심장 약물 안전 검사를위한 인간 공학 심장 조직의 자동 수축 분석

이 기술의 전반적인 목표는 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위한 인비트로(in vitro) 수축 분석 플랫폼으로 활용 가능한 3차원 공학적 심장 조직을 생성하는 것입니다. 이 방법은 질병 모델링, 안전성 약리학, 그리고 유전자 변이 또는 약물이 수축력에 미치는 영향과 같이 심장 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무균 상태에서 다양한 종의 공학적 심장 조직으로부터 장기간 동안 수축력을 측정할 수 있다는 점입니다.

이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 세포 품질의 저하나 배지 내 성분의 부족으로 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 셀 준비 과정을 최적화하고 반복적인 사이클을 피하는 것이 중요합니다. 본 절차의 시연은 Anika Benzin과 Umber Saleem이 진행하겠습니다.

절차를 시작하기 전, 24-웰 플레이트의 첫 번째 보조 웰에 2% 따뜻한 아가로스 1.6 milliliters를 넣습니다. 그리고 즉시 아가로스에 폴리테트라플루오로에틸렌 스페이서를 배치합니다. 실온에서 약 10분 후, 아가로스가 불투명해지면 고형화되었음을 의미합니다.

스페이서를 제거하고 PDMS 랙을 캐스팅에 배치하여 랙 포스트 쌍이 각 아가로스 몰드 내부로 들어가게 합니다. 모든 랙을 배치한 후, 최소 1.5 × 10⁷ cells/mL 농도의 배지 내 심근세포와 갓 조제한 피브리노겐 재구성 혼합물을 세롤로지컬 피펫으로 10~15회 현탁하여 피브리노겐 응집물이 용해될 때까지 섞습니다. 피펫 내의 재구성 혼합물이 균질한지 확인하십시오.

그 다음, 각 공학적 심장 조직(engineered heart tissue, EHT)에 대해 200 µL 튜브에 재구성 혼합물 100 µL와 thrombin 3 µL를 혼합합니다. 그리고 이 EHT thrombin 혼합물 100 µL를 즉시 아가로스 슬롯에 분주합니다. 각 EHT마다 새로운 필터 팁을 사용하십시오.

모든 슬롯에 재구성 혼합액을 채운 후, 세포 배양 접시의 뚜껑을 닫고 37 °C, 7% CO₂ 조건에서 2시간 동안 준비물을 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 멸균 후드 안에 넣고 각 웰에 200~500 µL의 배지를 덮어줍니다. 플레이트를 부드럽게 흔든 다음 EHT를 다시 인큐베이터로 옮깁니다.

10분 후, 랙을 웰당 1.5 milliliters의 EHT 배지가 담긴 새로운 24 웰 플레이트로 조심스럽게 옮기고, 해당 플레이트를 적절한 배양 조건의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. PDMS 랙을 신선한 배지가 담긴 두 번째 플레이트로 옮겨 매주 월요일, 수요일, 금요일에 EHT에 배지를 공급합니다. 캐스팅 후 7~10일이 지나면 EHT는 PDMS 랙의 포스트를 굴절시키는 자발적 수축을 보여야 합니다.

EHT의 수축을 분석하기 위해, 실험 당일 측정 2시간 전에 EHT 분석 장치의 가열 장치를 켭니다. 분석 직전에 축 시스템의 가스 및 전자 공급 장치를 켭니다. 기저선 기록을 위해 EHT 플레이트를 EHT 분석 장치에 넣고 제조업체의 지침에 따라 수축 분석 소프트웨어를 시작합니다.

소프트웨어 매뉴얼의 지침에 따라 새로운 런(run)을 시작하려면, 프로토콜 탭을 클릭하여 관련 연구 정보를 입력하십시오. 설정 탭을 열고 분석할 웰을 선택하십시오. 시간 관계상, 본 영상에서는 두 개의 EHT에 대해서만 이를 시연합니다.

그런 다음 카메라 뷰 탭을 클릭하고 자동 형상 감지 모드로 카메라 라이브 모드를 시작합니다. 24웰 플레이트에서 선택한 각 웰에 대해 xyz 좌표를 이용해 카메라 위치를 조정하며, 각 EHT가 창의 중앙에 위치하고 초점이 맞는지 확인합니다. 파란색 십자 표시가 EHT의 상단과 하단 끝에 위치하며 EHT의 수축에 맞춰 이동하는지 확인하십시오.

그런 다음 위치 확인 버튼을 눌러 각 웰의 설정 위치를 저장하십시오. 이제 매개변수 탭을 클릭하여 소프트웨어가 수축 피크를 식별하는 기준을 정의하면 피크가 녹색 사각형으로 표시됩니다. 모든 웰에 매개변수 적용 버튼을 눌러 입력한 모든 설정을 저장하십시오.

그다음 자동(automatic) 탭과 시작 버튼을 클릭하여 기초 EHT 수축을 기록하고 각 EHT의 자발적 기초 수축력을 계산합니다. 실시간 수축 분석 결과는 실시간(real time) 탭에 표시됩니다. 파란색 십자 표시가 EHT의 수축에 맞춰 수직으로만 움직이는지 확인하십시오.

특정 약물이 수축에 미치는 영향을 분석하려면, 먼저 단백질이 없는 갑상선 용액(protein free thyroid solution)이 채워진 24웰 플레이트를 무균 후드로 옮긴 후 웰에 탄소 전극을 배치합니다. PDMS 랙에 담긴 EHT를 전극 위에 옮기고 EHT를 다시 배양기로 되돌립니다. 약 30분 후, EHT를 EHT 분석 장치의 인터락에 넣고 EHT당 20초 동안 자발적인 기저 수축력을 기록합니다.

다음으로, 탄소 전극을 페이싱 케이블에 연결하고 EHT를 전기적으로 자극하기 시작합니다. 모든 EHT가 적절하게 페이싱되고 있는지 확인하면서, EHT당 10초 동안 페이싱된 기저선을 기록합니다. 페이싱 신호는 이제 파란색 수직선으로 표시되며, 각 피크 이전의 수축 그래프에 포함되어 있습니다.

기초선 기록이 끝나면, 전극과 PDMS 랙을 첫 번째 약물 농도가 포함된 새로운 24-웰 플레이트로 옮기고, EHT를 즉시 EHT 분석 기기의 인터락으로 되돌려 20분 동안 배양합니다. 페이싱 케이블을 다시 연결하고, 형상 인식을 조정한 후 첫 번째 약물 농도에 반응하는 EHT 수축을 기록합니다. 모든 약물 농도 테스트가 완료되면, 결과로 생성된 모든 PDF 기록을 저장하고 각 기록의 형상 인식과 수축 피크 사각형 및 아티팩트의 위치가 정확한지 확인합니다.

오프라인 분석을 위해, 분석 데이터베이스에서 해당 분석 회차의 'select run'을 클릭하고, 파라미터 탭에서 수축 분석 파라미터를 변경하십시오. 그런 다음 오프라인 탭에서 'offline analysis'를 선택하여 비디오를 재분석하십시오. 형상 인식 기능을 조정하고 새로운 비디오 파일을 기록하십시오.

실시간 탭에서 도형 인식을 조정한 후 샘플 검토를 선택하십시오. 이제 새로운 위치에 따라 EHT가 분석됩니다. 각 EHT의 분석은 조직의 상단과 하단 끝의 도형 인식을 기반으로 합니다.

촬영된 EHT 수축 영상은 EHT 분석 기기의 소프트웨어 알고리즘에 의해 자동으로 분석되며, 미리 정의된 관련 기준에 따라 피크가 결정됩니다. EHT 수축 분석의 장기 측정 결과, 최대 20시간 동안 수축력, 박동 빈도, T1 수축 또는 T2 이완 시간에서 뚜렷한 시간 의존적 변화가 나타나지 않았습니다. 이는 해당 구조물의 안정성이 매우 높음을 나타냅니다.

실제로, 각 신호 EHT에 대한 결과는 낮은 가변성으로 재현 가능합니다. 그러나 hERG 채널 차단제에 노출되면 해당 농도부터 T2 이완 시간이 유의미하게 연장되기 시작하며, 더 높은 농도에서는 불규칙한 박동 패턴이 나타납니다.

적절한 준비 과정을 거쳐 숙달되면, 30분 이내에 24개의 EHT를 생성할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 질환 모델링 분야의 연구자들은 인비트로(in vitro)에서 유전자 변이의 영향을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 모델의 다재다능함 덕분에 인간 유도만능줄기세포 또는 게놈 편집 기술과 결합하여 사용할 수 있습니다.

이 절차에 이어, 조직학 또는 RNA 및 단백질 분석과 같은 추가적인 방법을 사용하여 유전자 전사와 발현에 관한 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 EHT를 제작하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 절차와 관련하여 문의 사항이 있으시면 언제든지 저희에게 직접 연락해 주시기 바랍니다.