Name: 마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 배우세요 마우스 배아 섬유아세포를 GHMT 전사인자로 재프로그래밍하여 심근 세포로 전환하는 방법입니다. 면역세포화학법과 공초점현미경을 활용해 심방, 심실, 박동조절 세포 등 다양한 심근 서브타입을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

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A.F.-P.는 National Science Foundation Graduate Research Fellowship의 보조금 번호 2015165336에 따라 지원되었습니다. N.V.M은 NIH(HL094699), Burroughs Wellcome Fund(1009838) 및 March of Dimes(#5-FY14-203)의 보조금으로 지원되었습니다. 프로토콜 개발 및 데이터 분석에 중요한 기여를 한 Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, Minoti Bhakta에게 감사드립니다. 또한 귀중한 기술적 정보를 제공해 준 John Shelton과 과학적 토론을 해준 Munshi 연구실 구성원들에게도 감사드립니다.

동물 관행과 관련된 모든 실험 절차는 UT 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. Hcn4-GFP E12.5 마우스 배아 섬유 아세포 1. 분리 (MEFs에) <ol><li> 동형 접합 Hcn4-GFP의 남성과 CD-1 여성 사이의 시간 제한 교배를 설정합니다. </li><li> 이산화탄소 안락사 이후 자궁 전위에 의해 E12.5에서 임신 여성을 희생. <ol><li> 이전 23 22 설명 된대로 해부 집게와 자궁 뿔을 제거하고 칼슘 또는 마그네슘없이 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 얼음에 페트리 접시 2+에 배치합니다. </li></ol></li><li> 멸균 기법을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 후속 단계를 수행한다. <ol><li> 가위를 사용하여 집게를 해부 골목 자궁과 양수에서 배아를 제거합니다. 더 나은 처리를 위해 첨부 된 태반을 유지합니다. 레그나NT CD-1 여성은 일반적으로 10 ~ 14 새끼를 낳을. </li><li> 집게를 해부 사용하여 격리 된 배아을 빠르게 70 % (v / v)의 EtOH로 두 번을 씻어. 주 : 세척은 세포 사멸을 최소화하기 위해 빠른해야한다. </li><li> 격리 된 배아에서 심장을 포함, 머리, 사지, 꼬리와 내장을 제거합니다. </li><li> 약 1mm 3 크기로 멸균 면도날을 사용하여 1X PBS와 잘게 다진 1 mL를 10 cm 접시에 남아있는 조직을 놓습니다. </li><li> PBS로 50 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송합니다. </li><li> 3 분 동안 300 XG에 스핀. 조심스럽게 과량의 PBS를 대기음. </li><li> 배아 당 멸균 0.25 % 트립신 - EDTA의 1 ML을 추가합니다. 15 분 동안 37 ° C의 수조에서 세포를 부화. 부드럽게 튜브마다 4 분을 섞는다. 오버 소화 조직의 크게 수율을 낮출 것이다. </li><li> 4 초 동안 최대 속도 (3200 RPM)에서 소용돌이 세포 혼합물. </li><li> 배아 당 섬유 아세포 미디어의 2 mL를 넣고 섞는다. 필터 t스트레이너를 통해 세포를 돕기 위해 피펫을 사용하여 100 μm의 셀 스트레이너 hrough. 이후의 모든 매체의 배합은 표 1을 참조하십시오. </li><li> 4 분 동안 300 XG에 스핀. 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li><li> 3 배아 당 신선한 섬유 아세포 미디어의 10 ㎖를 추가하고 6 ~ 10 번 씹다. </li><li> 준비 매 3 배아 1 15 cm 조직 배양 접시에 세포를 플레이트. 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 문화 하룻밤. </li><li> 밤새 배양 한 후, 접시 당 미디어의 신선한 30 mL로 미디어를 교체합니다. 밤새 다시 인큐베이터로 세포를 놓습니다. 참고 : 형광 현미경 Hcn4-GFP + 세포의 오염을 확인합니다. 문화는 GFP해야한다 - 만 프로그래밍에 GFP +를하게된다. </li><li> 다음날, 신선한 미리 예열 0.25 % 트립신 EDTA 3 mL를 수확 세포. 카운트 세포를 동결. 일반적으로 용액 당 3 × 10 6 세포에서 세포를 동결. 예상 yieLD는 배아 당 3 × 10 6 세포해야한다. </li></ol></li></ol> 2. 레트로 바이러스 생산 및 재 프로그래밍 주의 : 다음 프로토콜은 감염성 레트로 바이러스의 생산 및 처리가 필요합니다. BSL-2 가이드 라인 및 무균 기술 하에서 바이오 안전성 레벨 2 장에서 다음 단계를 수행합니다. 레트로 바이러스에 노출 된 모든 자료를 폐기하는 10 % 표백제를 사용합니다. <ol><li> 레트로 바이러스의 생산 및 MEFs에 준비 참고 : 다음과 같은 프로토콜을 24 웰 플레이트에서 레트로 바이러스 6 웰 플레이트에서 생산 및 MEF 감염입니다. 다른 형식은 표 2를 참조하십시오. 타이밍 (섹션 2.3 및 그림 2 참조) 각 실험에 대해 적절하게 조정해야합니다 있도록 MEFs에이 일 -1에 도금되어있다. <ol><li> 플랫-E (PE) 제조업체의 권장 사항에 따라 세포를 유지한다. 간단히, DMEM에서 배양 PE 세포는 10 % FBS, 1 μg의 / ㎖로 보충 된 puromyCIN, 10 μg의 / ㎖의 블라스트, 페니실린 및 스트렙토 마이신. 통로 세포 1 : 문화 70~90%의 포화 상태에 도달 4 이틀. </li><li> 일 -2 : 형질 전날, 형질 미디어에서 6 웰 플레이트에 / 잘 1 × 10 6 세포에서 플랫 - E 세포를 시드. 세포를 형질 감염시 70~80% 합류해야한다. </li></ol></li><li> 상업적 형질 전환 제를 이용하여 형질 전환. 참고 : 상용 시약은 형질 전환 전에 실온 (RT)에 있어야합니다. DNA를 형질 들어 GHMT 칵테일 구를 형성하여 레트로 바이러스 플라스미드 DNA 각각 (G, H, M, 및 T)를 추가한다. <ol><li> 일 -1 : 15 ML 원뿔 폴리스티렌 튜브에서, 6 웰 플레이트 형식 반응 당 형질 감염 시약 6 μL의 혈청 감소 배지 중 60 μL를 혼합한다. 실온에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션. 주 : 여기에서 사용 된 트랜 스펙 션 시약 플라스틱 결합 때문에,직접 환원 혈청 배지에 형질 전환 효율의 임의의 감소를 피하기 위해 DD. </li><li> 반응 당 GHMT 칵테일 2 μg의 총을 추가하고 부드럽게 섞어 누릅니다. 소용돌이하지 마십시오. RT에서 15 분 동안 반응물을 인큐베이션. </li><li> 드롭 현명한 방식으로 PE 세포 단계 2.2.3에서 혼합물을 추가합니다. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하룻밤 형질 플랫 - E 세포를 품어. 형질 전환의 시간을 기록한다. </li></ol></li><li> Hcn4-GFP 마우스 배아 섬유 아 세포의 시드. <ol><li> 1 시간 MEFs에 도금하기 전에, 면역 세포 화학에 대한 24 웰 플레이트를 준비합니다. <ol><li> 물론 당 12mm의 피브로넥틴의 커버 슬립을 추가합니다. </li><li> (예 SureCoat) 소 콜라겐 용액 300 μL 및 코트 웰을 1 시간 동안 37 ° C의 배양기에서 배양한다. </li><li> 바로 MEF 도금 전에 대기음 코팅 용액. </li></ol></li><li> Hcn4-GFP MEFs에의 냉동 병을 녹여 및 사전 예열 fibrobl에 1 개를 세척5 분 500 XG에 AST 미디어. </li><li> 트리 판 블루 배제 또는 유사한 염료를 사용하여 세포 생존을 결정합니다. 다음 식을 사용하여 배양 용액 당 생존 세포의 수를 계산한다 : % 가능한 세포가 = [1.00 - (총 세포의 파란색 셀 수 / 수)] × 100 <ol><li> 다음 식을 이용하여 생존 세포의 수를 계산한다 : 세포 현탁액의 생균 = % 생존 세포의 X 희석 인자 X 10,000 X 전량 </li></ol></li><li> 이전에 제조 된 소 콜라겐 솔루션 피브로넥틴 coverslip에있는 24 웰 플레이트 상에 잘 당 종자 3 × 104 세포. </li></ol></li><li> 형질 도입 및 MEFs에의 재 프로그래밍 참고 : 제조업체의 메모에 따르면, 제대로 플랫 - E 세포를 1 × 10 7 감염 단위 / mL의 평균 역가를 생산 유지했다. 역가가 직접 각 실험 측정되지 않지만하는 GFP 제어는 항상 감염 효율에 대한 대용으로 포함된다.높은 GFP 발현 강도 (GFP +&gt; 95 %)는 일반적 iCLMs 성공적 GHMT 매개 세대 연관. <ol><li> 0 일 24 시간 후 형질 감염은, 0.45 ㎛의 세공 크기의 계면 활성제가없는 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 PE 레트로 매체 필터링하고 15ml의 원뿔형 튜브에 옮긴다. 8 μg / ML의 최종 농도로 폴리 브렌을 추가한다. 조심스럽게 새로운 형질 감염 배지 2 ㎖의 세포를 보충. 주 : 매체가 너무 빠르게 변경되면 세포는 쉽게 판에서 분리합니다. </li><li> 배양 MEFs에의 매체를 기음과 갓 수집 된 레트로 바이러스 매체를 추가; 그것은 6 웰 플레이트의 웰 당 미디어 1.7 mL로 산출한다. 24 웰 플레이트의 웰 당 ~ 800 μL를 추가합니다. 인큐베이터에 MEF 플레이트를 반환하고 밤새 품어. </li><li> 1 일 : 반복 2.4.1와 2.4.2 단계를 반복합니다. 2 차 바이러스 수집 한 후 세포를 폐기하십시오. 인큐베이터에 감염된 MEFs에를 반환하고 하룻밤 휴식을 할 수 있습니다. </li><li> 주 2 : 48 시간 후 유도, 1X PBS로 세포 조절 미디어 및 세척 1 개를 대기음. 24 웰 플레이트의 웰 당 500 μL 사전 예열 iCLM 미디어를 추가합니다. </li><li> 삼일 - 매 2 iCLM 미디어를 교체합니다. 십사일 심장 프로그래밍의 면역 세포 (ICC) 분석을 위해 바이러스 유도 후 처리 플레이트. </li></ol></li></ol> 재 프로그램 MEFs에 3. 면역 염색 <ol><li> 14 일 후 유도, 신중하게 미디어를 대기음. </li><li> 얼음처럼 차가운 1X PBS 300 μL 잘 각을 씻어. 초과 솔루션을 대기음. </li><li> 24 웰 플레이트의 웰 당 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 250 μL와 세포를 수정. 실온에서 15 분을 품어. 참고 : - 염색 전에 이주 고정 세포를 1 4 ° C에서 PBS에 저장할 수 있습니다. </li><li> 300 μL 0.1 % PBS - 트리톤 100 (PBST)로 세척 웰 X3에 의해 Permeabilize 하시려면 세포. 세척 사이 RT에서 5 분을 품어. 마지막 세척 후 과잉 솔루션을 대기음. </li><li> 10 블록300 μL / 웰의 1 배 범용 블록 버퍼와 RT에서 분. </li><li> (ICC) 염색 버퍼를 준비합니다 버퍼를 차단 1X PBS 및 1X 유니버설의 1 : 1을 추가합니다. ICC 염색 버퍼에 차 항체를 희석하고 4 ℃에서 밤새 항체를 품어. 권장 희석 용 재료 섹션을 참조하십시오. <ol><li> Nppa IPM 및 IAM 식별을위한 마우스 α-티닌, 닭 αGFP, 토끼와 슬라이드의 한 쌍의 얼룩. </li><li> IPM 및 IVM 식별을위한 마우스 α-티닌, 닭 αGFP, 토끼 Myl2으로 슬라이드 한 쌍의 얼룩. </li></ol></li><li> 다음 날, 300 μL 0.1 % PBST로 웰 X3 씻는다. 세척 사이 RT에서 5 분을 품어. 마지막 세척 후 과잉 솔루션을 대기음. </li><li> ICC 염색 버퍼에 차 항체 희석을 준비합니다. 권장 희석 용 재료 섹션을 참조하십시오. 이차 항체를 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간을 품어. <ol><li> 다음 보조 antibodie 모든 슬라이드를 얼룩S : 마우스 알렉사-555, 닭 알렉사-488을, 토끼 알렉사-647. </li></ol></li><li> 300 μL 0.1 % PBST로 웰 X3을 씻으십시오. 세척 사이 RT에서 5 분을 품어. 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 유리 현미경 슬라이드에 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)의 1.5 μg의 / mL로 포함하는 설치 매체의 2.4 μL를 추가합니다. 조심스럽게, 24 웰 플레이트의 우물에서 커버 슬립을 제거 여분의 용액을 제거하고 설치 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 전송할 수 있습니다. 부드럽게 초과 볼륨과 공기를 제거하기 위해 커버 슬립을 누릅니다. </li><li> 선호 매니큐어 또는 플라스틱 밀봉 제와 인감 슬라이드. 상점은 빛으로부터 보호 4 ° C에서 슬라이드를 장착. </li></ol> 공 초점 현미경을 사용하여 심장 서브 타입의 4 확인 주 : 촬상 들어, 공 초점 레이저 주사 현미경은 적어도 2 형광체 (405)에 스펙트럼 감지 가능한 감지기, 488, 555, 및 639 nm의 파장을 구비 IPMS, IAMS 및이 iVMS를 식별하기 위해 필요하다. IMAG플랜 - 고차 색지움 20X / 0.75 목적 또는 더 나은 사용하여 전자 셀. 제조업체의 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 40X 오일 침지 품질의 이미지를 얻을 수 확대 이미지를 스캔. <ol><li> 이미지 라이브러리 : DAPI, 알렉사-488, 알렉사-555, 알렉사-647 채널 8 비트 이미지를 가지고 (CH.). 픽셀을 2 6의 1024 프레임 크기, 라인 단계의 체류 시간, 및 (2)의 평균은 높은 해상도 이미지에 충분하다. </li><li> 각 슬라이드를 들어, 하나의 가장자리에서 시작하고 최대 스캔 시작 α-티닌 + 근절 + 세포의 적색 형광 채널 (CH.)에서 아래 (예 3을 참조하십시오 그림 5A). 근절 줄무늬는 555 nm 파장에서 시각적으로 쉽게 식별 할 수 있습니다. <ol><li> α-티닌 + 근절 + 세포가 확인되면, 녹색 CH 전환. 이 긍정적 인 경우 (IPM)을 메모를 유지합니다. 원적외선 647 채널을 평가하기 위해 컴퓨터로 전환합니다. (IAM 또는 IVM). 참고 : 있습니다 셀α-티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP + / Nppa - / Myl2은 - IPMS로 지정되어 있습니다. GFP 발현 세포 (도 4a)에 걸쳐 알 수있다. </li><li> α-티닌 (마우스 Alexa555), Hcn4-GFP (닭 Alexa488)와 얼룩 슬라이드, Nppa (토끼 Alexa647) 및 DAPI. α-티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP있는 세포 - / Nppa +는 IAM 있습니다. Nppa 염색은 핵 주변 및 점상 (그림 4B)를 나타납니다. </li><li> α-티닌 (마우스 Alexa555)와 얼룩 슬라이드, Hcn4-GFP (닭 Alexa488), Myl2 (토끼 Alexa647). α-티닌에 대한 긍정적 인 세포 + / 근절 + / Hnc4-GFP는 - / Myl2 +이 iVMS 있습니다. Myl2 염색은 근절 필라멘트를 따라 가로 무늬 양식을 전시 할 예정이다. 때문에 염색 및 Z 평면의 품질 변화에 줄무늬가 항상 (그림 4C) 쉽게 표시되지 않을 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 주 : 잠재적으로 재 프로그램 된 MEFs의 실제 수를 평가하기 위해, 24 웰 플레이트의 웰이 실험 웰에 병렬로 시딩하고, 도금 후 하루 수확. 도금 셀의 총 개수는 두 개의 웰을 평균함으로써 결정된다. 이 도금 실제 총 세포 (aTotal)을하게된다. <ol><li> 근절 + <ol><li> 시각적으로 적절한 α-티닌 + / 근절 + (오른쪽 패널 그림 3)과 기록 (그림 5B-1)에 대한 커버 슬립 각 셀을 검사합니다. </li><li> 도금 실제 총 세포 (aTotal)에 의해 각각의 커버 슬립과 분할에 α-티닌 + / 근절 +의 총 수를 집계 (그림 5B-III). aTotal = 12,500 세포 및 100 세포가 α-티닌 된 경우, 예를 들어 + / + 근절 후, 도금 MEFs에 0.8 %가 다시 프로그램되었다. 평균reprograming 실험은 1 % α-티닌은 + / 근절 + 세포 (그림 5C)를 얻을 것입니다. </li></ol></li><li> 하위 유형 + 참고 : 다음 단계는 대표 iCLM 정량 워크 플로우 5B / C 그림을 참조하십시오. 이 중 하위 유형 (그림 5B-1)에 대한 고유 한 경우 간단히, 각 근절 + 셀, 집계. 평균 근절 + X 100 세포 (도 5b-1)를 통해 부속 + 세포의 수를 나누어 % 하위 유형 (도 5b-III)을 계산한다. 절대 %의 하위 효율 (그림 5B-IV)를 계산하려면, 그림에서 하위 유형 + 세포 수를 분할 5B-난 × 100 (그림 5B-II) 시드 세포의 총 수에 의해. <ol><li> 그들은 GFP +, Nppa +, 또는 Myl2있는 경우, α-티닌의 각 + / 근절 + 세포의 경우, 평가 <s&gt; +입니다. </li><li> / Myl2 - -, 티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP - / Nppa +, 및 α-티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP α-티닌 + / 근절 + / Hnc4-GFP + / Nppa의 총 수를 집계 - / Myl2 + 세포 (도 5b-1). </li><li> 각 하위 유형의 비율을 계산하려면, 잘한다는 점에서 + / 근절 + 세포 α-티닌의 총 수에 의해 서브 타입 + 세포의 수를 분할하고 100 GHMT 곱 IPMS, IAMS, 그리고이 iVMS 대략 동일한 비율을 생성한다 (그림 5B-III). </li><li> 아형 + 세포의 절대 수를 계산하기 aTotal하여 실험 조건 아형 + 세포의 총 수를 100 분할하고 (도 5b-II)로 곱한다. 평균 IPMS는 전체 감염 세포 인구의 0.3 %, IAMS 0.3 %를 나타낼과이 iVMS 0.25 % (그림 5B-IV). </li></ol></li></ol>

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본 연구는 심장 전사의 레트로 바이러스 - 매개 발현을 통해 심장 서브 타입의 다양한 세트로 MEFs에의 변환을위한 직접 프로그래밍 전략을 제공하는 Gata4, Mef2c, Tbx5 및 Hand2 (GHMT) 요인. PM 특정 리포터 마우스와 함께 면역 다중화 방식을 사용하여, 우리는 단일 세포 해상도에서 IAM,이 iVMS 및 IPMS를 식별 할 수있다. 이러한 분석은 하위 유형의 다양성과 근절 개발에 대한 개별 전사 인자의 기여를 분리 할 수있는 체외 시스템에서 실험이 가능합니다. 병행하여,이 새로운 전사 인자 또는 특정 혈통 iCLMs쪽으로 치우치게 소분자에 대한 통찰력을 가지고 있었다. 그럼에도 불구하고,이 분석의 성공적인 완료에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 아래에서는 일반적인 iCLM 실험에서 바이러스 역가, 섬유 아세포, 품질 및 이미지 분석의 영향을 다룬다. 우리의 연구에서 우리는 EMP로이의 ecotropic - 레트로 바이러스는 E1...

핵심은 배아 (1), (2)에서 개발 한 최초의 기능 기관이다. 순환계와 함께에서는 산소, 영양분, 개발시의 폐기물 처리 장치에 공급한다. 3 주 후, 수정, 인간 심장 처음 박동 및 적절한 조절은 심근 (CMS)에 의해 유지된다. 이들 특화된 세포의 비가역적인 손실 따라서 진보적 심부전의 기초가되는 기본적인 문제이다. 이러한 제브라 피쉬 제노와 같은 일부 유기체는 심장 재생 잠재력을 가지고 있지만, 성인 포유류 심장 3, 5, 6 개의 제한된다. 따라서, 심장의 중요한 기능을 제공, 심장 질환 혼자 7 미국에서 60 만 명이 사망를 차지, 세계에서 사망의 주요 원인이다 놀라운되지 않습니다. 그만큼효율적으로 복구하거나 손상된 심근을 대체 할 refore, 세포 기반 치료는 큰 임상 적 관심이다. 야마나카 동료 8 정액 연구는 네 개의 전사 인자 강제 발현이 다 능성 줄기 세포로 완전히 분화 된 섬유 아세포를 변환하기에 충분한 것으로 나타났다. 그러나, 모든 다 능성 줄기 세포의 종양 전략 용량은 치료 목적의 사용에 중요한 문제였다. 이것은 능성 단계를 피하면서 다른 방법은 세포를 transdifferentiate하는 검색 할 과학 분야 동기를 부여. 최근, 여러 그룹이 전사의 자궁외 식으로 유도 된 심근 유사 세포 (iCLMs)에 마우스 섬유 아세포의 직접 변환을 표시하여이 전략의 가능성을 보여 주었다 Gata4, Mef2c, Tbx5, 나중에, Hand2 (GMT 및 GHMT 요인 각각) 9,10. 작고에hermore 동일한 전략은 생체 내에서 인간 유래 조직 9, 11, 12에서 수행 될 수있다. 최근 연구에 추가적인 요소 또는 심부전 리 프로그래밍 효율을 13, 14, 15을 향상시키는 변조 될 수있는 신호 전달 경로를 강조하고있다. 함께 찍은, 이러한 연구는 재생 요법에 대한 감독 분화의 가능성을 보여줍니다. 그러나, 방법 론적 차이 16 CM 리 프로그래밍, 미지의 분자 메커니즘 일관성 재현성의 저 효율성 및 iCLMs의 이질적인 성질은 어드레싱 남아있다. 직접 iCLM 얼룩을 평가하기 위해, 우리는 근절 개발 및 심장 계통 specificatio의 식별 이산 견고한 단일 세포 분석 설계N-이 기능 심근의 필요한 특성. 심방 (AM), 심실 (VM)와 조정기 (PM) 17, 18, 19, 20의 위치와 고유의 전기적 특성에 의해 정의되는 심장 CM의 적어도 세 가지의 유형이있다. 조율 된 조합, 그들은 혈액의 적절한 펌핑을 할 수 있습니다. 심장 손상 중에, 하나 또는 모든 아형의 영향을 야기 할 수 있으며 세포 치료의 유형은 경우에 따라 해결해야 할 것이다. 작은 일이 부속 명세서를 조절하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 수행되는 동안 현재 대부분의 전략은 심근 세포의 전체적인 생성에 초점을 맞춘다. 다음 연구는 제대로 잘 조직 된 근섬유 분절을 정량화 및 심근 서브 타입의 다양한 세트를 식별하는 방법을 자세히 설명합니다. 페이스 메이커 (PM) - 특정 기자 마우스를 사용하여, 우리는 난을 적용 할 수 있습니다mmunocytochemical 접근 방식은 유도 심방 같은 근육 세포 (IAM), 유도 심실 같은 근육 세포 (IVM)과 유도 PM-같은 근육 세포 (IPMS) (21)를 구별한다. 우리의 관찰에 기초하여, 전용 근절 조직을 나타내는 세포는 자율 박동 할 수있다. 이 독특한 프로그래밍 플랫폼 역할을 평가하기 위해 허용 단일 셀 해상도 근절 조직, 하위 사양 및 CM의 재 프로그래밍의 효율성의 특정 매개 변수를 설정합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>iCLM 배지, Plat-E 배지, 섬유아세포 및 형질주입 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>11150059 iCLM 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>iCLM 배지, Plat-E 배지, 섬유아세포 및 형질 주입 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td>iCLM 매체</td></tr><tr><td>MEM 비타민 용액</td>의 구성 요소 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>iCLM 매체</td></tr><tr><td>MEM 아미노산</td>의 구성 요소 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>iCLM 매체의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>비필수 아미노산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>iCLM 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>15240062 iCLM 배지</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td>의 구성 요소 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>iCLM 배지</td></tr><tr><td>열 비활성화 호스 세럼</td>의 구성 요소 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>iCLM 배지</td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>iCLM 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>1514022 Plat-E 배지 및 섬유아세포 배지</td></tr><tr><td>Puromycin의 구성 요소&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>Plat-E 매체</td></tr><tr><td>블라스티시딘의 성분&nbsp; &nbsp;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Plat-E 매체 구성 요소</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>섬유아세포 매체</td></tr><tr><td>구성 요소 컨포칼 레이저 스캐닝 LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>컨포칼 분석을 위해</td></tr><tr><td>FuGENE 6 transfection 시약</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfection 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM 감소 세럼 중간</td><td>온도 피셔 사이언티픽</td><td>31985-070</td><td>트랜스펙션 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>밀리포어</td><td>TR-1003-G</td><td>유도 시약. 8 &mu의 최종 농도에서 사용하십시오. M/mL</td></tr><tr><td>Platinium-E (PE) 레트로바이러스 팩긴 세포주, Ecotropic</td><td>CellBiolabs</td><td>RV-101</td><td>레트로바이러스 팩킹 세포주</td></tr><tr><td>트립신 0.25% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>MEFs 및 Plat-E 해리용</td></tr><tr><td>마우스 안티 &알파;-액티닌(클론 EA-53)</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>컨포칼 분석을 위한 항체. 컨포칼 분석을 위해 1:200</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP IgY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td> 항체에서 사용합니다<td>. 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti-NPPA에서 사용&nbsp;</td><td>Abgent</td><td>AP8534A</td><td>컨포칼 분석을 위한 항체. 1:400</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti Myl2 IgG&nbsp에서 사용;</td><td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>컨포칼 분석을 위한 항체. 1:200</td></tr><tr><td>Vectashield 용액에서 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>Dye와 함께 컨포칼 분석을 위한</td></tr><tr><td>사용 Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1.0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>Coverslips for confocal analysis</td></tr><tr><td>100 &mu; m 세포 여과기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 주사기 필터 SFCA 25MM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>바이러스 여과용</td></tr><tr><td>6mL 주사기</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>바이러스 여과용</td></tr><tr><td>염소 치킨 IgY(H& L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>컨포칼 분석을 위한 2차 항체. 1:400</td></tr><tr><td>당나귀 안티-토끼 A647 IgG(H+L)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>컨포칼 분석을 위한 2차 항체. </td></tr><tr>컨포칼 분석을 위해 1:400<td>Goat anti-mouse IgG(H+L) A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>2차 항체에서 사용합니다. 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td>에서 사용 <td>세포 투과화용&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2 및 MgCl2 없는 Dulbecco의 PBS (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Power Block 10x Universal Blocking 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>H2O</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드 수용액(PFA)</td>에 1배로 희석Electro <td>Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>15710</td><td>dH2O</td></tr><tr><td>6 cm&nbsp; 플레이트</td>에 희석된 4%에서 사용 <td>Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 플레이트</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm&nbsp; 조직 배양 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 트리판 블루 용액</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>생존력 용</td></tr><tr><td>에틸 알코올 200 증거</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>Thermo Fisher 과학</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

한 세포 유형을 다른 세포 유형으로 직접 재프로그래밍하는 것은 최근 재생 의학, 질병 모델링 및 계통 사양화를 위한 강력한 패러다임으로 부상했습니다. 특히, Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5(GHMT)에 의해 섬유아세포가 유도된 심근세포 유사 근세포(iCLM)로 전환되는 것은 in vitro 및 in vivo에서 새로운 심장 근세포를 생성하는 중요한 방법을 나타냅니다. 최근의 증거에 따르면 GHMT는 이전에 알려진 것보다 더 다양한 심장 아형을 생성하므로 추가 연구를 수행하기 위한 체계적인 접근의 필요성을 강조합니다. 그러나 직접 재프로그래밍을 치료 전략으로 사용하기 전에, 특정 심장 아형을 생성하기 위해 계통 변환의 기계론적 토대를 자세히 이해해야 합니다. 여기에서는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 GHMT 매개 재프로그래밍에 의해 iCLM을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 
효율적인 재프로그래밍을 달성하기 위해 MEF 분리, 레트로바이러스 생산 및 MEF 감염 방법을 간략하게 설명합니다. 재프로그래밍된 세포의 아형 정체성을 결정하기 위해 정의된 호환 가능한 항체 세트를 사용하여 iCLM에서 면역세포화학을 수행하기 위한 단계별 접근 방식을 자세히 설명합니다. iCLM 및 개별 심방(iAM), 심실(iVM) 및 심박 조율기(iPM) 하위 유형의 컨포칼 현미경 검사, 식별 및 정량화 방법도 제시됩니다. 마지막으로, 프로토타입 직접 재프로그래밍 실험의 대표적인 결과에 대해 논의하고 효율적인 계통 변환을 보장하기 위해 프로토콜의 중요한 기술적 측면을 강조합니다. 종합하면, 당사의 최적화된 프로토콜은 연구자가 개별 CM 하위 유형을 식별해야 하는 의미 있는 심장 재프로그래밍 실험을 수행할 수 있는 단계적 접근 방식을 제공해야 합니다.

PM을 특정 리포터 마우스 활용, 우리는도 1에 도시 된 바와 같은 다양한 내인성 근세포를 식별하기 위해 멀티 플렉스 면역 전략을 개발했다. 도 2에 도시 된 프로그래밍 단계에 따라, 특정 아형의 CM 유도이라도 낮은 속도 빠르면 4 일째 21로 감지 할 수있다. 14 일으로 실험을 중지 할 수 있습니다 및 근절 조직 (그림 3)과 서브 타입 - 사양 (그림 4)에 대한 평가 하였다. 그림 5는 ICC (그림 5 패널 A)에 대한 슬라이드 준비의 워크 플로우 및 iCLM 하위 특정 세포 (그림 / C 5 패널 B)의 정량을 요약 한 것입니다. <p class="jove_content" fo:keep-togeth...

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

본 절차의 전반적인 목표는 다양한 유도 심근세포 하위 유형을 생성하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 근절 조립 및 하위 유형 특이화를 조절하는 데 필요한 신호와 같은, 심장 리프로그래밍 중 하위 유형 특이적 계보 전환에 관한 핵심적이고 기초적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 메커니즘 연구 수행에 필수적인 심근 하위 유형 특이화에 미치는 영향을 정량화할 수 있는 방법을 제공한다는 점입니다.먼저, E 12.5 단계의 배아에서 마우스 배아 섬유아세포를 분리하십시오. 동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 액체 질소에 보관하십시오. 다음으로, plat-E 세포를 회수하여 6-웰 플레이트의 웰당 100만 개의 세포가 도달하도록 분주하여, 24시간 이내에 세포의 합류도가 70~80%에 도달하게 하십시오.세포를 트랜스펙션 배지로 덮고 표준 배양 조건에서 배양합니다. 실험 전날, 15 mL 원추형 폴리스티렌 튜브를 사용하여 반응당 60 µL의 저혈청 배지와 6 µL의 트랜스펙션 시약을 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 반응시킵니다.형질전환 시약의 경우, 형질전환 효율의 감소를 방지하기 위해 시약을 환원 혈청 배지에 직접 첨가하십시오. 다음으로, 반응당 총 2 µg의 GHMT 칵테일을 첨가하고 튜브를 가볍게 쳐서 혼합합니다. 반응물을 상온에서 15분 동안 배양한 후, 혼합물을 plat-E 세포에 방울 단위로 천천히 첨가하십시오.형질전환 날짜와 시간을 기록합니다. 형질전환된 plat-E 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 마우스 배아 섬유아세포를 분주하기 한 시간 전에, 각 웰에 12 millimeter fibronectin 코팅 커버슬립을 먼저 추가하여 면역세포화학 분석용 24웰 플레이트를 준비합니다.다음으로, 각 웰에 300 µL의 소 콜라겐 용액을 넣고 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝날 무렵, 냉동 보관된 HCN4GFP 마우스 배아 섬유아세포 바이알을 해동합니다. 세포를 빠르게 해동하고, 미리 데워둔 섬유아세포 배지로 한 번 세척한 후 살아있는 세포의 농도를 측정합니다.그 후 24-웰 플레이트의 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, 콜라겐과 피브로넥틴이 코팅된 커버슬립 위에 웰당 30,000개의 세포를 즉시 분주합니다. 형질전환 24시간 후, 레트로바이러스 배지를 0.45 µm 공극 크기의 계면활성제 제거 셀룰로오스 아세테이트 필터로 여과하여 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

단세포 표현 프로 파일링 개별 세포의 자세한 유전자 발현 분석을 수 있습니다. 우리는 cardiomyocytes의 격리를 위해 방법을 설명하고, 구체적인 목표의 전체 transcriptome의 microarray 또는 qPCR 중 하나에 대한 결과 lysates를 준비.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

여기에서는 폴리시스트로닉 구조에서 Gata4, Tbx5 및 Mef2c의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 iCM을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 효율성과 품질이 향상된 비교적 균질한 재프로그래밍된 세포 집단을 생성하며 향후 iCM 재프로그래밍에 대한 연구에 유용합니다.

Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

이 프로토콜은 높은 수율, 순도 및 생존력을 가진 성체 마우스 심근세포의 재현 가능한 분리 및 장기 배양을 위한 단계별 방법을 설명합니다.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

심근세포의 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 심근세포 핵의 명확한 식별을 위한 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스와 세포 분열과 세포주기 변이를 구별하기 위한 CAG-eGFP-아닐린 마우스의 두 가지 형질전환 마우스 라인을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

우리는 여기에 설명, Tg의 설립 및 응용 프로그램 (Myh6-cre)1Jmk / J /Gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)(CAG-GCaMP3)(αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 아래라고함) 심장 재프로그래밍 평가를 위한 마우스 리포터 라인. 마우스 균주로부터 분리된 신생아 심장 섬유아세포(NCFs)는 유도된 심근세포(iCM)로 변환되어 칼슘(Ca2+) 플럭스를 통해 iCM의 재프로그래밍 효율과 기능성 성숙을 편리하고 효율적으로 평가할 수 있습니다.

GCaMP3 리포터와 심장 특정 칼슘 플럭스를 측정하여 심장 재프로그래밍의 체외 평가

배우세요 마우스 배아 섬유아세포를 GHMT 전사인자로 재프로그래밍하여 심근 세포로 전환하는 방법입니다. 면역세포화학법과 공초점현미경을 활용해 심방, 심실, 박동조절 세포 등 다양한 심근 서브타입을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

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