높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기 결핵균

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 생존 염료를 사용한 약물 감수성 검사를 위해 결핵균에 감염된 대식세포 응집체 구조를 96웰 플레이트 형식으로 재현성 있게 생성하는 것입니다. 이 방법은 항결핵 화합물에 대한 초기 약물 개발 프로세스를 개선할 수 있으며, 이는 후보 화합물을 임상 환경으로 비생산적으로 번역함으로써 방해를 받습니다. 이 간단하고 저렴한 BSL 2 호환 감염 모델의 주요 장점은 결핵 육아종을 연상시키는 생리학적으로 관련된 세포 침투 장벽을 요약한다는 것입니다.

이는 생체 내 효능을 더 잘 예측하는 약물 감수성 결과를 생성합니다. 감염을 위해 M.tuberculosis MC squared 6206(이하 MTBGFP라고 함)을 발현하는 녹색 형광 단백질을 준비하여 이 절차를 시작합니다. 이것은 독성 균주이므로 여기에 설명된 프로토콜의 모든 작업은 생물 안전성 레벨 2 시설에서 수행될 수 있습니다.

각 96 웰 플레이트에 대해 2.8 곱하기 10에서 원심분리기를 3, 스윙 버킷 원심 분리기에서 5 분 동안 200 번 G에 8 번 MTBGF. 탈수 후 상층액을 흡입하고 RPMIC 5ml를 첨가하여 박테리아를 세척합니다. 세포를 다시 현탁시키기 위해 위아래로 피펫팅합니다.

그런 다음 다시 원심 분리기를 사용하십시오. 두 번째 스핀 후 상층액을 붓고 박테리아 세포를 7 밀리리터의 RPMIC에 재현탁시킨 다음 10 초 동안 와류시킵니다. 다음으로, 각 96 웰 플레이트를 설정하기 위해 5분 동안 250배 G에서 6번째 THP1 인간 단핵구세포에 대해 7배 10회 원심분리합니다.

원심분리 후 상층액을 붓고 THP1 세포를 7ml의 RPMIC에 재현탁합니다. 다음으로, 200마이크로리터의 멸균수를 A열과 H열, 1열과 12열의 우물에 추가하여 감염을 위한 96개의 웰 플레이트를 준비합니다. 이 물 테두리는 배양 매체의 증발을 방지합니다.

200마이크로리터의 RPMIC를 2열에 추가하고, B 2를 G 2에 추가하여 배경 제어 또는 블랭크를 사용합니다. THP1 단핵구를 감염시키려면 피펫을 사용하여 준비된 전체 MTBGFP 박테리아 현탁액을 THP1 세포 현탁액으로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 최종 THP1 세포 밀도는 10의 5배에서 밀리리터당 5번째이며 이에 상응하는 감염의 이중성은 40입니다.

다음으로, THP1 MTBGFP 현탁액을 25ml 용기에 붓고 멀티채널 피펫을 사용하여 나머지 96개 웰(E 3에서 G 11까지) 모두에 200마이크로리터의 THP1 MTBGFP 현탁액을 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5%CO2로 7일에서 10일 동안 배양합니다. 배양 기간 동안 이틀에 한 번씩 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰 상단에서 100마이크로리터의 사용한 배지를 천천히 제거하고 100마이크로리터의 예열된 RPMIC을 부드럽게 추가하여 배지를 교체합니다.

배지를 변경할 때 웰 바닥의 MTB 대식 세포 응집체를 방해하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 매일 명시야와 4-10 X 대물렌즈가 있는 GFP 필터 세트가 장착된 형광 현미경을 사용하여 웰을 육안으로 검사합니다. MTB 대식세포 응집의 크기를 기록하고 원하는 경우 이미지를 캡처합니다.

7일에서 10일째까지 MTB 대식세포 응집체는 비디오의 뒷부분에 설명된 바와 같이 약물 효능 테스트를 진행할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 약물 검사를 위해 다음과 같이 새로운 96웰 플레이트에 2개의 항결핵제를 3회씩 준비합니다. 먼저 125마이크로리터의 7H9C 매체를 웰 B 2에서 G 10에 추가합니다.

다음으로, 1mL의 7H9C에서 원하는 가장 높은 최종 농도의 두 배로 두 약물을 준비합니다. 피펫을 사용하여 각 약물 250마이크로리터를 웰 B, C 및 D 11에 추가한 다음 E, F 및 G 11에 각각 추가하여 3회 처리합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 125마이크로리터를 B 11에서 G 11에서 B 10을 통해 G 10으로 이동하여 테스트 약물을 2배로 연속적으로 희석합니다.

각 단계에서 5회 피펫팅하여 혼합합니다. 플레이트를 가로질러 열에서 열로 125마이크로리터를 계속 이동하고 4열 이후에는 멈춥니다. 컬럼 4를 혼합한 후 125마이크로리터를 폐기물 용기에 버리십시오.

2열과 3열에는 약물이 포함되어서는 안 됩니다. 이렇게 하면 배경으로 사용하고 긍정적인 성장 조절을 할 수 있습니다. 다음으로, MTB에 감염된 대식세포가 들어 있는 96 웰 플레이트를 인큐베이터에서 회수합니다.

플레이트를 기울이지 않고 멀티채널 피펫을 사용하여 웰 B 2에서 G 11까지 150마이크로리터의 매체를 제거합니다. 그런 다음 여기에 표시된 대로 플레이트를 기울이고 피펫 팁을 웰의 하단 가장자리에 삽입하고 약 50마이크로리터의 나머지 매체를 제거합니다. MTB 대식세포 응집체가 웰 바닥에 부착되기 때문에 물질이 손실되어서는 안 됩니다.

그러나 매체의 제거는 가능한 한 부드럽게 이루어져야 하며 이 과정에서 재부유를 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. MTB 대식세포 응집체가 포함된 플레이트의 웰 B 2에서 G 11까지 7H9C 매체 100마이크로리터를 부드럽게 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트를 함유한 약물 100마이크로리터를 감염 플레이트의 해당 웰로 이송합니다.

그런 다음 플레이트를 밀봉된 백에 넣고 섭씨 37도에서 3일 동안 배양합니다. 레사주린 분석은 대사 활성 MTB에 의해 생성된 산화 종에 의존하여 파란색 레사주린을 형광 분홍색 레소루핀으로 변환합니다. 색과 형광의 변화는 박테리아 성장량을 결정하기 위한 대리 마커로 사용할 수 있습니다.

물 중 밀리리터당 8mg의 최종 농도로 레사주린의 원액을 준비합니다. 멸균을 위해 22마이크로미터 기공 크기의 PVDF 멤브레인을 통해 필터링합니다. resazurin에서 원액, 물 및 Tween-80을 2:1:1 비율로 혼합하여 작업 용액을 준비합니다.

최종 농도는 레사주린 밀리리터당 4mg, Tween-80 5%입니다. 플레이트 리더를 사용하여 섭씨 37도에서 30분마다 24시간 동안 530나노미터 여기와 590나노미터 방출에서 형광을 판독하는 프로그램을 설정합니다. 플레이트 리더를 섭씨 37도로 예열합니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 약물 처리 플레이트의 웰 B 2에서 G 11에 20마이크로리터의 레사주린 작업 용액을 추가합니다. 리더에 플레이트를 놓고 프로그램을 시작합니다. 이 감염 모델을 96웰 플레이트 형식에 적용하는 것의 견고성을 확인하기 위해 이 비디오에 설명된 대로 목시플록사신 목시에서 MTB rifampicin RIF의 감수성을 평가했습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 MTB 대식세포 응집체 구조는 96웰 플레이트 형식으로 성공적으로 생성되어 풋 호환성을 통해 가능해졌습니다. 박테리아 성장의 지표인 레사주린(resazurin)의 전환을 정량적으로 측정하기 위해 개별 웰의 형광을 24시간 동안 운동학적으로 모니터링했습니다. 생존 가능한 MTB 세포의 존재는 파란색 레사주린 염료가 분홍색으로 감소된 형태로 전환됨에 따라 결정되며, 이는 포화 시점에서 상대 형광 z 그물에 의해 정량적으로 반영됩니다.

이 대표적인 미니 그래프는 Y축에 표시된 결과 형광 단위와 X축에 표시된 시간을 보여줍니다. 약물 감수성 사멸 곡선을 생성하기 위해 리팜피신 및 목시플록사신으로 처리된 웰을 무약물 대조군 최대 MTB 성장률을 100% 생존으로 정규화했습니다. 백그라운드 컨트롤 블랭크 신호는 모든 샘플 웰에서 제외되었습니다.

생존율은 사멸 곡선을 생성하기 위해 약물 치료의 각 개별 농도에 대해 표시되었습니다. 이러한 데이터는 최소 억제 농도가 90% 성장 억제가 관찰되는 항생제의 최저 농도가 당사의 감염 모델에서 파생된 MTB에 대한 리팜피신과 목시플록사신 모두에 대해 밀리리터당 2마이크로그램 이상임을 정의합니다. 따라서, 당사의 감염 모델 및 분석을 사용하여 MTB에 대한 이 두 약물의 최소 억제 농도는 생체 내에서 이러한 약물의 활성을 더 잘 반영합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 레사주린 분석을 사용하여 약물 감수성 검사를 위해 MTB에 감염된 대식세포 응집체 구조를 안정적이고 재현성 있게 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 58 약물 라이브러리 패널에 표시된 바와 같이 2개의 약물에서 약물 주형을 수정하여 높은 처리량을 가진 약물 스크리닝을 가능하게 합니다.