마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

본 절차의 전반적인 목표는 다양한 유도 심근세포 하위 유형을 생성하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 근절 조립 및 하위 유형 특이화를 조절하는 데 필요한 신호와 같은, 심장 리프로그래밍 중 하위 유형 특이적 계보 전환에 관한 핵심적이고 기초적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 메커니즘 연구 수행에 필수적인 심근 하위 유형 특이화에 미치는 영향을 정량화할 수 있는 방법을 제공한다는 점입니다.

먼저, E 12.5 단계의 배아에서 마우스 배아 섬유아세포를 분리하십시오. 동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 액체 질소에 보관하십시오. 다음으로, plat-E 세포를 회수하여 6-웰 플레이트의 웰당 100만 개의 세포가 도달하도록 분주하여, 24시간 이내에 세포의 합류도가 70~80%에 도달하게 하십시오.

세포를 트랜스펙션 배지로 덮고 표준 배양 조건에서 배양합니다. 실험 전날, 15 mL 원추형 폴리스티렌 튜브를 사용하여 반응당 60 µL의 저혈청 배지와 6 µL의 트랜스펙션 시약을 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 반응시킵니다.

형질전환 시약의 경우, 형질전환 효율의 감소를 방지하기 위해 시약을 환원 혈청 배지에 직접 첨가하십시오. 다음으로, 반응당 총 2 µg의 GHMT 칵테일을 첨가하고 튜브를 가볍게 쳐서 혼합합니다. 반응물을 상온에서 15분 동안 배양한 후, 혼합물을 plat-E 세포에 방울 단위로 천천히 첨가하십시오.

형질전환 날짜와 시간을 기록합니다. 형질전환된 plat-E 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 마우스 배아 섬유아세포를 분주하기 한 시간 전에, 각 웰에 12 millimeter fibronectin 코팅 커버슬립을 먼저 추가하여 면역세포화학 분석용 24웰 플레이트를 준비합니다.

다음으로, 각 웰에 300 µL의 소 콜라겐 용액을 넣고 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝날 무렵, 냉동 보관된 HCN4GFP 마우스 배아 섬유아세포 바이알을 해동합니다. 세포를 빠르게 해동하고, 미리 데워둔 섬유아세포 배지로 한 번 세척한 후 살아있는 세포의 농도를 측정합니다.

그 후 24-웰 플레이트의 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, 콜라겐과 피브로넥틴이 코팅된 커버슬립 위에 웰당 30,000개의 세포를 즉시 분주합니다. 형질전환 24시간 후, 레트로바이러스 배지를 0.45 µm 공극 크기의 계면활성제 제거 셀룰로오스 아세테이트 필터로 여과하여 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음, 최종 농도가 8 µg/mL이 되도록 폴리브렌(polybrene)을 첨가합니다.

신선한 transfection 배지 2 mL를 사용하여 plat-E 세포를 조심스럽게 보충합니다. 배지를 너무 빠르게 교체하면 세포가 떨어져 나갈 수 있습니다. 적절하게 유지된 plat-E 세포는 mL당 평균 1,000만 개의 감염 단위를 생성합니다.

세포의 95% 이상에서 나타나는 높은 GFP 발현 및 강도는 일반적으로 GHNT 매개 유도 심근세포 유사 세포의 성공적인 생성을 의미합니다. 다음으로, 배양된 배아 섬유아세포의 배지를 흡입하여 제거하고 새로 수집한 레트로바이러스 배지를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 배양기로 옮겨 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 다시 plat-E 세포의 배지를 배아 섬유아세포로 옮깁니다. 두 번째 바이러스 수집 후 plat-E 세포는 폐기합니다. 유도 후 48시간이 지나면, 세포 배양 상청액을 흡입하여 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.

그런 다음 24-well 플레이트의 각 well에 미리 데워둔 유도 심근세포 유사 세포 배지를 500 microliters씩 추가합니다. 이후 12일 동안 2~3일마다 배지를 교체합니다. 유도 후 14일째에 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 각 well을 ice cold PBS 300 microliters로 헹굽니다.

그런 다음 PBS를 제거하고 웰당 250 µL의 4% paraformaldehyde 용액을 첨가한 후, 실온에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 0.1% tritonex 100과 PBS 300 µL로 웰을 5분씩 3회 세척하여 세포를 투과화합니다. 마지막 세척 후 과잉의 투과화 용액을 흡입 제거하고, 웰당 300 µL의 범용 블로킹 버퍼를 첨가합니다.

실온에서 10분 동안 블로킹합니다. 유도된 심방 유사 심근세포 내에서 유도된 페이스메이커 유사 심근세포를 확인하기 위해, 한 쌍의 슬라이드를 mouse anti-alpha actenin, chicken anti-GFP 및 rabbit anti-NPPA 항체로 하룻밤 동안 염색합니다. 다음 날, 웰을 세척하고 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 적절한 2차 항체를 첨가합니다.

추가 세척 후, 유리 현미경 슬라이드에 마운팅 용액 2.4 µL를 넣습니다. 24-웰 플레이트에서 커버슬립을 꺼내어 과량의 용액을 제거합니다. 그런 다음 마운팅 용액이 있는 유리 슬라이드로 커버슬립을 옮깁니다.

각 슬라이드에 대해, 한쪽 가장자리부터 시작하여 적색 형광 채널에서 위아래로 스캐닝하며 alpha-actinin 양성인 sarcomere 양성 세포를 식별합니다. Sarcomere 줄무늬는 555 nanometer 파장에서 가장 쉽게 식별할 수 있습니다. 세포가 식별되면 녹색 채널로 전환하여 양성 여부를 기록합니다.

그 다음 컴퓨터로 전환하여 NPPA 또는 MYL2 염색을 확인하기 위해 원적외선 647 nanometer 파장을 평가합니다. alpha-actinin 양성, sarcomere 양성, Hnc4-GFP 음성 및 Nppa 양성인 세포가 유도된 심방 유사 심근세포입니다. Nppa 염색은 핵 주변에서 점상으로 나타납니다.

먼저, 동봉된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 세포 파종 24시간 후에 세포 수를 측정합니다. 다음으로, 커버슬립 위의 각 세포를 시각적으로 검사하여 alpha-actinin 및 근절(sarcomere) 염색이 적절히 되었는지 확인하고, 두 마커 모두에 양성 반응을 보인 세포 수를 기록합니다. 그런 다음, 이를 실제 총 파종 세포 수로 나눕니다.

일반적인 리프로그래밍 실험에서는 alpha-actinin과 sarcomere 모두에 양성인 세포가 약 1% 정도 생성됩니다. 14일째에 실험을 중단하고 sarcomere 조직화 정도를 평가할 수 있습니다. 이는 여기에서 빨간색으로 표시된 alpha-actinin 염색 양성 반응을 통해 확인할 수 있습니다.

근절 조직(sarcomere organization)을 보이는 세포만이 자발적인 박동이 가능하므로, 이는 좋은 1차 확인 방법이 됩니다. 여기에 표시된 것은 Hcn4-GFP 리포터 마우스에서 유도된 페이스메이커 유사 심근세포들입니다. 이 시야에서 세 개의 세포가 근절 조직을 나타내고 있습니다.

이미지 중앙에 Hcn4-GFP 양성인 세 개의 세포 군집이 있으며, 이는 페이스메이커 세포 유형으로 식별할 수 있습니다. 왼쪽 하단에 있는 하나의 세포는 alpha-actinin 염색이 관찰되지만, sarcomere 구조나 식별 가능한 하위 유형 마커는 나타나지 않습니다. 유도된 심실 유사 심근세포 집단에서 중앙의 세포는 sarcomere 구조를 보이며, 이 세포는 심실 심근세포의 마커인 myosin light chain 마커 MYL-2에 대해서도 양성 반응을 보입니다.

숙련되면 plat-E 세포의 플레이팅과 형질전환은 1시간 내에 완료할 수 있습니다. 마우스 배아 섬유아세포의 유도는 1~2시간, 24웰 플레이트 전체의 마이토(myto) 정량 분석은 약 8시간이 소요됩니다. 이 실험 과정을 수행할 때, 건강한 마우스 배아 섬유아세포와 고역가 바이러스가 성공적인 리프로그래밍 실험의 핵심이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 개별 유도 심근세포 아형을 생성하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.