Name: 긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 배우세요 흰가루병 단상포자에서 고분자량 게놈 DNA를 분리하여 긴 읽기 시퀀싱을 수행하는 방법을. 이 기술은 복잡한 진균 게놈 구조 연구와 식물 병원성 메커니즘 이해에 필수적입니다.

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이 프로토콜은 Joint Genome Institute-Community Sequencing Project(#1657)를 지원하기 위해 개발되었습니다. 이 연구는 Philomathia Foundation, National Science Foundation (#0929226) 및 Energy Biosciences Institute to S. Somerville의 일부 지원을 받았습니다. 스위스 국립 과학 재단 (# 310030_163260)에서 B. Keller에게. 여기에 설명된 프로토콜을 개발할 때 관대한 조언과 자발적인 프로토콜에 대해 M. Figureroa와 M. Miller(미네소타 대학교), R. Panstruga(RWTH Aachen University), C. Pedersen(코펜하겐 대학교), P. Spanu(임페리얼 칼리지), J. Taneja(캘리포니아 버클리 대학교), M. Wildermuth(캘리포니아 버클리 대학교), R. Wise(아이오와 주립 대학교) 및 S. Xiao(메릴랜드 대학교)에게 관대한 조언과 자발적인 조언에 감사드립니다.

곰팡이 재료 1. 준비 <ol><li> 흰가루병 성장 <ol><li> 다음의 조건으로 성장 챔버에 식물을 성장 : 22 ° C 일 온도 20 ℃ 밤 온도, 80 % 상대 습도, 14 시간 낮 길이 125 μE / m 2 / s의 광 강도 (형광등에 의해 제공된 ). </li><li> 18, 29 설명 Golovinomyces cichoracearum 변형 UCSC1 오이 식물 (쿠쿠 미스 사티의 다양한 부시 챔피언) 감염. </li></ol></li><li> 수확 흰가루병 분생 포자 <ol><li> 생포 축적 된 인 - 라인 필터 (11 μm의)와 작은 진공을 이용하여 접종 10 일 - 7에 감염된 식물을 수확 분생. 부드러운 압력을 적용, 분생 포자를 수집하는 잎의 표면을 따라 진공 노즐을 실행합니다. 참고 : G.의 cichoracearum의 평균 수익률은 크게 infe에서 분생 포자의 20 밀리그램이다면적이 약 130cm 2 cted 오이 잎. </li><li> 깨끗한 종이 상에 필터로부터 (7-8 감염된 오이 잎으로부터 약 375 μL 부피 또는 분생) 분생 포자 약 150 mg의 브러시. 여기에서, (액체 질소)에서 미리 냉각 두 32분의 5 인치 직경의 스틸 밀링 볼 2 mL의 크리오 바이알 (cryovial)의 분생 포자로 옮긴다. 즉시 액체 질소로 튜브를 반환한다. -80 ° C에서 보관 튜브. </li></ol></li><li> 볼 밀링에 의해 속보 열기 분생 포자 <ol><li> 플래시를 액체 질소 중에서 볼밀 알루미늄 판을 고정. 로드는 볼 밀 랙에 크리오 바이알 (cryovial). 격렬 (실온) 30 회 / 초에서 30 초 동안 볼 밀에서 분생 스틸 볼과 크리오 바이알 (cryovial)을 흔들어. 즉시 액체 질소에서 재 냉동을 크리오 바이알 (cryovial). 참고 : 처음에, 연마하는 동안 세포 벽 파열의 효율을 100 배 배율에서 현미경으로 분생 포자의 샘플을 액세스 할 수 있습니다. 30 회 / 초, B 30의 2 라운드 - 필요한 경우, 추가로 1 갈기유타는 최소로 라운드의 수를 유지한다. 최적의 조건이 성립 된 후,이 단계에서 현미경으로 포자 파손 평가 루틴은 불필요하다. </li></ol></li></ol> 2. 게놈 DNA 정제 <ol><li> 분생 포자 용해 <ol><li> 빨리 작업, 해동 분생 포자를 방지 자석 크리오 바이알 (cryovial)에서 강구를 제거합니다. 슬러리가 형성 될 때까지 10 초 - 65 μL 700 ° C의 용해 완충액 (표 1) 및 선회 (5)를 추가한다. </li><li> 300 μL (65 °의 C) 예열 된 5 % (v / v)의 sarcosyl 추가 부드럽게 섞어 다섯 번 (3 초 당 1 개 반전) 반전. 65 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션 튜브; 10, 20, 30 분에서 3 시간 온화하게 반전. 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여, 새로운 2 ML의 마이크로 원심 튜브에 전 용액을 옮긴다. 이후의 모든 단계에서, 부드럽게, 천천히 반전에 의해 혼합 넓은 구멍 피펫 팁으로 DNA 함유 솔루션을 전송합니다. </li></ol></li><li> DNA 추출 I <ol><li> 클로로의 1 볼륨을 추가성상 : 이소 아밀 알코올 : 부드럽게 용해 용액 (24 1 V / V)과 5 회 혼합 바꾸. 부드럽게 배양의 끝에서 다시 중간 지점에서 다섯 번을 혼합하는 반전, 실온에서 10 분 동안 품어. 14,000 × g에서 15 분 동안 실온에서 원심 분리기. 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 조심스럽게 새로운 2 ML의 마이크로 원심 튜브에 수성층을 전송; 계면으로부터 재료를 포함하는 피. </li></ol></li><li> DNA 강수량 I <ol><li> 1 볼륨 실온 100 % 이소프로판올 (약 750 μL)을 추가하고 부드럽게 여섯 번 섞어 반전. 14,000 × g에서 15 분 동안 실온에서 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 폐기합니다. </li><li> 450 μL 사전 냉장 (-20 ° C) 70 % 에탄올을 추가합니다. 14,000 × g으로 실온에서 5 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 폐기합니다. 조심스럽게 미세 피펫 팁으로 뜨는을 제거하고 폐기, 3 초 동안 1,000 XG에서 원심 분리기. 15 분 A의 펠릿을 공기 - 건조t 실온. 15 분 이상 건조하지 마십시오. </li><li> 300 μL TE의 펠릿 (10 mM 트리스 - (CL), 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 pH 8.0)에 재현 탁. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션. 부드럽게 솔루션에 가지 않았다 잔여 물질을 재 부유 버려. </li></ol></li><li> , RNA 오염 제거 10 μL의 RNase A (10 ㎎ / ㎖)을 첨가한다. 부드럽게 세 번을 섞어 반전. 3 초 동안 1,000 XG에서 원심 분리기. 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> DNA 추출 II <ol><li> 300 μL를 페놀 추가 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1 v / v)로 부드럽게 다섯 번을 섞어 반전. 부드럽게 배양의 끝에서 다시 중간 마크에서 다섯 번을 혼합하는 반전, 실온에서 10 분을 품어. 14,000 × g으로 실온에서 15 분간 원심 분리기. 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여, 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상기 상층 액을 전송. </li></ol></li><li> DNA 강수량 II <ol><li> 0.01 부피 3 M 아세트산 나트륨 pH를 5.2 (approximatel 추가Y 3 μL), 부드럽게 다섯 번을 섞어 반전. 2.5 볼륨 사전 냉장 (-20 ° C) 100 % 에탄올 (약 750 μL)를 추가합니다. 부드럽게 다섯 번을 섞어 반전. -20 ℃에서 하룻밤 품어 </li><li> 원심 분리기에서 14,000 × g에서 4 ℃에서 30 분. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 폐기합니다. </li><li> 450 μL 사전 냉장 (-20 ° C) 70 % 에탄올을 추가합니다. 14,000 × g에서 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 폐기합니다. 3 초 동안 1,000 XG에서 원심 분리기. 조심스럽게 미세 피펫 팁 및 폐기에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 실온에서 30-60 분 동안 펠렛을 공기 - 건조. 27.5 μL TE의 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션. 부드럽게 솔루션에 가지 않았다 잔여 물질을 재 부유 버려. </li><li> 분취 품질 관리 시험 22.5 μL TE (최종 부피 25 μL)에 2.5 μL (아래 참조). 시퀀싱을 위해 제출 될 때까지 4 ℃에서 저장 DNA 샘플. 장기 보관, 저장 샘플의 경우및 -80 ° C에서 전단을 방지하기 위해 동결 - 해동 사이클을 최소화 할 수 있습니다. 참고 : 제대로 피펫 어려울 수있다 고 분자량 게놈 DNA로이 단계에서 피펫 팅 할 때주의하십시오, &quot;QC 나누어은&quot;게놈 DNA 샘플의 정확한 표현인지 확인하는 것이 중요하다. </li></ol></li></ol> 3. 품질 관리 <ol><li> 샘플 순도 <ol><li> TE에 빈을 사용하여, 작은 볼륨 분광 광도계에 QC 나누어지는 1 μL를로드하여 DNA의 샘플 순도를 평가합니다. 기록 A260 / A280 및 A260 / A230 수치. 순수한 DNA는 1.8과 2.2 사이에 약 1.8 A260 / A230의 비율 A260 / A280 비율을 가질 것이다. </li></ol></li><li> 게놈 DNA의 정량화 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 상업 이중 가닥 DNA 정량 분석 ​​키트를 사용하여 품질 관리 나누어의 정량화를 수행합니다. </li></ol></li><li> DNA 품질 평가 I <ol><li> 부하 약 60 ng의 게놈 DNA 및1X TAE (40 개 mM 트리스, 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA, pH를 8.0)에 0.7 % 아가 로즈 겔상에서 DNA 사다리. 70 V 40 겔 실행 장치 - 게놈 DNA 밴드까지 45 분 정도 사다리에서 잘 분리 대역에서 2cm이다 명백하다. 이러한 조건은 가능한 겔 전기 영동 장치에 기초하여 조절 될 필요가있다. </li></ol></li><li> DNA 품질 평가 II <ol><li> 부하는 약 60 0.5X의 TBE (44.5 mM 트리스, 445 mM의 붕산, 1 mM의 EDTA, pH를 8.3) 및 1 % 아가 로스 겔상에서 게놈 DNA 및 (펄스 필드 겔 전기 이동에 적합) 고 분자량 DNA 사다리 겨 16 시간 동안 80 KBP 파형 펄스 필드 겔 전기 프로토콜 - 5을 사용하여 0.5X TBE를 실행하는 버퍼에서 실행. </li></ol></li><li> 세균, 곰팡이 및 공장 오염 물질의 평가 <ol><li> 프라이머 및 증폭 조건을 이용리스트 리보솜 유전자의 적절한 전사 내부 스페이서 (ITS) 영역을 증폭하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행표 2에 에드. 겔에서 얻어진 반응 하중 10 μL. 참고 : ITS 지역 ITS 프라이머 곰팡이로 증폭해야 흰가루병을 나타내는 밴드. 이 앰플 리콘 및 세균 또는 식물 프라이머로부터 생성 된 앰플 리콘 DNA는 오염의 근원을 결정하기 위해 서열화한다. 만 흰가루병은 ITS 시퀀스는 곰팡이의 증폭에서 찾을 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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가지 의무적 biotrophic 흰가루병 균 순수한 고 분자량의 게놈 DNA를 얻기 위해, 전술 한 방법의 변형 된 버전 (30)를 개발 하였다. 이 최적의 프로토콜을 이용하여 평균 수율은 150 mg의 분생 당 7 μg의 DNA를, 종래의 프로토콜로 얻어진 수율의 두배이다. 또한, 평균 크기는 48.5 KBP에 걸쳐 약 20 KBP에서 증가했다. 이 프로토콜은 cucumber- G.의 cichoracearum 시스템에 최적화되었다. biotrophic 곰팡이를 다른 흰가루병에서 최고의 품질과 높은 순도의 DNA를 얻거나 의무를하기 위해이 프로토콜의 추가 수정이 필요할 수 있습니다. 추가 수정이 요구 될 수 있지만 나중에,이 프로토콜은, 다른 가지 의무적 biotrophic 곰팡이로부터 판독 긴 DNA 서열에 대한 고 분자량의 DNA가 적절한 획득하는데 사용될 수있다. 우려가 높은 수율 DNA 추출 DNA의 높은 분자...

<html> 흰가루병은 가지 의무적 biotrophic 곰팡이 식물의 그룹이 함께 할 때, 식물 병 전 세계적으로 하나의 가장 큰 원인, 즉 병원균이다. 분류 학적으로 가족 Erisyphaceae 2에서 다섯 개 종족으로 분류 된 흰가루병의 900 설명 종있다. 경제적 중요성과 그들의 호스트와 개발 친밀한 관계를 모두 인해, 흰가루병 질환&gt; 100 년 연구의 대상이되어왔다. 감염시, 흰가루병이 병원균 혜택을, 세포의 구조, 신진 대사와 그 호스트의 분자 생물학의 급격한 변화를 유도. 그러나, 흰가루병의 연구는 그들의 가지 의무적 라이프 스타일, 그리고 순수 문화에 곰팡이의 성장은 아직 5, 4, 3에 설명되지 않은에 특히 도전,&quot;외부 참조&quot;&gt; 6, 7, 8. 과도 변환이 어떤 종 9, 10에보고되었지만 흰가루병의 신뢰성, 안정적인 유전자 변형은 아직 완성되지 않았습니다. 흰가루병 게놈의 염기 서열 및 조립으로 인해 게놈 자체의 기능들이 어려운 입증했다. 다른 진균 유전체로 - (180 MBP 120) 기준으로 60 구성 - 흰가루병 게놈이 크고 90 % 고르게 분포 반복 소자 (11). 이러한 요소는 비 긴 말단 반복뿐만 아니라 분류 중복 요소를 포함한다. 하나의 흰가루병 종, Blumeria 그라 미니 f를 두 formae SPECIALES. SP. hordei 및 F. SP. 소맥 (년 Bgh 각각 BGT)뿐만 아니라 포도 흰가루병에 에리시 페 necator, 꿀벌이N 서열, 및 다른 여러위한 초안 게놈은 12, 13, 14을 완성 하였다. 게놈의 반복적 인 특성은 조립 어렵게 있으며, 완성 된 게놈 년 Bgh 2의 L50 메가 12 6,989 supercontigs로 조립 하였다. 큰 게놈에도 불구하고, 흰가루병은 각각 년 Bgh 및 BGT 예측 5845 개 및 6540 유전자, 단백질 코딩 유전자의 수가 적은 것으로 보인다. 시퀀싱 흰가루병은 생존 11, 12, 13, 14 그들의 숙주 식물에 진균의 의존성과 일치 다른 진균류에 필수적인 최소한 99 핵심 유전자 결여 보인다. 텔로미어, 중심절 리보솜 RN 근처 반복 서열유전자 배열과 전이 될 풍부한 영역이 제대로 짧은 판독 시퀀싱 전략 조립 및 언더 표현 게놈 어셈블리 (15)에 종종있다. 이러한 영역은 게놈 서열에서 발생하는 공극의 많은 책임을 생각하고, 이것이 반복 요소 (16)의 그 광범위한 팽창으로 흰가루병에 적용된다. 높은 플라스틱 게놈 영역은 종종 반복적 인 지역 3에서 발견된다. 이들은 염색체 재 배열 사이트로서 기능하고 종종 이펙터 단백질을 코딩하는 유전자 및 이차 대사 효소를 코딩하는 유전자와 같은 강력한 선택 압력하에 유전자를 인코딩한다. 단일 분자 긴 읽기 시퀀싱 기술의 발전은 유전체 (15)의 반복적 인 지역에 걸쳐 순서에 대한 잠재적 인 솔루션을 제공합니다. 예를 들어, Faino 등. (2015)을 포함하여 긴 시퀀스 기술과 광 m 읽어 발견apping 유전자 주석 유전자 주석의 수를 증가 (및 일부의 수를 감소 시키거나 누락 게놈의 반복 DNA 서열의 비율 배로 그들을 곰팡이 병원균 Verticillium 달리아 두 균주 갭리스 게놈 시퀀스를 생성하도록 허용 ) 및 계시 게놈 17 재구성. 최소 크기&gt; 20 KBP 이러한 긴 읽기 시퀀싱 기술, 고품질의 게놈 DNA의 높은 농도를 사용하려면 필요하다. 여기에서 우리는 분생 포자로부터 포자 수집, 고 분자량의 DNA의 정제를위한 우리의 방법을 설명하고 흰가루병 종 Golovinomyces cichoracearum를 사용하여 우리의 품질 관리 평가는 오이 (18)에 성장. 이 프로토콜은 켈러 B. 실험 그룹 (쮜리히 대학, 스위스 취리히) (13), (19)에서 개발 된 프로토콜에 기초증가 DNA 수율 주도 여러 변형 및 크기의 DNA&gt; 48.5 KBP의 높은 비율을 포함한다. 이 프로토콜은 또한 연구소 20, 21, 22 에너지 공동 게놈의 미국학과의 추천에 따라 품질 관리 단계를 포함한다. 용해 완충액에 포함 된 각 시약 및 각 정제 단계에 근거하는 기능 등 (2008) 23 헨리에 기재되어있다. 식물과 미생물 조직에서 고 분자량 게놈 DNA의 분리에 사용할 수 게시 된 프로토콜은 또한이 프로토콜 24, 25, 26, 27, 28의 설계시 협의했다.

<table><tbody><tr><td>MM400 볼 밀</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>또는 동등한 볼 밀</td></tr><tr><td>2 mL 튜브 볼 밀</td>링 <td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>5/32" 스테인리스 스틸 밀링 볼</td><td>OPS 진단</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>마이크로프로세서 제어 280 시리즈 수조 사전 설정 65°deg; 씨&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>또는 동등한 수조</td></tr><tr><td>마이크로프로세서 제어 280 시리즈 수조 사전 설정 37 &deg; C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>또는 동등한 수조</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R 냉장 마이크로 원심분리기</td><td>Krakeler Scientific&nbsp;</td><td>38-022621807</td><td>또는 동등한 마이크로 원심분리기</td></tr><tr><td>클로르포름:IAA (24:1 v/v)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0549</td><td>피부 접촉 또는 흡입 시 위험함. 니트릴 장갑, 보호 안경, 실험실 가운을 착용하고 화학 후드에서 작업</td></tr>하십시오 <tr><td>페놀 : 클로로포름 : IAA (25 : 24 : 1 v / v)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>피부 접촉 또는 흡입시 위험합니다. 니트릴 장갑, 보호 안경, 실험실 코트를 착용하고 화학 후드에서 작업</td></tr>하십시오<tr><td>. 100% 이소프로판올</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>W292907</tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>34923</td><td>-20으로 냉각 > C 사전 사용</td></tr><tr><td>나트륨 아세테이</td><td>트 시그마-알드리치&nbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnase, Dnase-free (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>포타슘 메타중아황산염</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 라우릴 사크로이네이</td><td>트 시그마-알드리치&nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td>10708976001</tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex by Honeywell, Futura 고글, S345C, Uvextreme</td><td>스테이플</td><td>423263</td><td>또는 동급 안경</td></tr>, <tr><td>High Five COBALT 니트릴 장갑, LARGE</td><td>, Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>또는 동급 장갑</td></tr><tr><td>GelRed 핵산 젤 염색 10,000x in water</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>피부 접촉의 경우 위험합니다. 니트릴 장갑과 보호 안경을 착용</td></tr>하십시오 <tr><td>Agarose Ultrapure Bioreagent</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb CHEF DNA 크기 표준</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>또는 이에 상응하는 펄스필드 젤 아파라투스</td></tr><tr><td>Whatman 품질 여과지, 1등급</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>WHA1001042</td><td>또는 이와 동등한 성장 챔버</td></tr><tr><td>Percival Growth Chamber</td><td>Percival</td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 UV-Vis 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>또는 동등한 분광 광도계</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>사용 전에 물로 1/50을 희석하십시오 (1x)</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA, 10x 용액 (전기영동)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>사용 전에 물로 1/10을 희석하십시오 (to 1x)</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td>액체 질소 (-196 &deg; C)는 동결 위험입니다. 또한 따뜻해지면 빠르게 팽창하므로 단단히 밀폐된 용기에 보관해서는 안 됩니다</td></tr></tbody></table>

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 dna의 정제

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

분체 곰팡이 곰팡이는 경제적으로 중요한 곰팡이 식물 병원균의 그룹입니다. 상대적으로 작은 인해 잘 발달 된 유전자와 게놈 자원의 부족 부분에 분자 생물학 및 병원체의 유전에 대한 알려져있다. 이 생물의 게놈 시퀀싱 및 조립 엄청나게 어려운 만든 대형, 반복적 인 게놈을 가지고있다. 여기서는 하나의 흰가루병 종 Golovinomyces cichoracearum에서 고 분자량의 게놈 DNA의 수집, 추출, 정제 및 품질 관리에 대한 평가 방법을 설명한다. 기술 된 프로토콜은 최적화 된 페놀 / 클로로포름 게놈 DNA를 추출하여 포자의 기계적 파괴를 포함한다. 전형적인 수율은 150 mg을 분생 당 7 μg의 DNA에 있었다. 이 절차를 이용하여 분리 된 게놈 DNA는 긴 판독 순서 (즉,&gt; 48.5 KBP)에 적합하다. 품질 관리 대책이 게놈 DNA의 크기, 수율 및 순도를 보장하기 위해 또한이 방법에 기재된. 여기에 설명 된 품질의 게놈 DNA의 염기 서열은 조립 및 차례로 더 나은 이해로 이어질 것입니다 여러 흰가루병 유전체의 비교를이 농업 병원균의 제어를 개선합니다.

G.로부터 정제 된 게놈 DNA를 60ng의 대표적인 예는 겔 전기 영동을 사용하여 아가로 오스 겔상에서 실행 cichoracearum 및 펄스 필드 겔 전기 영동을 사용하는 각각도 1 및도 2에 나타낸다. 소폭 통과하고 품질 관리를 실패 패스 게놈 DNA 제제를 나타낸다. 완벽한 품질 관리를 통과 게놈 DNA의 준비는 긴 읽기 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 시퀀싱에 이상적입니다. 가장자리 품질 제어를 전달 제제는 허용하지만, 충분히 전달 제제가 바람직하다. 품질 관리 실패 준비는 긴 읽기 게놈 시퀀싱 방법에 대한 허용되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55463/55463fig1.jpg" /...

여기에 설명된 방법은 장기 판독 게놈 염기서열 분석에 사용하기 위해 절대 생물영양 진균 병원균인 흰가루병에서 게놈 DNA를 추출, 정제 및 품질 관리하는 방법입니다.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 롱리드 게놈 시퀀싱을 위해 흰가루병균 반수체 분생포자로부터 고분자량 게놈 DNA를 분리하는 것입니다. 이 방법은 연구하기 어려운 게놈의 구조 및 구성과 같이 식물 병원성 곰팡이 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다루기 까다로운 병원균으로부터 고품질의 게놈 DNA를 추출할 수 있다는 점입니다.실험을 시작하려면, 자석을 사용하여 분생포자 cryovial에서 강철 구슬을 빠르게 제거합니다. 65 °C의 용해 버퍼 700 µL를 첨가하고 용액을 5~10초 동안 볼텍싱합니다. 5~10초 후면 슬러리가 형성됩니다.65°C로 예열된 5% (v/v) sarkosyl 300 µL를 첨가하고 조심스럽게 5회 반전 혼합합니다. 튜브를 65°C에서 30분 동안 배양합니다. 와이드 보어 파이펫 팁을 사용하여 용액 전체를 새로운 2 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.용해액에 클로로포름 이소아밀 알코올을 동일한 부피로 첨가하고, 튜브를 조심스럽게 5회 뒤집어 섞습니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 시간이 절반 정도 지났을 때와 배양이 끝났을 때, 각각 튜브를 조심스럽게 5회 뒤집어 섞어 줍니다.다음으로, 실온에서 15분 동안 원심분리합니다. 광구 파이펫 팁(wide bore pipette tip)을 사용하여 수층을 새로운 2 mL 마이크로원심분리 튜브로 조심스럽게 옮기되, 계면의 물질이 포함되지 않도록 주의합니다. 실온의 100% isopropanol 750 µL를 첨가하고 튜브를 부드럽게 6회 반전시킵니다.그 다음 혼합물을 실온에서 15분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 미리 냉각시킨 70% ethanol 450 µL를 첨가합니다.혼합물을 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 1000 ×g에서 3초 동안 원심분리합니다.미세 피펫 팁을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 상온에서 15분 동안 펠렛을 공기 건조합니다. 300 µL의 TE에 펠렛을 재현탁합니다. DNA를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 용해되지 않은 DNA를 다시 현탁시키기 위해 가볍게 팅크(flick)합니다. RNA 오염을 제거하기 위해 10 µL의 RNase를 첨가합니다. 튜브를 세 번 가볍게 뒤집어 섞은 후, DNA를 1000 ×g에서 3초 동안 원심분리합니다.그 후 DNA를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 300 µL의 phenol chloroform isoamyl alcohol을 첨가하고 튜브를 천천히 5회 반전시켜 혼합한 뒤, 상온에서 10분 동안 DNA를 배양합니다. 배양 시간이 절반 정도 지났을 때와 배양이 끝났을 때 튜브를 천천히 5회 반전시켜 DNA를 혼합합니다.다음으로 상온에서 15분 동안 튜브를 원심분리합니다. 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 상층액을 새로운 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3 molar sodium acetate pH 5.2를 3 µL 첨가한 후 튜브를 부드럽게 5회 반전시킵니다.미리 냉각한 100% ethanol 750 µL를 첨가하고 튜브를 다섯 번 천천히 뒤집어 섞습니다. 혼합물을 20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 튜브를 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다.상청액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 미리 냉각한 70% ethanol 450 µL를 첨가합니다. 그런 다음 4 °C에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.DNA를 펠렛화한 후, 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 튜브를 1000 ×g에서 3초 동안 다시 원심분리하여 잔류 상층액을 가라앉힙니다. 미세 팁 피펫을 사용하여 잔류 상층액을 제거합니다.상온에서 30분에서 60분 동안 펠렛을 공기 건조하십시오. 공기 건조 후, 27.5 µL의 TE에 펠렛을 다시 현탁하십시오. 다음 날, 용액에 녹지 않은 잔류물이 있을 경우 조심스럽게 뒤집어 다시 현탁하십시오. 품질 관리 테스트를 위해 2.5 µL를 취해 22.5 µL의 TE에 분주하십시오.시퀀싱 의뢰 전까지 DNA 샘플을 4°C에 보관하십시오. 장기 보관이 필요한 경우 샘플을 -80°C에 보관하고, DNA 단편화를 방지하기 위해 동결-해동 반복 횟수를 최소화하십시오. 해당 프로토콜을 사용하여 정제된 genomic DNA로 젤 전기영동을 수행하였으며, 그 결과 20kbp 위에 강한 단일 밴드가 나타나고 스미어링이 최소화되어 품질 관리를 통과한 DNA, 20kbp 위에 단일 밴드가 나타나 경계선상의 결과가 나온 DNA, 그리고 20kbp 아래로 스미어링이 나타나고 100bp의 단편들이 포함되어 실패한 결과의 DNA를 얻었습니다.대부분의 DNA가 48.5kbp보다 큰 적합한 DNA 샘플과 대부분의 DNA가 20에서 48.5kbp 사이인 한계치 DNA 샘플을 구분하기 위해 펄스장 겔 전기영동(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)을 수행하였습니다. 이 절차를 거친 후, 흰가루병 균의 게놈에 대한 추가적인 질문을 해결하기 위해 단일 분자 롱리드 시퀀싱(single molecule long-read sequencing)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.

소일스 및 세디먼츠에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 추출

우리는 hypersaline 미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA를 추출하기위한 개선된 프로토콜을 제공합니다. 미생물 세포는 DNA 추출 및 정화하기 전에 매트 매트릭스에서 분리됩니다. 이것은 농도, 품질 및 DNA의 크기를 향상시킵니다. 프로토콜은 다른 내화물 샘플에 사용할 수 있습니다.

미생물 매트에서 높은 분자량의 DNA의 추출

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

이 논문은 염색체 외 원형 DNA(eccDNA)를 정제하기 위한 Circle-Seq라는 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법에는 컬럼 정제, 남아 있는 선형 염색체 DNA 제거, 롤링 서클 증폭 및 고처리량 염기서열분석이 포함됩니다. Circle-Seq는 진핵생물 eccDNA의 게놈 규모 스크리닝 및 게놈 불안정성 및 복제 수 변이 연구에 적용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

2 가지 plant organellar DNA 농축 방법의 비교 및 ​​최적화가 제시됩니다 : 전통적인 차동 원심 분리 및 메틸화 상태에 기초한 총 gDNA 분획. 우리는 결과로 나오는 DNA 양과 품질을 평가하고, 짧은 읽기 차세대 시퀀싱에서의 성능을 시연하며, 장시간 읽기 단일 분자 시퀀싱에서의 사용 가능성에 대해 논의합니다.

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Nanopore 시퀀싱 생체에 대 한 기술, 생명 과학, 병원 균, 식품 안전 모니터링, 게놈 분석, metagenomic 환경 모니터링 및 박테리아의 특성의 식별을 포함 하 여 넓은 응용 프로그램에 항 생 저항입니다. 이 문서에서는, metagenomic 토양 DNA 연속 nanopore 시퀀싱 기술을 사용 하 여 종 식별을 위한 절차는 보여 줍니다.

Metagenomic 토양 분석 Nanopore DNA 시퀀싱

단일 셀 시퀀싱 생물 학적 시스템, genotypic이 보여 하지만 현재 기술 커뮤니티 구성 및 기능의 깊은 프로 파일링에 필요한 처리량 부족. 여기, 우리는 미세 워크플로 시퀀싱에 대 한 설명 &gt; 다양 한에서 50000 단일 셀 게놈 세포 인구.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

이 프로토콜의 목적은 계산의 조합 및 벤치 연구를 사용 하 여 부분적 으로만 알려져 있을 수 있습니다 공동 정화 시퀀스에서 쉽게 분리 될 수 없는 새로운 시퀀스를 찾을 것입니다.

빼기 게놈에 의해 소설 시퀀스 검색

긴 읽기 시퀀스는 크게 복잡 한 유전자 및 구조 변화의 특성의 어셈블리를 촉진 한다. 연속 nanopore 기반 플랫폼으로 매우 긴 시퀀스를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 최적화 된 DNA 추출이 수정된 라이브러리 준비 인간 세포에서 kilobase 읽기 적당 한 보도 수백을 생성 하 여 다음을 채택 한다.

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

마그나포테 오리자에서 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

배우세요 흰가루병 단상포자에서 고분자량 게놈 DNA를 분리하여 긴 읽기 시퀀싱을 수행하는 방법을. 이 기술은 복잡한 진균 게놈 구조 연구와 식물 병원성 메커니즘 이해에 필수적입니다.

긴 읽기 시퀀싱에 대한 흰가루병에서 높은 분자량의 게놈의 DNA의 정제

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