우리는 고갈 모듈에서 심성 부정맥의 세포적 설명을 식별하기 위한 시각화 도구가 절실히 필요했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 8~10주 된 생쥐의 심장을 노출시킨 후, 21 gauge 카테터를 사용하여 우심실을 관통하십시오.혈액이 배출될 수 있도록 대동맥을 절개한 후, 5 mL의 PBS 및 EDTA 혼합액을 느리고 일정한 압력으로 관류합니다. 이어서 5 mL의 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 관류합니다. 관류가 끝나면 톱니 모양의 포셉을 사용하여 고정된 심장을 조심스럽게 잡고, 장기를 위쪽으로 살짝 당겨 모든 조직 연결 부위를 절단합니다.유입 및 유출 동맥과 정맥을 포함하십시오. 그런 다음, 추가 고정을 위해 심장을 신선한 4% PFA에 4시간 동안 보관합니다. 조직을 탈수시키기 위해, 기포 형성을 방지하고자 튜브 회전기에서 지속적으로 천천히 회전시키며, 빛이 차단된 검은색 5 mL 폴리프로필렌 반응 튜브에 담아 심장을 점진적 에탄올 시리즈에서 배양합니다.그 다음, 98% dibenzyl ether에서 하룻밤 동안 지속적으로 회전시키며 조직을 투명화합니다. Light Sheet Fluorescence Microscopy를 수행하려면, 먼저 시료를 고정하기 위해 표준 시료 홀더에 탈수된 agarose 블록을 배치합니다. 그런 다음, 시료를 시료 홀더로 옮깁니다.다음으로, 샘플 홀더를 dibenzyl ether가 채워진 적절한 크기의 큐벳으로 옮깁니다. 관심 있는 형광 신호를 검출하기 위해 적절한 들뜸 및 방출 필터 설정을 사용하십시오. 따라서 이미징 과정에서 섀도잉 효과를 최소화하기 위해서는 샘플의 정확한 위치 선정과 고정이 필수적입니다.또한, 고정되지 않은 시료는 이동 아티팩트를 유발할 수 있으며, 이는 후처리 과정에서 제거하기 어렵습니다. 모든 이미지 획득이 완료되면, 적절한 3D 및 4D 이미지 처리 분석 소프트웨어를 열고 surpass를 선택하십시오. 파일 열기를 선택한 후, 첫 번째로 획득한 채널의 데이터가 포함된 폴더를 선택하여 이미지 스택을 엽니다.편집 및 채널 추가를 선택하여 적절하게 획득한 형광 채널 데이터를 추가합니다. 다음으로, 편집을 클릭하고 이미지 속성을 선택하여 x, y 및 z 복셀 차원을 수정합니다. 새로 열린 창에서 파라미터를 조정합니다.형광 신호를 조정하려면 먼저 편집 메뉴를 열고 '디스플레이 조정 표시(show display adjustment)'를 선택하십시오. 열려 있는 모든 채널이 표시되는 새 창이 나타납니다. 자가형광 채널을 그레이스케일로 변경하려면 자가형광 채널을 선택하고 흰색 디스플레이 스타일을 선택한 후 확인을 클릭하십시오.그 다음, 그리드를 제거하여 뷰를 조정합니다. 이어서 확대한 후 한 채널의 선택을 해제합니다. 그런 다음, 샘플 구조를 나타내지 않는 원치 않는 배경 신호, 신호 강도 및 대비를 제외하도록 블랙 레벨 값을 조정합니다.수정된 자가형광 채널 신호에 맞춰 항체 상주 채널을 조정합니다. 채널 모드를 설정하고, 항체 신호의 시각화를 히트맵 컬러 룩업 테이블로 설정합니다. 그런 다음 혼합 모드를 선택하여 조직 구조를 상세하게 시각화합니다.3D 장면을 내보내기 전, 장기를 가상으로 절개하려면 객체 목록에서 클리핑 평면(clipping plane) 아이콘을 선택하십시오. 이미지 뷰에 노란색 프레임과 흰색 스핀들 조작기가 나타납니다. 마우스로 스핀들의 얇은 끝부분을 회전시켜 클리핑 평면의 방향을 변경하고, 스핀들의 두꺼운 중간 부분을 이동하여 원하는 절개 깊이를 선택하십시오.그런 다음, 해당 체크 박스의 선택을 해제하여 프레임과 매니퓰레이터를 숨기고 원하는 스냅샷을 생성합니다. 두 가지 형광 채널 신호로 구성된 전체 이미지 스택을 획득하면 인공 3D 렌더링이 생성되며, 여기서 백혈구 분포가 히트맵 뷰로 표시됩니다. 디프테리아 독소(Diphtheria toxin)로 처리된 동물의 심장에서 강하게 염증이 생긴 영역은 붉은색 또는 흰색으로 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.특히 심방심실 다발 및 푸르키네 섬유와 같은 심장 전도계 영역에서 그러합니다. 반면, PBS를 처리한 대조군 동물의 심장에서는 이러한 염증 패턴이 나타나지 않습니다. 이 기술을 숙달하면 표적 장기의 적출부터 컴퓨터 보조 렌더링까지 4~5일 내에 디지털 분석 준비가 가능해집니다.이 기술은 개발 이후 배아학 분야의 연구자들이 생쥐 전체 장기의 세포 분포 패턴을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이는 다양한 병리생리학적 질환 모델의 분석 및 처리에 기여할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 형광 라이트 시트 현미경(Fluorescence Light Sheet Microscopy) 관찰을 위해 생쥐 전체 장기를 준비하는 방법과 3D 데이터 스택을 생성 및 처리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

quantitative-visualization-leukocyte-infiltrate-murine-model

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Brown, A. O. 외 심장 미세병변 내 폐렴 구균의 시각화 및 이후 심장 재형성. J. Vis. 경험 (2015).이 영상은 마우스 심장 조직에서 세균 미세 병변을 현미경으로 시각화하는 과정을 보여줍니다. 폐렴구 균에 감염된 쥐의 심장은 채취, 세척, 고정 후 코로나 절제를 위해 가공됩니다. 이 절편들은 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 후 현미경으로 검사하여 미세 병변 내에 서식하는 박테리아를 관찰합니다.

마우스 심장 조직 내 세균 미세병변의 현미경 시각화

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

학습하세요 심근염 마우스 모델에서 광시트 현미경을 이용한 백혈구 침육의 정량적 시각화 방법을. 이 기술은 전 장기 수준에서 염증의 위치와 정량 분석을 가능하게 하여 심장 부정맥의 세포 기전 연구에 활용됩니다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

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