정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

이 방법의 전반적인 목표는 정밀 절편 폐 슬라이스(precision-cut lung slices, PCLS)를 사용하여 폐 내 다양한 면역 세포 유형의 위치와 이동을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 폐 내 면역 세포의 분포 및 이동 패턴과 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 폐의 3차원 구조가 유지되는 살아있는 ex vivo 조직 내에서 여러 상호작용을 시각화할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 염증 발생 시 면역 세포의 국소화 및 이동에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 기도 및 평활근 조직의 수축을 시각화하는 데에도 사용될 수 있습니다. 폐 조직을 채취하려면, 먼저 가위를 사용하여 6~12주령 마우스의 복부 중앙부터 턱까지 피부와 복막을 절개하고, 장을 복강 측면으로 밀어냅니다. 하대정맥을 절단하여 폐의 혈액을 제거하고, 가위의 날카로운 끝으로 횡격막을 찔러 흉곽이 확장될 수 있도록 합니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 타액선과 기타 조직을 기관에서 수동으로 분리한 후, 미세 핀셋을 이용해 가장 두꺼운 연골 띠의 전측 기관에 20 gauge 바늘이 통과할 수 있을 정도의 작은 절개를 넣습니다. 이제 1.5 inch 20 gauge 바늘을 폴리에틸렌 튜브의 한 섹션에 끼우고, 튜브를 약 45도 각도로 절단합니다. 바늘을 1 mL 주사기에 연결하고, 40 °C의 2% low melting point agarose 0.8 mL를 주사기에 흡입합니다.

아가로스를 모두 로딩했다면, 튜브의 경사면 끝을 절개 부위에 삽입하고 폐 내부로 아가로스를 천천히 주입하십시오. 바늘이나 주사기를 움직이지 않은 상태에서 주사기를 폴리스티렌 베이스에 테이프로 고정하여 바늘이 기관 내에 유지되도록 하고, 동물을 4 °C 보관함에 최소 10분 동안 두십시오. 아가로스가 응고되면 가위로 폐를 조심스럽게 절제하여 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 3 cm 디시에 넣으십시오.

그 다음, 기관과 연결되는 폐의 내부 단면이 아래를 향하도록 조직 절편용 엽을 돌립니다. 폐 조직을 절단하려면, 먼저 금속 주사기 밀대에 All Purpose No Run gel superglue를 소량 떨어뜨린 후 원을 그리며 펴 바릅니다. 접착제를 모두 도포했다면, 핀셋을 사용하여 적출한 엽의 기관 쪽이 아래로 가도록 즉시 조심스럽게 잡고, 조직지에 엽을 살짝 눌러 과도한 액체를 제거합니다.

건조된 엽을 플런저 위에 조심스럽게 올리고, 플런저 가장자리 너머로 튀어나온 여분의 조직을 잘라냅니다. 플런저를 아래로 이동시켜 금속 시린지의 측면이 조직 위로 올라오게 하여, 시린지 샤프트 바닥에 폐가 놓인 수 센티미터 깊이 이내의 웰을 만듭니다. 플런저를 고정하기 위해 시린지 하단 주위를 테이프로 감습니다.

그런 다음 40 °C의 2% low melt agarose를 엽편의 상단이 살짝 덮일 정도로 주사기에 조심스럽게 붓고, 금속 주사기를 얼음처럼 차가운 냉각 블록으로 감쌉니다. 1~2분 후, 시편 주사기를 자동 슬라이서에 장착하고 새 칼날을 정렬합니다. 다음으로, 버퍼 탱크를 차가운 PBS로 채웁니다.

스텝 모터 드라이브를 시료 주사기와 정렬한 후 테이프를 제거합니다. 스텝 모터 드라이브가 플런저 뒷면에 닿을 때까지 스위치를 고속 전진 위치로 돌립니다. 슬라이서에서 조직 두께, 연속 단일 절편, 진동 및 속도 설정을 지정합니다.

그런 다음 시작 버튼을 누르고, 얇은 스패튤라를 사용하여 버퍼 탱크로 떨어지는 각 PCLS를 수집하여 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 24웰 플레이트의 개별 웰에 슬라이스를 넣습니다. 정적 PCLS 이미징의 경우, 관심 있는 해부학적 영역이 포함된 폐 샘플을 해당 항체 칵테일 1 mL가 담긴 개별 3 cm 디쉬로 옮깁니다. 빛을 차단한 상태에서 로킹하며 얼음 위에서 30~60분간 반응시킨 후, 얼음처럼 차가운 PBS 1 mL로 슬라이스를 두 번 헹굽니다.

다음으로, 샘플당 하나의 새로운 3cm 원형 유리 바닥 디쉬에 PBS 50 µL를 넣고, 슬라이스를 각 방울 속으로 빠르게 옮긴 뒤 조직 조각들이 평평하게 펼쳐지도록 부드럽게 조절합니다. 그다음 피펫으로 PBS를 흡입하여 제거하고, 슬라이드 위에 실온의 마운팅 매질 한 방울을 떨어뜨린 후 유리 커버슬립을 덮습니다. 조직을 이미지화하려면 디쉬를 20x 대물렌즈 아래의 공초점 현미경 스테이지 위에 놓고, 타일 툴의 convex hull 설정을 사용하여 조직의 가장자리를 찾아 표시함으로써 타일 스캔 시간을 단축합니다.

그런 다음 z-스택 범위를 설정하는데, 설정된 범위가 슬라이스의 여러 영역, 특히 가장자리를 따라 적절하게 적용되는지 주의 깊게 확인하십시오. 살아있는 세포 이미징의 경우, 원하는 항체 칵테일에서 30분 동안 배양한 후, 차가운 Leibovitz 10 1 mL로 슬라이스를 두 번 헹굽니다. 다음으로, 샘플당 챔버형 커버 글라스의 한 슬롯에 신선한 Leibovitz 10 50 µL를 넣고, 즉시 각 PCLS를 배지로 옮긴 후 조직이 평평하게 펴질 때까지 부드럽게 조작하십시오.

그런 다음 피펫을 사용하여 각 챔버에서 배지를 흡입하고 백금 무게추로 각 PCLS를 고정합니다. 새로 준비한 얼음처럼 차가운 세포외 기질을 각 PCLS 위에 조심스럽게 피펫팅하며, 겔이 폐 슬라이스 위에 놓이도록 하고 슬라이스가 겔 위에 뜨지 않도록 주의합니다. 37 °C에서 5분 후, 슬라이드를 20x 대물렌즈 하에서 37 °C로 설정되어 미리 가온된 공초점 현미경 챔버로 옮깁니다.

그런 다음, 프레임 간의 원하는 간격을 기준으로 z-stack 및 타일 범위를 설정하며, 타일 도구를 사용하여 조직 내 관심 영역을 지정하고, 중앙 그리드 설정을 통해 시야 중앙에 샘플을 배치합니다. CD11b high conventional dendritic cells는 폐 실질에 위치하는 반면, CD103 positive conventional dendritic cells는 주로 기도 주변과 흉막하 영역에 거주합니다. CD88 및 CD172a에 대한 공동 염색을 통해, CD172a negative 및 CD88 positive인 폐포 대식세포와 CD172a positive 및 CD88 positive인 간질 대식세포를 구분할 수 있으며, 후자는 상피하 영역이 아닌 실질에 우선적으로 위치합니다.

잘 알려진 T세포 마커인 CD90.2와 림프관 생성에 필수적인 마스터 전사 인자의 전사 조절 하에 있는 트랜스진인 TdTomato 형광 단백질을 공동 표지함으로써 폐 내의 림프 구조를 용이하게 식별할 수 있습니다. CD103 양성 conventional dendritic cell은 CD324를 발현하는 기도 상피, 림프관 및 흉막 하 영역을 포함한 여러 해부학적 부위에서 발견됩니다. 방금 시연한 바와 같이, 살아있는 세포 이미징을 통해 세포의 이동 및 세포 간 상호작용을 기록할 수 있습니다.

예를 들어, 대표적인 실험에서 경구 ova-LPS 투여 16시간 후, 4시간 동안 입양 전이된 ova 특이적 T세포와 상호작용하는 CD103 양성 수지상 세포를 명확하게 관찰할 수 있습니다. 숙련된 경우, 조직 준비와 슬라이싱 기술을 적절하게 수행한다면 2시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 아가로스 폐 팽창을 충분히 유도하고, 이후 이미징을 위해 섬세한 폐 슬라이스를 최대한 평평하게 유지하는 것이 중요합니다.

이 절차에 이어, 아세틸콜린 또는 메타콜린으로 PCLS를 처리하는 것과 같은 다른 방법들을 수행하여 다양한 질환 상태에서의 칼슘 신호 전달 및 기도 수축성에 관한 추가적인 의문점들을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 폐 내 면역 세포의 국소화, 이동 및 상호작용을 시각화하기 위한 정밀 절단 폐 슬라이스를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.