Name: 높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기 결핵균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 배우세요 96웰 플레이트에서 Mycobacterium tuberculosis에 감염된 대식세포 응집체를 생성하여 약물 감수성을 평가하는 방법을. 이 고처리량 분석은 BSL-2 조건에서 비용 효율적으로 항결핵 약물 개발을 가속화합니다.

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Cytation 3 자동 이미징 플레이트 리더를 사용해 주신 Frank Wolschendorf 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01-AI104499 to OK에 의해 부분적으로 자금이 지원되었습니다. 작업의 일부는 UAB CFAR 시설과 UAB CFAR 유세포 분석 코어/공동 UAB 유세포 분석 코어에서 수행되었으며, 이는 NIH/NIAID P30 AI027767 및 NIH 5P30 AR048311에서 자금을 지원합니다.

참고 :이 6206는 avirulent 변형 17, 18 결핵균의 MC 바와 같이,이 프로토콜의 모든 작품은 바이오 안전성 레벨 2 시설 (BSL-2)에서 수행 할 수 있습니다. M. 결핵 엠씨 2 표현 녹색 형광 단백질 1. 문화 조건 6206 (MTB -GFP) 참고 : M. 결핵 H37Rv는 영양 요구 균주에게 6206 엠씨 (2) 유도 (Δ panCD, Δ leuCD) 플라스미드 pMN437을 발현하는 GFP가이 프로토콜 16에서 사용되는 형질 전환. 비 GFP 연구자의 변형 쉽게 접근 가능하도록 야생형 균주를 발현과 MTB -GFP의 피로를 대체 할 수있다. 그러나, GFP 발현은 식균 작용과 MTB / 대식 세포의 응집체 형성을 육안으로 확인 가능하게하는 것이 바람직하다. 경도의 경우g의 장기 저장은, MTB -GFP 20 % 글리세롤로 보충 (단계 1.1에서 설명) 전체 7H9 미디어에서 -80 ° C에서 동결했다. <ol><li> 10 % 미들 OADC, 0.02 %의 틸록 사폴, 24 μg의 / mL의 D-판토텐산, 50 μg의 / ML의 L-류신 50 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B를 함께 7H9 매체를 보완하여 완전한 MTB -GFP 미디어 (7H9-C)를 준비 </li><li> MTB -GFP의 한 유리 병을 해동하고, 30 mL의 사각형 바닥이 PETG 플라스크에 7H9-C 10 mL를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 회전 진탕 (50 회전)에 37 ° C에서 품어. 광학 밀도 측정 (OD 600) 며칠마다 OD 600 1.0 (약 5-8일)에 도달 할 때까지 가져 가라. </li><li> OD를 0.2 ~ 600 사이에 유지하기 위해 희석 통로 배양. </li><li> 감염의 경우, 대수 성장 단계 (OD 0.6-1 600) 내에서 MTB -GFP의 확립 된 문화를 사용합니다. 큰 덩어리의 문화를 방지하기 위해 수조에 MTB 문화 플라스크를 초음파 처리 (130 W 3 × 5의 펄스) ONC전자 또는 일주일에 두 번 </li></ol> 2. 문화 조건 THP-1 세포 <ol><li> 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민 및 10 mM의 HEPES과 RPMI 1640 배지를 보충함으로써 완전한 THP-1 세포 배지 (RPMI-C)를 준비한다. </li><li> 5 % CO 2의 가습 된 분위기 하에서 37 ℃에서 T-75 플라스크에서 세포를 부화. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 계산하거나 매일 유동 세포 계측법 0.1 mL를 당 만 0.6 사이의 밀도 THP-1 세포를 유지한다. </li></ol> 3. 감염 프로토콜 MTB / 대 식세포 집계 구조를 생성합니다 <ol><li> THP-1 세포의 준비 (96 웰 플레이트 당) <ol><li> 5 분 250 XG에 원심 분리기 7 × 10 6 THP-1 세포. 7 mL의 RPMI-C에 재현 탁. </li></ol></li><li> MTB -GFP 준비 <ol><li> 원심 분리기 2.8 × 10 8 MTB -GFP 스윙 - 양동이 원심 분리기에서 3,200 XG에 5 분에서 유OD 600 1.0 = 3 × 10 8 박테리아 / mL로의 변환을 노래. </li><li> 단계 3.2.1에서와 같이 RPMI-C와 원심 분리기로 한 번 씻으십시오. </li><li> 10 초 7 mL의 RPMI-C에 재현 탁하고 소용돌이. </li></ol></li><li> 감염 참고 : 템플릿 그림 1을 참조하십시오. <ol><li> 배지의 증발을 방지하기 위해 물 림 로우 A 및 H 및 칼럼 1, 12 멸균 물 200 μL를 첨가하여 96- 웰 플레이트를 준비한다. </li><li> 배경 제어 (빈)에 대한 2 열 (G2에 B2) 200 μL RPMI-C를 추가합니다. </li><li> 감염, THP-1 세포 현탁액 (3.1 단계)에 MTB -GFP 서스펜션 (단계 3.2)을 추가하고 피펫으로 잘 섞는다. 최종 THP-1 세포 밀도는 용액 당 5 × 105이고, 감염에 대응하는 다수의 40이다. </li><li> 25 mL의 저수지에 THP-1 / MTB -GFP 서스펜션을 따르십시오. </li><li> (G11를 통해 B3) THP-1 나머지 96 우물에 / MTB -GFP 서스펜션의 200 μL 날기 추가GA 멀티 채널 피펫. 참고 : 여러 96 웰 플레이트로 작업하는 경우, 정기적으로 더 혼합물을 각 웰에 첨가되어 있는지 확인하기 위해 탱크에 남아있는 THP-1 / MTB 서스펜션을 재현 탁. </li><li> 7-10일 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 천천히 (100)을 제거하여 2 일마다 미디어를 변경 μL 100 μL 멀티 채널 피펫을 사용하여 RPMI-C를 미리 예열 추가 잘 부드럽게 각각의 상단에서 미디어를 보냈다. 우물을 재현 탁하고 우물의 바닥에있는 MTB / 대 식세포 집계를 방해하지 마십시오. </li><li> 시각 MTB / 대식 세포 응집체의 크기의 노트를 가지고, 매일 형광 현미경 (4-10X 목적)에 의해 우물을 검사합니다. 하루에 7-10으로 MTB / 대 식세포 집계가 충분히 커야한다 약효 시험 (제 4 절) 동안 진행 (참조 그림 2 참조). </li><li> 원하는 경우, 자동 세포 이미징 시스템을 이용하여 96 웰 캡처 이미지 끼워밝은 필드와 GFP 필터 MTB / 대 식세포 골재 형성을 문서로 설정합니다. 주 : 사용자가 자동화 된 이미징 시스템에 대한 액세스 권한이없는 경우, 대표적인 웰 GFP 이미지 및 시야 기능을 가진 임의의 적당한 현미경을 사용하여 측정 할 수있다. </li></ol></li></ol> 4. 성장 억제 분석은 MTB / 대 식세포 집계에서 파생 의약품 효능에 대해 MTB 평가하기 <ol><li> 약물 준비 (두 약물에 대한 세중의 조건) 참고 : 템플릿도 1a를 참조하십시오. <ol><li> 별도의 96 웰 플레이트에서 G10까지 B2에 7H9-C 미디어의 125 μL를 추가합니다. </li><li> 단계 4.2.4의 희석을 고려하여 7H9-C의 1 mL에 이중 가장 원하는 최종 농도에서 두 약물을 준비합니다. </li><li> 세중 트리트먼트 각각 우물에 B11-C11-D11와 E11-F11-G11 각 약물의 250 μL를 추가합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 직렬 DILUTE 시험 약물 B10-G10에 B11-G11에서 125 μL를 이동하여 두 가지. 각 단계에서 5 회 피펫 팅하여 섞는다. </li><li> 플레이트에서 (오른쪽에서 왼쪽) 열에 열에서 125 μL를 이동하고, 열 4 후 중지를 계속합니다. </li><li> 4 열을 혼합 한 후, 폐기물 용기에 125 μL를 폐기합니다. 열 2와 3은 배경 (빈)과 긍정적 인 성장 컨트롤로 사용할 수 있도록 어떤 약물을 포함 할 수 없습니다. , 또는 테스트 약물 라이브러리도 1b에 템플릿을 따르 참고. 각각의 96 웰 플레이트는 단일 농도에서 58 약물을 수용 할 수있다. 이 단계 4.2.4 절반에 희석되기 때문에 이중 원하는 최종 농도를 사용하여이 약물 플레이트를 준비합니다. </li></ol></li><li> 약물 치료 : <ol><li> MTB를 포함하는 96 웰 플레이트는 대 식세포 (MTB / 대 식세포 집계) -infected 검색합니다. </li><li> 조심 멀티 채널 피펫과 관련된 모든 웰 (G11 내지 B2)을 디 캔트.두 단계의 방법이 수행 첫번째 플레이트 기울임없이 150 μL를 제거하고 플레이트를 기울 웰의 저부 에지에 피펫 팁을 삽입하여 나머지 미디어 (~ 50 μL)을 제거한다. 대 식세포 MTB / 집계가 잘 바닥에 부착 한, 어떤 자료가 손실 될 수 없습니다. </li><li> 조심스럽게 MTB / 대식 세포 집합체를 포함하는 판의 모든 관련 우물 (G11를 통해 B2)에 7H9-C 미디어의 100 μL를 추가합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 감염 판의 대응 웰에 96 웰 플레이트 (단계 4.1)을 함유하는 약물의 100 μL 옮긴다. </li><li> 밀폐 된 가방에 넣어 37 ℃에서 3 일간 배양한다. </li></ol></li></ol> 레사 주린 미세 적정 분석을 사용하여 정량 약물 효능의 (5) <ol><li> 0.8 mg의 최종 농도 원액 레사 주린 준비 / ㎖가 H 2 O.은 멸균 0.22 ㎛의 공극 크기의 PVDF 막 필터를 통해.</li><li> 1 : 1 비율의 2 레사 주린 원액, H 2 O 및 트윈 80 (H 2 O 20 % 용액)을 혼합하여 용액을 준비 작업 레사 주린. 최종 농도가 0.4 ㎎ / ㎖ 레사 주린의 5 % 트윈 80이다. </li><li> 플레이트 판독기 설치 530 nm의 여기 및 590 nm의 발광 37 ° C에서 24 시간 동안 매 30 분에서 형광을 판독 할 수있는 프로그램을 사용. 37 ° C까지 사전 따뜻한 플레이트 리더. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 약물 치료 플레이트 (단계 4.11)의 모든 관련 우물 (G11를 통해 B2)에 레사 주린 작업 용액 20 μL를 추가합니다. </li><li> 플레이트 리더에 접시를 놓고 단계 5.3에서 설정 프로그램을 시작합니다. 주 : 분석 플레이트의 대량의 처리를 용이하게하기 위해, 37 ° C의 배양기에서 분석을 개발하고 단일 형광 24 시간마다 판독을 수행하기에 충분하다. 이것은 또한 운동 기능 배양 플레이트 리더에 대한 액세스 권한이없는 사용자들에 적용 가능하다. </li></ol>

<ol><li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li>
<li>Bass, J. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li>
<li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li>
<li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMC207+becomes+bedaquiline%2C+a+new+anti-TB+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li>
<li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li>
<li>Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy%3A+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li>
<li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+back+to+the+future%3A+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).</li>
<li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis%2C+and+the+impact+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114(2014).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li>
<li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li>
<li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?</a> Front Microbiol. 6, 1117(2015).</li>
<li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li>
<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
<li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li>
<li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li>
<li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
</ol>

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여기서는 상세히 약효 시험에 적합한 다른 MTB 감염 모델을 설명 하였다. 이 모델은 계정 초기 결핵 약물 개발 과정에서 더 고려를 부여해야 두 가지 주요 요인을 취 약물 침투와 감염시 MTB의 대사 변화에 생리 학적으로 관련 장벽의 존재. 우리는 이전에 우리 감염 모델의 이점을 도시 처리량 호환성 16 감염을 스케일링 가능성을 제시하고 있지만, 여기에서 우리는 96 웰 플레이트 형식으로 직접 시스템을 채택함으로써 실제로 달성 할 수 있음을 보여준다. 이 피펫에 요구를 제거하고, 응집체의 크기는 크기에 도달 할 수있는 본래 어려운 개별 웰에 큰 배양 플라스크로부터 응집체를 분산으로 MTB / 대식 세포를 생성하는 능력은 96 웰 플레이트에서 직접 집계 유리한&gt; 500 μm의. 감염된 대 식세포 응집체의 큰 사이즈는 팁을 막히게 있거나 광범위한 피펫이 집계 깨지 것처럼 처리량 분석에 필요한 P200 멀티 채널 피펫을 사용하지 않도록한...

<html> 결핵 (TB)는 40 년 1 항 결핵 화학 요법의 유용성에도 불구하고 심각한 세계 보건 위협 남아있다. 이 비 준수 (2) 환자에 이르게 여러 약물 조합을 사용하여 6 개월의 긴 치료 기간에 대한 요구에 부분적으로 기인한다. 임상 적으로 승인 된 약물의 개발에 성공 3 사실상 존재이다 최근 약제 내성 결핵의 출현은 상기 전계의 문제를 배합했다. 사실, 철저한 항 결핵 약물 개발에도 불구하고, 단 하나의 약물은 FDA가 지난 40 년 4 임상 사용이 승인되었습니다. 따라서, 항 결핵 약물의 새로운 세대는 시급히이 문제를 해결하기 위해 필요하다. 결핵 신약 개발의 핵심 문제는 임상에서 효능을 시험 관내 활성을 가진 화합물에서 성공적으로 전송의 부족이다= &quot;외부 참조&quot;&gt; 5, 6, 7. 처음에, 목표 기반의 접근 방식은 전체 박테리아 세포로 번역하는 데 실패 방지 MTB 약 5,을 선별하기 위해 사용되었다. MTB 세포가 사용되는 경우에도, 그것은 종종 정확하게 생체 8,9 약물 효능을 예측할 수없는 배양액 성장 배양 물을 사용하여 수행된다. 이러한 문제가 인식되었고 MTB 잠복 또는 MTB 대 식세포를 함유하는 약물 스크리닝 분석은 성공적으로 8, 10, 11, 12을 확립하고있다. 그러나, 이들 고급 분석법 약물 비 혈관 폐 병변 발생 관통 장벽 충분한 고려를하고,하지 감염 부위의 괴사 병소이다. 과연심지어 첫번째 줄 TB 약물 리팜피신위한 차선 투여 인해 생체 조직 및 뇌척수액 (CSF)의 불충분으로 문제시 된 세포 MTB (8, 9)에 대해 효능을 감소뿐만 아니라 13 14 15 침투. 의심 할 여지없이 TB 신약 개발 노력을 향상시킬 것이다 초기 리드 개발 과정에서 계정에 이러한 매개 변수를 걸릴 것 같은, 새로운 모델과 분석으로. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 최근 MTB 약물 효능 검사 (16)에 대한 저렴하고 신속하고 BSL-2 호환 대안 감염 모델을 설립했다. 생리 학적으로 관련 세포 침투 장벽을 효과적으로 요약 및 대 식세포 계대를 생성 밀도가 생산 큰 식세포 집계 구조 내에서 MTB 포장이 감염 모델, <em&gt; 잠재 MTB를 닮은 변경된 생리 학적 상태와 MTB. 이 감염 모델로부터 유도 MTB 다른 세포 내 감염 모델과 일치하는 결과를 생성 약효를 평가하는 레사 주린 마이크로 타이 세이 (REMA)와 함께 혈중 농도에 비해 높은 CSF 농도를 달성하기 위해 공통 TB 약물의보고 능력을 잘 상관 관계 16. 여기서는 상세히 REMA를 사용 약제 감수성 테스트 식세포 계대 MTB 적합한 생산하는 MTB / 대식 세포 집합체 구조의 생성을 설명한다. 특히,이 감염 시스템을 후보 항 결핵 약물의 스크리닝과의 호환성을 위해 96- 웰 포맷으로 구성 될 수있는 방법을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>제조업체의 권장 사항을 따르십시오</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>H2O에 20% 스톡 용액 준비; 필터 살균</td></tr><tr><td>D-판토텐산 헤미칼슘염</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>H2</에 24mg/mL 스톡 용액 준비 서브>O; </td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>H2O에서 50mg/mL 원액 살균 필터,</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>H2O에서 200mg/mL 원액</td></tr><tr><td>Nalgene Square PETG 배지 병</td><td>Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>애틀랜타 생물학 S12450H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>코닝</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 플레이트 리더</td><td>Biotek</td><td></td><td>모든 형광판 리더 및 현미경과 교체 가능</td></tr><tr><td>Gen5 소프트웨어</td><td>Biotek</td><td></td><td>기록 및 분석 rezasurin coversion</td></tr><tr><td>리팜피신&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>H2O</td></tr><tr><td>Moxifloxacin Hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td></td>에서 <td>10mg/mL 원액 457960010 H2O</td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>R7017</td>에서 10mg/mL 원액 <td>준비 800 &mu; H2O의 g/mL 원액; 필터 살균</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>H2O에서 20% 스톡 용액 준비; 필터 살균</td></tr></tbody></table>

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

항결핵제의 초기 약물 개발 과정은 체외 활성을 가진 화합물이 임상 환경에서 효과로 비효율적으로 번역됨에 따라 방해를 받고 있습니다. 이는 감염된 숙주에 존재하는 생리학적으로 관련된 세포 침투 장벽에 대한 고려가 부족하기 때문일 수 있습니다. 최근에는 조밀하게 밀집된 결핵(Mtb)을 핵심으로 하는 대형 대식세포 응집 구조를 생성하는 대체 감염 모델을 확립했으며, 이는 약물 감수성 검사에 적합합니다. 이 감염 모델은 저렴하고 빠르며 가장 중요한 것은 BSL-2와 호환됩니다. 여기에서는 약물 감수성 검사를 위해 대식세포 계대 Mtb를 생성하는 Mtb/대식세포 응집체 구조를 생성하는 실험 절차를 설명합니다. 특히, 이 감염 시스템을 96웰 플레이트 형식에 직접 적용할 수 있는 방법을 보여주며, Mtb에 대한 화합물 라이브러리 스크리닝을 위한 처리량 능력을 보여줍니다. 전반적으로 이 분석은 단순성, 비용 효율성 및 확장성으로 인해 현재 사용 가능한 Mtb 약물 발견 도구 상자에 추가할 수 있는 귀중한 제품입니다.

96 웰 플레이트 형식으로이 감염 모델을 적응의 견고성을 확인하기 위해, 우리는 여기에 그림에 주어진 템플릿에 따라 약물 우리의 96 웰에서 파생 된 MTB의 감수성 감염 리팜피신에 모델 (RIF) 및 목시 플록 사신 (MOXI를) 적응을 조사 (1A). 우리는이 분석의 핵심 MTB / 대식 세포 집합체 구조의 생성을 확실하게함으로써, 스루풋의 호환성 (도 1b)를 가능하게하는 96- 웰 플레이트 포맷 (도 2)에서 생성 될 수 있음을 보여준다. 대 식세포 MTB 직접 잘 특성화 레사 주린 미세 적정 분석 (도 3)를 사용하여 약효 시험에 이용 될 수있는이 방법으로 제조 계대. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

본 절차의 전반적인 목표는 생존 염색약을 이용한 약물 감수성 테스트를 위해 96웰 플레이트 형식으로 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 대식세포 응집체 구조를 재현성 있게 생성하는 것입니다. 이 방법은 후보 화합물이 임상 단계로 효율적으로 전환되지 못해 어려움을 겪는 항결핵 화합물의 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있습니다. 이 단순하고 저렴하며 BSL-2 수준에서 적용 가능한 감염 모델의 주요 장점은 결핵성 육아종과 유사하게 생리학적으로 유의미한 세포 침투 장벽을 재현한다는 점입니다.이렇게 하면 생체 내(in vivo) 효능을 더 잘 예측할 수 있는 약물 감수성 결과가 생성됩니다. 이 절차는 감염을 위해 녹색 형광 단백질을 발현하는 M.tuberculosis MC squared 6206(이하 MTBGFP)을 준비하는 것으로 시작합니다. 이는 비병원성 균주이므로, 여기에 설명된 모든 프로토콜 작업은 생물안전 2등급(BSL-2) 시설에서 수행될 수 있음을 유의하십시오.준비할 각 96-웰 플레이트당 2.8 × 10⁸ MTBGFP를 스윙 버킷 원심분리기로 3,200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 5 mL의 RPMI를 가하여 박테리아를 세척합니다. 피펫팅을 통해 세포를 재현탁합니다.그런 다음 다시 원심분리합니다. 두 번째 원심분리가 끝나면 상층액을 따라내고 세균 세포를 7 mL의 RPMIC에 재현탁한 후, 10초 동안 볼텍싱합니다. 다음으로, 준비할 각 96웰 플레이트마다 7 × 10⁶개의 THP1 인간 단핵구 세포를 250 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 상층액을 따라내고 THP1 세포를 7 mL의 RPMIC에 재현탁합니다. 다음으로, A행과 H행, 그리고 1열과 12열의 웰에 멸균수 200 µL를 추가하여 감염을 위한 96-웰 플레이트를 준비합니다. 이 수분 테두리는 배양액의 증발을 방지합니다.배경 대조군 또는 공시료(blank)를 위해 2열의 B2에서 G2 웰에 RPMIC 200 µL를 추가합니다. THP1 단핵구를 감염시키려면 피펫을 사용하여 준비된 MTBGFP 박테리아 현탁액 전체를 THP1 세포 현탁액로 옮기고 피펫팅을 통해 잘 섞어줍니다. 최종 THP1 세포 밀도는 5 × 10⁵/mL이며, 이에 따른 웰당 감염 다중도는 40입니다.다음으로, THP1 MTBGFP 현탁액을 25 mL 리저버에 붓고, 멀티채널 피펫을 사용하여 나머지 96개 웰(E3부터 G11까지) 모두에 THP1 MTBGFP 현탁액 200 µL씩을 분주합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 7~10일 동안 배양합니다. 배양 기간 동안 2일마다 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰 상단에서 사용된 배지 100 µL를 천천히 제거하고, 미리 데워진 RPMI 100 µL를 조심스럽게 추가하여 배지를 교체합니다.배지를 교체할 때 웰 바닥에 형성된 MTB 대식세포 응집체가 흐트러지지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 매일 4~10배 대물렌즈와 명시야 및 GFP 필터 세트가 장착된 형광 현미경을 사용하여 웰을 시각적으로 관찰하십시오. MTB 대식세포 응집체의 크기를 기록하고, 필요한 경우 이미지를 촬영하십시오.7일에서 10일째가 되면 MTB 대식세포 응집체가 충분히 커져서, 이후 비디오에서 설명할 약물 효능 시험을 진행할 수 있습니다. 약물 시험을 위해, 새로운 96-웰 플레이트에 다음과 같이 두 종류의 항결핵제를 3반복으로 준비합니다. 먼저, B2에서 G10 웰까지 125 µL의 7H9C 배지를 첨가합니다.다음으로, 1 mL의 7H9C에서 원하는 최종 최고 농도의 2배 농도로 두 가지 약물을 준비합니다. 피펫을 사용하여 각 약물 250 µL를 3회 반복 처리(triplicate treatment)를 위해 웰 B, C, D 11과 E, F, G 11에 각각 분주합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 B 11부터 G 11까지의 액체 125 µL를 B 10부터 G 10으로 옮겨 시험 약물을 2배씩 단계 희석(serial dilution)합니다.각 단계마다 피펫팅을 다섯 번 하여 혼합합니다. 플레이트의 오른쪽에서 왼쪽 방향으로 125 µL씩 다음 컬럼으로 계속 옮기며, 네 번째 컬럼에서 멈춥니다. 네 번째 컬럼을 혼합한 후 125 µL를 폐기물 용기에 버립니다.두 번째와 세 번째 열에는 약물을 넣지 않아야 합니다. 이는 해당 열을 배경 대조군 및 양성 성장 대조군으로 사용하기 위함입니다. 그다음 인큐베이터에서 MTB 감염 대식세포가 들어 있는 96웰 플레이트를 꺼냅니다.플레이트를 기울이지 않은 상태에서 멀티채널 피펫을 사용하여 B2에서 G11 웰까지 배지 150 µL를 제거합니다. 그다음 여기에서 보여주는 것처럼 플레이트를 기울이고, 피펫 팁을 웰의 바닥 가장자리에 넣어 남은 배지 약 50 µL를 제거합니다. MTB 대식세포 응집체는 웰 바닥에 부착되어 있으므로, 시료가 손실되지 않아야 합니다.하지만 배지 제거는 최대한 부드럽게 수행해야 하며, 이 과정에서 재부유가 일어나지 않도록 주의해야 합니다. MTB 대식세포 응집체가 포함된 플레이트의 B 2번부터 G 11번 웰에 7H9C 배지 100 µL를 조심스럽게 첨가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 약물이 포함된 96웰 플레이트의 100 µL를 감염 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다.그 다음 플레이트를 밀봉된 봉투에 넣고 37 °C에서 3일 동안 배양합니다. 레사주린 분석법은 대사 활성이 있는 MTB에 의해 생성된 산화 종이 청색 레사주린을 형광 분홍색 레조루핀으로 전환하는 원리를 이용합니다. 색상 및 형광의 변화는 박테리아 성장의 양을 결정하는 대리 마커로 사용할 수 있습니다.최종 농도가 8 mg/mL가 되도록 물에 resazurin의 스톡 용액을 준비합니다. 멸균을 위해 22 µm 공극 크기의 PVDF 막으로 여과합니다. 스톡 용액, 물, Tween-80을 2:1:1 비율로 혼합하여 resazurin 작업 용액을 준비합니다.최종 농도는 resazurin 4 mg/mL 및 5% Tween-80입니다. 플레이트 리더를 사용하여 37 °C에서 24시간 동안 30분 간격으로 530 nm 여기 및 590 nm 방출 파장에서 형광을 측정하도록 프로그램을 설정하십시오. 플레이트 리더를 37 °C로 미리 예열하십시오.멀티채널 피펫을 사용하여 약물 처리된 플레이트의 B2-G11 웰에 resazurin 작업 용액 20 µL를 첨가합니다. 플레이트를 리더기에 넣고 프로그램을 시작합니다. 이 감염 모델을 96-웰 플레이트 형식으로 적용하는 것의 견고함을 확인하기 위해, 본 영상에서 설명한 대로 MTB의 rifampicin(RIF) 및 moxifloxacin(moxy)에 대한 감수성을 평가하였습니다.여기에 표시된 바와 같이, 96-well 플레이트 형식으로 MTB 대식세포 응집 구조를 성공적으로 생성하여 처리량 호환성을 확보하였습니다. 세균 성장의 지표인 resazurin의 전환을 정량적으로 측정하기 위해, 개별 well의 형광을 24시간 동안 동적으로 모니터링했습니다. 생존 가능한 MTB 세포의 존재 여부는 청색 resazurin 염료가 분홍색 환원 형태로 전환되는 것으로 판단하며, 이는 포화 시점의 상대적 형광 강도에 의해 정량적으로 반영됩니다.이 대표 미니 그래프들은 X축의 시간 대비 Y축에 표시된 결과 형광 단위(fluorescence units)를 보여줍니다. 약물 감수성 살균 곡선을 생성하기 위해, rifampicin 및 moxifloxacin 처리 웰을 약물을 처리하지 않은 대조군의 최대 MTB 성장량을 100% 생존율로 하여 정규화했습니다. 모든 샘플 웰에서 배경 대조군 공백 신호(blank signals)를 뺐습니다.살상 곡선을 생성하기 위해 약물 처리의 각 개별 농도에 대한 생존율을 도식화하였습니다. 이 데이터는 우리의 감염 모델에서 유래한 MTB에 대해 rifampicin과 moxifloxacin 모두 90%의 성장 억제가 관찰되는 항생제의 최저 농도인 최소 억제 농도가 2 µg/mL보다 높다는 것을 보여줍니다. 따라서, 우리의 감염 모델 및 분석법을 사용하여 MTB에 대해 측정한 이 두 약물의 최소 억제 농도는 생체 내(in vivo)에서의 약물 활성을 더 잘 반영합니다.이 영상을 시청한 후에는 레사주린 분석법을 이용한 약물 감수성 테스트를 위해 MTB 감염 대식세포 응집체 구조를 신뢰성 있고 재현 가능하게 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 따라 제시된 2가지 약물 템플릿을 58가지 약물 라이브러리 패널로 수정하면 고속 대량 약물 스크리닝이 가능해집니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 결핵균(Mtb) 감염에 대한 약물의 효능을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 생체 내 감염을 모방하는 Mtb/대식세포 응집체를 포함하는 체외 감염 모델이 생성됩니다. 적절한 항생제를 도입하면 약물 농도가 증가하는 박테리아의 생존을 모니터링하기 위해 레수자린 분석을 통해 그 효능을 테스트합니다.

Mycobacterium tuberculosis 감염 모델에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 분석

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

세포 내 M. 결핵 성장의 신속하고 효율적인 정량화는 결핵(TB)에 대한 개선된 치료법을 추구하는 데 중요합니다 . 이 프로토콜은 후보 숙주 지시 요법으로 처리된 대식세포에서 Mtb 성장을 정량화하기 위해 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하는 브로스 기반 비색 검출 분석을 설명합니다.

결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

이 연구는 Mycobacterium tuberculosis 와 SLAMF1 미생물 센서의 상호 작용을 평가하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 분석은 유세포 분석 및 형광 현미경을 사용하여 인간 단핵구 유래 대식세포에 대해 수행되었습니다. 설명된 도구는 병원체와 면역수용체 간의 상호 작용을 연구하는 데 관련이 있습니다.

Mycobacterium tuberculosis Immune Receptor SLAMF1과의 상호 작용 연구를 위한 형광 분석

특정 조건에서 배양해 때 결핵은 Mycobacterium 마약 허용 biofilms를 형성합니다. 여기 culturing M.하는 방법을 설명 결핵 biofilms 및 약물 관용 persisters의 주파수를 결정. 이러한 프로토콜은 M.의 약물 내성의 메커니즘에 대한 연구를 위해 도움이 될 것입니다 결핵.

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

결핵 및 말라리아는 인간과 열대 빈곤 인구의 사망률과 사망의 주요 원인에서 가장 널리 감염의 두 가지입니다. 우리는 감염의 자연 경로를 통해 두 병원체 공격 후 마우스에서 말라리아 결핵 동시 감염의 결과를 연구하는 실험 모델 시스템을 구축.

자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

증폭 마이크로 어레이 크게 최종 사용자를위한 마이크로 어레이 플로 간소화 단일 챔버로 비대칭 PCR 증폭 및 마이크로 어레이 혼성화를 결합한다. 마이크로 어레이 워크 플로우를 간소화하는 것은 정기적으로 낮은 자원 환경에서 사용할 수있는 마이크로 어레이 기반의 진단 프로그램을 만들기위한 필요한 첫 번째 단계입니다.

다중 약물 내성을 보여<em&gt; 결핵균</em&gt; 증폭 마이크로 어레이

배우세요 96웰 플레이트에서 Mycobacterium tuberculosis에 감염된 대식세포 응집체를 생성하여 약물 감수성을 평가하는 방법을. 이 고처리량 분석은 BSL-2 조건에서 비용 효율적으로 항결핵 약물 개발을 가속화합니다.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기

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