Name: 정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS) 기법을 이용하여 마우스 폐에서 면역 세포의 위치와 이동 패턴을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 폐 면역학 연구와 염증 반응 분석에 활용됩니다.

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우리는 현미경과의 도움을 제프 터커, 에리카 스카피니, 그리고 아그네스 Janoshazi 감사합니다, 비판적 읽기 마우스 식민지의 그녀 관리를위한 라이곤 페로우 및 준 첸와 마이클 샌더슨 조직 슬라이서에 대한 도움말, 마이클 Fessler 데릭 가인 원고. 이 작품은 결과적으로 보건 복지부가 후원하는 NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09)의 교내 지점에 의해 투자되었다.

이 문서에 설명 된 동물 실험 절차는 NIEHS 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 폐 제조 <ol><li> 제도적 동물 관리 및 사용위원회에 의해 제공되는 지침에 따라 특정 병원균이없는 조건에서 생후 6 12 주 사이 하우스 마우스. 참고 : 몇 군데 마우스는 각 연구자의 특정 관심 분야에 따라, 순진, 또는 처리 될 수 있습니다. 여기서는 50 μL의 총 부피의 비히클로 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여, 나이브 마우스에 100 μg의 난 알부민 (OVA) 및 0.1 μg의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)로 처리 된 마우스에 면역 세포 제이션을 설명한다. oropharyngeally기도에 OVA / LPS를 주입하기 위해 동물 이소 플루 란 흡입 마취와 수직으로 고무 밴드와 함께 자신의 치아에 의해 중단되었다. 혀 부드럽게 포셉 파지 연하 방지 한쪽 유지하고 50 #시켰다181; 구강의 후면에 증착 된 OVA / LPS 용액 L은 앞서 설명한 17. </li><li> 나트륨 펜토 바르 비탈 (100 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사로 마우스를 안락사 및 폴리스티렌베이스 동물 핀. </li><li> 턱 복부까지의 중앙으로부터 피부와 복막 절단 가위로 복강을 열고. 집게 또는 위의 둔한 에지 제외 창자 당기고 폐 멀리 피 드레인 대정맥을 자르지. 폐를 절단하지 않도록주의하면서, 흉곽의 팽창을 허용하도록 위의 날카로운 팁 격막 천공. </li><li> 클리어 침샘과 집게로 기본 기관에서 당기고 수동으로 조직을 잡아하여 멀리 기관에서 다른 조직. TRA 불구하고 모든 방법을 베이지 않도록주의하면서 미세 집게 가위를 사용하여 연골의 두꺼운 밴드의 전방 측면에서 기관의 작은 절개를합니다CHEA. 절개는 20 G 바늘이 통과 할 수 있도록 충분히 커야합니다. </li><li> 바늘의 끝을지나 튜브의 약 1cm을두고 폴리에틸렌 튜브의 섹션 상에 1.5 인치, 20 G 바늘을 밀어. 아가까지 바늘을 통해 따뜻한 0.8 ㎖ (40 ℃)에서 2 % 저 융점 그려서 주사기를 최종 베벨 1 ml 주사기의 바늘을 장착하고,로드 약 45 °의 각도로 튜브를 절단. </li><li> 기관의 절개로 튜브의 끝을 놓고 천천히 폐에 아가로 오스를 주입. 바늘이나 주사기를 이동하지 않고, 바늘이 기관에 남아 보장하기 위해 폴리스티렌베이스에 주사기를 테이프. 참고 : 주입 후, 폐는 가슴에서 크고 팽창 될 것입니다. 오른쪽 돌출부는, 먼저 왼쪽 엽을 확장합니다. 하나의 로브가 확장되면, 바늘 (기관지 과거) 너무 깊이 삽입 된, 그리고 그것을 진행하기 전에 약간 당겨해야 할 것입니다. 의이 부분절차는 아가로 오스는 응고 시작하기 전에, 상대적으로 빠르게 수행해야합니다. </li><li> 적어도 10 분 동안 상기베이스 및 냉장실 여전히 기관에 삽입 된 주사기 또는 냉장고, 마우스를 놓는다. 필요한 경우, 동물은 몇 시간까지, 심지어 비디오 현미경으로 이미지 세포의 이동으로 진행하면 거기에 유지 될 수있다. </li><li> 마우스가 감기되면, 조심스럽게 가위를 사용하여 아가로 오스 - 팽창 폐를 절제하고, 얼음 차가운 PBS와 3cm 접시에 배치합니다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 조직 슬라이스에 대해 원하는 엽 (예를 들어, 바로 우수한 엽)을 선택합니다. 확실히 (이 기관에 연결) 폐의 내부 부분이 접시에 내려 얼굴을 확인합니다. 주 : 로브를 사용하고, 플런저에 그 방향이 표시되며기도 혈관의 크기를 결정한다. 여기에서 설명한 배향은 큰기도의 시각화 및 실질 이상적이다. 마우스는 하나의 큰 왼쪽 엽과 오른쪽에 네 개의 작은 돌출부가 있습니다. 에 대한편리 크기 때문에, 또한 흡입 에이전트가 그 안에 균일하게 분산하기 때문에 인두 또는 비강 흡입을 통해 폐에 알러지 유발 물질의 도입 다음 PCLS 영상은 오른쪽 우수한 엽은 일반적으로 부분적으로 구분된다. 그러나 다른 로브, 특히 왼쪽 엽도 공부하실 수 있습니다. 마우스 균주 또는 치료를 비교하는 경우, 같은 엽을 비교하는 것이 중요하다. </li></ol> 2. 폐 슬라이스 참고 : 제조업체의 지침에 따라, 금속 블록, 플런저 및 금속 주사기를 냉각, 자동 슬라이서를 이용하여 슬라이스를 확인합니다. <ol><li> 플런저에 모든 용도의 작은 방울, 노 실행 젤 superglue를 넣고 접착제 금속 주사기의 측면에 접촉하지 않도록주의하면서 원을 그리 접착제를 확산. 접착제 주사기의 측면에 접촉하면, 주사기 플런저 접착제와 함께한다. </li><li> 즉시 접착제와 플런저를 피복 한 후, 가볍게 잡고다운 기관 측과 집게 절제 로브 과잉 액체를 제거하고, 신중 플런저의 상부에 배치하기위한 조직에이 한 덩어리. 플런저의 에지를 넘어 연장되는 여분의 조직을 잘라내. </li><li> 금속 주사기의 측면 이동과 조직을 통해 있도록 만들어 아래로 플런저를 이동 잘 깊은 몇 센티미터보다 더 이상, 하단에 붙어 폐. 금속 주사기의 바닥의 주위에 테이프 장소에서이 위치를 유지합니다. </li><li> 단지 로브의 상부를 커버하는 것이므로 웰에 40 ℃에서 2 % 저 용융 아가 로스를 붓는다. </li><li> 얼음 - 냉각 된 냉각 블록 금속 주사기를 둘러싸고 1 로브 및 아가로 냉각 - 2 분. 참고 : 주변 조직 아가로 오스의 짧은 시간 냉각이 고르지 잘라 PCLS이 발생할 수있는 슬라이스 동안 아가로 오스의 붕괴로 이어질 수있다. </li><li> 자동 슬라이서로 표본 주사기를 넣고 얼음 차가운 PBS와 버퍼 탱크를 채우십시오. 맞 춥니<html> 시편 주사기 모터 구동 단계와 바닥에서 테이프의 부분을 제거한다. 스텝 모터 구동 단지 플런저의이면에 닿을 때까지 빨리 감기 (FF) 위치로 스위치를 켜는. </li><li> 시편 주사기와 신선한 날을 맞 춥니 다. 슬라이서에서 설정 조직 두께, 연속 / 단일 슬라이스, 진동 및 속도. 예를 들어, 조직의 두께가 150㎛, 연속 절삭 (계속). 발진 9 및 속도 3 - 4. 시작. 위의 설정은 특정 자동 슬라이서 사양으로 조정해야합니다. </li><li> 그들은 상기 버퍼 탱크 내로 낙하하고 빙냉 PBS를 함유하는 24 웰 플레이트에 배치로 얇은 주걱 또는 브러시를 사용하여 한번에 하나 PCLS 수집. 참고 : 실험 사이의 일관성을 유지하기 위해 조각을 유지하는 것이 중요합니다. 모든 폐 나이, 성별, 체중에 따라 다르지만, 10 번째 조각은, 예를 들어, 일반적으로 유사기도 크기 산출한다. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 3. 항체 염색 <ol><li> 계정에 잠재적 인 형광 스펙트럼 중복 및 현미경의 탐지 기능을 가지고, 관심의 세포 유형에 따라 형광 태그 항체의 패널을 디자인합니다. 참고 : 다음과 같은 예를 들어, DC 서브 세트 검출 용 패널은 다음의 CD11c / 알파 X 인테그린 - BrilliantViolet (BV) (605) (인가 전압 : 405 nm의 발광 피크 : 605 ㎚), CD324은 / E-cadherin의 - 알렉사 488 (AF488 ) (인가 전압 : 488 nm의 발광 피크 : 519 ㎚), CD88 / C5Ra1 - 피코 에리 트린 (PE) (인가 전압 : 561 nm의 발광 피크 : 578 ㎚), CD103은 / 알파 E 인테그린 - 알로 피코시 아닌 (APC) (인가 전압 : 633 내지 발광 피크 : 660 ㎚). 형광 스펙트럼 뷰어 도구 (재료 목록 참조) 패널을 설계하는 데 유용합니다. </li><li> 원하는 항체를 포함한 항체 칵테일을 만든다. <ol><li> 정적 PCLS 이미징 1.5 ML의 microcentrifu 800 μL 염색 완충액 100 μL 프크 블로커, 50 μL 정상 마우스 혈청 및 50 μL 정상 쥐의 혈청을 추가1 mL의 총 부피에 대한 gation 튜브. 생균 이미징 대신 염색 완충액 10 % FBS (라이 보 비츠-10)을 함유하는 800 μL의 라이 보 비츠 매체 (1X)를 사용한다. </li><li> 각 항체의 원하는 최종 농도를 조정하는 항체를 추가한다. 3 센티미터 접시에 항체 솔루션을 전송하고, 사용할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 유지한다. 주 : (- 5 ㎍ / ㎖의 통상 1) 최종 농도가 필요 각 항체에 대해 최적화된다. </li></ol></li><li> 대형기도 또는 폐의 주변부로서 관심의 해부학 적 영역을 갖는 PCLS를 선택하고, 1 ㎖의 항체 용액을 포함하는 3-cm 접시에 놓는다. </li><li> 30 또는 60 분 동안 천천히 흔들 얼음에 어두운 얼룩 PCLS,. </li><li> 정적 PCLS 이미징 들어, 라이브 세포 이미징을 위해 섹션 4로 진행 섹션 5로 진행합니다. </li></ol> PCLS 4. 정적 이미징 <ol><li> 항체 PCLS 60 분 배양 후, t 디쉬로부터 상기 항체 용액을 제거하고 린스그는 1 mL의 얼음 차가운 PBS로 두 번 조각. </li><li> 3cm 둥근 바닥 유리 접시 상에 50 μL 피펫 PBS. 주걱이나 붓을 사용하여, 평평해질 때까지 부드럽게 조각을 조작, 드롭에 스테인드 PCLS을 전송하고 확산. 피펫으로 PBS를 제거합니다. 슬라이스는 가능한 한 평평해야한다. 위의 절차는 광표백을 방지하기 위해 신속하게 수행 될 필요가있다. </li><li> 슬라이스에 실온 장착 매체 1 방울을 넣고 부드럽게 플레이트의 웰에 유리 커버 슬립 놓는다. 이미징 전에 시간까지 4 ° C에서 어둠 속에서 PCLS을 유지합니다. </li><li> 공 초점 현미경으로 볼 때, 20 배 목표를 (자료 목록을 참조)를 사용합니다. 은 &quot;볼록 선체&quot;설정에서 조직의 가장자리를 찾아 표시하기 위해 &quot;타일&quot;도구를 사용합니다. 이 타일 스캔 시간을 줄이는 데 도움이됩니다. </li><li> Z 축 스택 범위를 설정하는 동안, 특히 가장자리 슬라이스의 여러 영역에서 확인 설정된 범위 그적합하다. 주 : Z-범위는 조직이 완전히 평평하게 누워에 도착하는 것은 매우 어렵 기 때문에 조직 자체의 두께보다 클 필요 전망이다. 슬라이스에 충돌 곡선을 수용하기 위해 250 ㎛의 - 예를 들어, 150 μm의 두께로 PCLS 상기 Z 스택 범위 가능성 (200)에 설정 될 필요가있다. 20 배의 대물 렌즈와 12 시간 - Z 축 스택 범위와 조직의 크기에 따라 각각의 전체 폐 스캔 (7) 사이를 취할 것이다. 각각의 폐는 고유하고 설정은 모든 실험 조정해야합니다. </li></ol> PCLS 5. 라이브 세포 이미징 <ol><li> 항체 PCLS의 30 분 인큐베이션 후에, 접시의 항체 용액을 제거하고 차가운 라이 보 비츠 10 mL로 1 회 조각을 헹군다. </li><li> 신선한 50 μL 피펫 라이 보 비츠 - 10 커브 글라스 챔버 (8 개 슬롯)의 슬롯에 하나. , 매체에 PCLS를 전송하기 위해 주걱을 사용하여 슬라이스가 평평해질 때까지 부드럽게 조작하고 확산. 위의 절차필요 광표백을 방지하기 위해 신속하게 수행한다. </li><li> 피펫을 사용하여 50 μL 매체를 제거합니다. 슬라이스는 가능한 한 평면 거짓말을하는 것입니다. 주 : 조각의 가장자리가 상기 챔버의 벽에 대해 수직으로 대칭되는 경우에 허용된다. 또한, 가능하다면, 금속 백금의 중량을 다음 단계로 진행하기 전에 슬라이스를 고정하는데 사용될 수있다. 잘라 작은 무게로 구부러 질 수 있습니다 백금 와이어의 한 예를 들어 첨부 자료 목록을 참조하십시오. </li><li> 4 ° C 냉장실에서 성장 인자 - 감소 된 100 μL 라이 보 비츠 10 페놀 레드없는 세포 외 기질을 100 μL를 혼합한다. 이를 위해 미리 냉각 된 피펫 팁을 사용하거나 세포 외 기질은 팁에 응고됩니다. 주 : 매트릭스 매질이 비율 (1 : 1) 조직 배양 조건에서 PCLS을 저장하기에 충분히 조밀 한 겔을 생성한다. </li><li> 부드럽게 혼합하는 행렬을 피펫 조심스럽게 젤은 루의 상단에가는 것을 확인의 PCLS 위에 피펫슬라이스를 겨, 그리고 조각이 젤 상단에 뜨지 않습니다. 겔 플레이트의 바닥에 내려 PCLS 정박 중량으로 작동한다. </li><li> 조심스럽게 37 ℃ 배양기에 챔버 커버 글라스를 전송하고, 매트릭스 ~ 5 분 동안 응고하자. </li><li> 공 초점 현미경의 사전 예열 단계에 전체 챔버의 coverglass을 전송합니다. 촬상에 걸쳐 37 ℃에서 챔버를 유지한다. 라이 보 비츠의 매체를 사용하는 경우 CO 2 공급은 세포 배양 중에 필요하지 않습니다. </li><li> 프레임 간의 원하는 간격에 기초하여 상기 Z 스택 영역 및 타일의 범위를 설정한다. 공 초점 현미경으로 볼 때, 20 배 목표를 (자료 목록을 참조)를 사용합니다. (예를 들어, 2 × 2를 중심으로 그리드)은 &quot;중심 그리드&quot;설정을 사용하여 조직에 대한 관심의 영역을 나타 내기 위해 &quot;타일&quot;도구를 사용합니다. </li><li> Z 축 스택 범위를 설정하는 동안 설정 범위가 적절한 슬라이스의 여러 영역에서 확인. 참고 : ZR앤지 조직의 두께와 동일 할 것. 각각의 폐는 고유하고 설정은 모든 실험 조정해야합니다. 2 × 2 타일 10 Z-스택은 일반적으로 1 ~ 프레임 / 2 분을 초래할 것이다. 확인 자동 초점 기능은 촬영 기간 동안 XY 및 Z-드리프트를 최소화하기 위해 실험을 시작하기 전에 활성화됩니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 선언하는 이해 관계의 충돌이 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 원래의 폐 CDCS의 두 부분 집합의 위치를 ​​시각화하기 위해 개발되었다. 그러나,이 프로토콜은 쉽게 세포 생존 및 폐의 3 차원 구조를 유지하면서, 다양한 세포 유형을 공부하고 적용 할 수 있습니다. 후자의 기능은 세포 배양 시스템에 비해 중요한 장점이다 희귀 세포 유형의 식별을 용이하게한다. 상기 방법은 폐에서 PCLS의 발생에 의존하고, 배경 얼룩을 최소화하면서 항체의 적절한 조합이 특정 세포 유형을 식별. 큰 정도,이 유동 세포 계측법을 포함한 다른 응용 프로그램에서 잘 작동 항체가 반드시 PCLS을 염색 잘 작동하지 않기 때문에 경험적인 운동이다. 우리는 이미이 점에서 상당한 진전을 만들었습니다, 그러나 여기에서 다루지 않은 세포 유형을 공부하고자하는 연구자들은 서로 다른 항체를 테스트하고 형광 색소와 농도를 최적화 할 수 있습니다. </p&gt; 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 CD103 + CDCS와 CD11b...

이러한 지질 다당류 (LPS)와 같은 염증성 자극의 흡입 후,이 내에 면역 세포의 조정 움직임, 그리고 폐에서. 예를 들어, 호중구는 빠르게 폐 실질과기도로 모집하고 있습니다. 또한, 종래의 수지상 세포 (CDCS)로 알려진 몇몇 전문 항원 제시 세포는 비교적 복잡한 이동 패턴 1, 2 겪는다. CDCS은 표면 마커들의 디스플레이하는 CD11c에 부분적으로 유세포하여 식별 기초 할 수있다. 수지상 고유 서브 세트 CD103 및 CD11b를 3 차 표면 발현에 의해 구별 될 수있다. 흡입 된 항원을 취득하면, 일부 CDCS 폐 빠져가 항원 특이 적 T 세포 위해 4 펩티드를 제시 폐 배수 림프절 (림프절)에 림프관을 통해 이동한다. 이 적응성 면역 연구의 시작에 중요한 초기 이벤트esponses. 알 수없는 이유로, 그러나, 흡입 항원을 획득 모든 CDCS는 폐를 떠나, 이러한 세포의 대부분은 몇 달 5 해당 기관에서 6 남아있다. 단핵구 유래의 CD11c + 케모카인 수용체, CCR7 부족한 세포, 지역 림프절 7, 8로 마이그레이션 할 수없는 때문에 이러한 관찰은 부분적으로 이러한 세포의 발달 조상에 의해 설명 될 수있다. CDCS의 이동 가능성도 폐 내에서의 해부학 적 위치에 의해 적어도 부분적으로 결정되는 것으로 보인다. 그러나, 폐 CDCS의 서로 다른 집단의 정확한 현지화 완전히 특징되지 않습니다. 폐 내에서, 그리고 직접 분자의 면역 세포 지역화의 개선 된 지식, 폐의 면역 체계가 활성화됩니다 방법에 대한 더 나은 이해를 위해 필요합니다. PCLS이되고 증가하고있다폐 구조 (9), (10)의 구조적 일체 성을 유지하면서, LY는 셀룰러 위치 및 세포 - 세포 상호 작용을 시각화하기위한 생체 외 방법으로 사용된다. PCLS은 쥐, 소, 원숭이, 양, 말, 인간 (11)를 포함하여 많은 종의 폐를 연구하는 데 사용되었다. 이 기술의 주요 장점은 약 20 분할함으로써 개별 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고, 마우스 폐 단일 로브로부터 제조 될 수 있다는 것이다. 수지상 세포, 대 식세포, 호중구 및 T 세포를 포함하여 거의 모든 면역 세포 유형은 PCLS에 존재하고 그들의 정상적인 구조를 유지한다. PCLS은 아세틸 콜린 (12) 또는 메타 (13)와 치료 후 칼슘 신호 및기도 평활근 세포의 수축력을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방식에서, 폐의 작은 부분은 인현미경 alyzed하지만, 한 연구는 PCLS에서기도 수축의 측정 슬라이스 조각에서 약 10 %을 변화하고,이 차이는 그대로 동물 (14)에 폐 기능 검사를 사용하여 볼에 필적이라고보고했다. 다른 연구자들은 LPS (15)와 함께 배양 한 후 사이토 카인의 발현 및 세포 표면 마커의 변화를 연구하기 위해 체외 방식으로 PCLS을 사용했다. PCLS 또한 작은 내 선방 동맥 저산소 성 폐 혈관 수축의 체외 모델에서 사용되어왔다. 이 선박은 해부 동맥 세그먼트 또는 subpleural 용기 (16)의 분석 등을 포함하여 기타 절차를 사용하여 도달 할 수없는 폐의 부분에 있습니다. 우리 연구실은 주로 생체 내 염증 자극 다음과 면역 세포의 정상 상태에서 라이브 폐 조직의 현지화 및 시각화 PCLS을 사용하고있다. 다음과 같이 우리가 개발 한 절차이다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Prox1-TdTomato 형질전환 마우스&nbsp;</td><td>잭슨 연구소</td><td>018128</td><td>B6; 129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J</td></tr><tr><td>OT-II OVA 특이적 TCR x Nur77-GFP 형질전환 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>004194, 016617</td><td>B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J&nbsp;</td></tr><tr><td>Rag1 녹아웃 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>002216</td><td>B6.129S7-Rag1tm1Mom/J</td></tr><tr><td>Ovalbumin, Low Endo, Purified</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003059</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td>의 지방 다당류<td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 (비멸균) 100 ft</td><td>BD 진단 시스템</td><td>427421</td><td>0.86 mm 내경, 1.27 mm 외경</td></tr><tr><td>GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3112-125</td><td>2 % 용액은 70 °C에서 PBS에 용해됩니다. C에서 40 &deg;C로 유지되었습니다.</td></tr><tr><td>컴프레스톰 VF-300</td><td>정밀 기기, Inc.</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>양날 스테인리스 면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72000</td><td>일회용; 250/상자. 모든 폐에 대해 블레이드를 교체해야 합니다.</td></tr><tr><td>Krazy Glue 모든 목적 인스턴트 젤</td><td>VWR</td><td>500033-484</td><td>일반적으로 현지 약국에서 튜브당 $3에 구할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 레드</td><td>없음 ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Normal Rat Serum (NRS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>012-000-120</td><td></td></tr><tr><td>노멀마우스혈청(NMS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>015-000-120</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>염색 완충액</td><td></td><td></td><td>0.5% 소 혈청 알부민, 0.1% NaN3, pH 7.4</td></tr><tr><td>Fc 차단제(항-CD16/32 항체)</td><td>Made in House</td><td>N/A</td><td>배양된 하이브리도마 세포주 2.4G2</td></tr><tr><td>항-마우스 CD11b eFluor 450</td><td>eBioscience</td>의 상등액<td>48-0112-80</td><td>안티 마우스 CD11b eFluor 450 (클론: M1/70)&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11c 브릴리언트 바이올렛 605</td><td>BioLegend</td><td>101237</td><td>브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD11c (클론 : M1 / 70)</td></tr> <tr><td>안티 마우스 CD11c Phycoerythrin</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td>PE 복합 안티 마우스 CD11c (클론 : N418)</td></tr> <tr><td>안티 마우스 CD11c Allophycocyanin</td><td>BD Phamingen 550261</td><td></td><td>APC 표지 안티 마우스 CD11c 9클론 : HL3)</td></tr> <tr><td>안티 마우스 CD88 Phycoerythrin</td><td>BioLegend</td><td>135806</td><td>PE 안티 마우스 CD88 (클론: 20/70)</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD103 알로피코시아닌</td><td>eBioscience</td><td>17-1031-82</td><td>안티 마우스 CD103 APC (클론: 2E7)</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD90.2/Thy1.2 eF450</td><td>eBioscience</td><td>48-0902-82</td><td>안티 마우스 CD90.2 eFluor 450 (클론: 53-2.1)</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD172a/Sirp1a 알로피코시아닌</td><td>eBioscience</td><td>17-1721-82</td><td>안티 마우스 CD172a APC (클론: P84)</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD324 브릴리언트 바이올렛 421</td><td>BD 호라이즌</td><td>564188</td><td>BV421 마우스 안티-E Cadherin (클론: 5E8 일컬어 5E8-G9-B4)</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD324 Alexa Fluor 488</td><td>eBioscience</td><td>53-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (클론: DECMA-1)</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD324 Alexa Fluor 647</td><td>eBioscience</td><td>51-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (클론: DECMA-1)</td></tr><tr><td>유리 바닥 Microwell 접시 35 mm 페트리 접시, 14 mm Microwell, No. 1.5 커버글라스</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 챔버 커버글라스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155411PK&nbsp;</td><td>16 개 팩</td></tr><tr><td>15 mm 커버슬립, No. 1.5 유리 두께</td><td>MatTek Corperation</td><td>PCS-1.5-15</td><td></td></tr><tr><td>베어 플래티넘 와이어</td><td>세계 정밀 기기</td><td>PTP201</td><td>0.020" (0.5 mm) 직경을 ~1cm 길이의 조각으로 자르고 "L" 모양으로 구부림</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td>4°C 유지; C, 사용하기 전에 실내 온도로 따뜻하게하십시오.</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 880 다광자 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zen Black 소프트웨어 버전 8.1, 2012 (Zeiss)</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td></td></tr></tbody></table>

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

알러지 유발 물질과 병원균의 흡입은 폐의 면역 세포 유형의 다양한 여러 변화를 이끌어 낸다. 유동 세포 계측법은 면역 세포에 세포 표면 단백질의 정량 분석을위한 강력한 기술이지만, 폐 내에서 이러한 세포의 현지화 및 이동 패턴에 관한 정보를 제공하지 않습니다. 마찬가지로, 화성 분석은 체외에서 화학 주성 인자에 반응하는 세포의 가능성을 연구하기 위해 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 전술 한 기술들에 대조적으로, 폐 내의 각각의 세포 유형의 위치를 ​​용이하게 시판되는 형광 태그 항체로 염색 정밀 절단 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 공 초점 현미경에 의해 부분을 시각화 시각화 할 수있다. PCLS 살 모두 사용과 폐 조직을 고정하고, 슬라이스 전체 엽 단면 한 큰 영역을 포괄 할 수있다. 우리는 성공적으로 수지상 세포의 구별 유형, 대 식세포, 호중구, T 세포와 B 세포뿐만 아니라, 림프, 내피 등의 구조 세포를 포함 폐에서 세포 유형의 다양한의 위치를 ​​시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고있다 상피 세포. 세포가 폐 내에서 이동 및 정상 상태에서 염증 동안 서로 상호 작용하는 방식을 라이브, 입체 폐 조직에서 수지상 세포와 T 세포 사이 것과 같은 세포 상호 작용을 시각화하는 능력은 공개 할 수 있습니다. 같은 유동 세포 계측법 및 정량 PCR과 같은 다른 절차와 함께 사용하는 경우 따라서, PCLS는 폐의 알레르기 성 및 염증성 질환의 기초가 세포 사건의 포괄적 인 이해에 기여할 수있다.

C57BL / 6 마우스에서 두 개의 DC 서브 세트들의 위치, CD11b를 하이 CDCS 및 CD103 + CDCS, PCLS 식별로 절단하는 CD11c 특이 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)로 염색하고, CD88, CD103 및 CD324 (E-cadherin의). CD324 얼룩기도 상피 세포에 대한 항체 및 CD88은 대 식세포와 호중구,하지만 CDCS (8)에 표시됩니다. 이것은 우리의 CD11c + 대 식세포에서 CDCS를 구별하고,기도 (도 1)에 각 세포 유형의 공간적 관계를 관찰 할 수 있었다. 우리는 CD103 + CDCS는 주로기도와 subpleural 지역의 주위에있는 반면, CD11b를 하이 CDCS는 실질에 지역화 것을 발견했다. CD103 + CDCS...

우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

이 방법의 전반적인 목표는 정밀 절편 폐 슬라이스(precision-cut lung slices, PCLS)를 사용하여 폐 내 다양한 면역 세포 유형의 위치와 이동을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 폐 내 면역 세포의 분포 및 이동 패턴과 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 폐의 3차원 구조가 유지되는 살아있는 ex vivo 조직 내에서 여러 상호작용을 시각화할 수 있다는 점입니다.이 방법은 염증 발생 시 면역 세포의 국소화 및 이동에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 기도 및 평활근 조직의 수축을 시각화하는 데에도 사용될 수 있습니다. 폐 조직을 채취하려면, 먼저 가위를 사용하여 6~12주령 마우스의 복부 중앙부터 턱까지 피부와 복막을 절개하고, 장을 복강 측면으로 밀어냅니다. 하대정맥을 절단하여 폐의 혈액을 제거하고, 가위의 날카로운 끝으로 횡격막을 찔러 흉곽이 확장될 수 있도록 합니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 타액선과 기타 조직을 기관에서 수동으로 분리한 후, 미세 핀셋을 이용해 가장 두꺼운 연골 띠의 전측 기관에 20 gauge 바늘이 통과할 수 있을 정도의 작은 절개를 넣습니다. 이제 1.5 inch 20 gauge 바늘을 폴리에틸렌 튜브의 한 섹션에 끼우고, 튜브를 약 45도 각도로 절단합니다. 바늘을 1 mL 주사기에 연결하고, 40 °C의 2% low melting point agarose 0.8 mL를 주사기에 흡입합니다.아가로스를 모두 로딩했다면, 튜브의 경사면 끝을 절개 부위에 삽입하고 폐 내부로 아가로스를 천천히 주입하십시오. 바늘이나 주사기를 움직이지 않은 상태에서 주사기를 폴리스티렌 베이스에 테이프로 고정하여 바늘이 기관 내에 유지되도록 하고, 동물을 4 °C 보관함에 최소 10분 동안 두십시오. 아가로스가 응고되면 가위로 폐를 조심스럽게 절제하여 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 3 cm 디시에 넣으십시오.그 다음, 기관과 연결되는 폐의 내부 단면이 아래를 향하도록 조직 절편용 엽을 돌립니다. 폐 조직을 절단하려면, 먼저 금속 주사기 밀대에 All Purpose No Run gel superglue를 소량 떨어뜨린 후 원을 그리며 펴 바릅니다. 접착제를 모두 도포했다면, 핀셋을 사용하여 적출한 엽의 기관 쪽이 아래로 가도록 즉시 조심스럽게 잡고, 조직지에 엽을 살짝 눌러 과도한 액체를 제거합니다.건조된 엽을 플런저 위에 조심스럽게 올리고, 플런저 가장자리 너머로 튀어나온 여분의 조직을 잘라냅니다. 플런저를 아래로 이동시켜 금속 시린지의 측면이 조직 위로 올라오게 하여, 시린지 샤프트 바닥에 폐가 놓인 수 센티미터 깊이 이내의 웰을 만듭니다. 플런저를 고정하기 위해 시린지 하단 주위를 테이프로 감습니다.그런 다음 40 °C의 2% low melt agarose를 엽편의 상단이 살짝 덮일 정도로 주사기에 조심스럽게 붓고, 금속 주사기를 얼음처럼 차가운 냉각 블록으로 감쌉니다. 1~2분 후, 시편 주사기를 자동 슬라이서에 장착하고 새 칼날을 정렬합니다. 다음으로, 버퍼 탱크를 차가운 PBS로 채웁니다.스텝 모터 드라이브를 시료 주사기와 정렬한 후 테이프를 제거합니다. 스텝 모터 드라이브가 플런저 뒷면에 닿을 때까지 스위치를 고속 전진 위치로 돌립니다. 슬라이서에서 조직 두께, 연속 단일 절편, 진동 및 속도 설정을 지정합니다.그런 다음 시작 버튼을 누르고, 얇은 스패튤라를 사용하여 버퍼 탱크로 떨어지는 각 PCLS를 수집하여 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 24웰 플레이트의 개별 웰에 슬라이스를 넣습니다. 정적 PCLS 이미징의 경우, 관심 있는 해부학적 영역이 포함된 폐 샘플을 해당 항체 칵테일 1 mL가 담긴 개별 3 cm 디쉬로 옮깁니다. 빛을 차단한 상태에서 로킹하며 얼음 위에서 30~60분간 반응시킨 후, 얼음처럼 차가운 PBS 1 mL로 슬라이스를 두 번 헹굽니다.다음으로, 샘플당 하나의 새로운 3cm 원형 유리 바닥 디쉬에 PBS 50 µL를 넣고, 슬라이스를 각 방울 속으로 빠르게 옮긴 뒤 조직 조각들이 평평하게 펼쳐지도록 부드럽게 조절합니다. 그다음 피펫으로 PBS를 흡입하여 제거하고, 슬라이드 위에 실온의 마운팅 매질 한 방울을 떨어뜨린 후 유리 커버슬립을 덮습니다. 조직을 이미지화하려면 디쉬를 20x 대물렌즈 아래의 공초점 현미경 스테이지 위에 놓고, 타일 툴의 convex hull 설정을 사용하여 조직의 가장자리를 찾아 표시함으로써 타일 스캔 시간을 단축합니다.그런 다음 z-스택 범위를 설정하는데, 설정된 범위가 슬라이스의 여러 영역, 특히 가장자리를 따라 적절하게 적용되는지 주의 깊게 확인하십시오. 살아있는 세포 이미징의 경우, 원하는 항체 칵테일에서 30분 동안 배양한 후, 차가운 Leibovitz 10 1 mL로 슬라이스를 두 번 헹굽니다. 다음으로, 샘플당 챔버형 커버 글라스의 한 슬롯에 신선한 Leibovitz 10 50 µL를 넣고, 즉시 각 PCLS를 배지로 옮긴 후 조직이 평평하게 펴질 때까지 부드럽게 조작하십시오.그런 다음 피펫을 사용하여 각 챔버에서 배지를 흡입하고 백금 무게추로 각 PCLS를 고정합니다. 새로 준비한 얼음처럼 차가운 세포외 기질을 각 PCLS 위에 조심스럽게 피펫팅하며, 겔이 폐 슬라이스 위에 놓이도록 하고 슬라이스가 겔 위에 뜨지 않도록 주의합니다. 37 °C에서 5분 후, 슬라이드를 20x 대물렌즈 하에서 37 °C로 설정되어 미리 가온된 공초점 현미경 챔버로 옮깁니다.그런 다음, 프레임 간의 원하는 간격을 기준으로 z-stack 및 타일 범위를 설정하며, 타일 도구를 사용하여 조직 내 관심 영역을 지정하고, 중앙 그리드 설정을 통해 시야 중앙에 샘플을 배치합니다. CD11b high conventional dendritic cells는 폐 실질에 위치하는 반면, CD103 positive conventional dendritic cells는 주로 기도 주변과 흉막하 영역에 거주합니다. CD88 및 CD172a에 대한 공동 염색을 통해, CD172a negative 및 CD88 positive인 폐포 대식세포와 CD172a positive 및 CD88 positive인 간질 대식세포를 구분할 수 있으며, 후자는 상피하 영역이 아닌 실질에 우선적으로 위치합니다.잘 알려진 T세포 마커인 CD90.2와 림프관 생성에 필수적인 마스터 전사 인자의 전사 조절 하에 있는 트랜스진인 TdTomato 형광 단백질을 공동 표지함으로써 폐 내의 림프 구조를 용이하게 식별할 수 있습니다. CD103 양성 conventional dendritic cell은 CD324를 발현하는 기도 상피, 림프관 및 흉막 하 영역을 포함한 여러 해부학적 부위에서 발견됩니다. 방금 시연한 바와 같이, 살아있는 세포 이미징을 통해 세포의 이동 및 세포 간 상호작용을 기록할 수 있습니다.예를 들어, 대표적인 실험에서 경구 ova-LPS 투여 16시간 후, 4시간 동안 입양 전이된 ova 특이적 T세포와 상호작용하는 CD103 양성 수지상 세포를 명확하게 관찰할 수 있습니다. 숙련된 경우, 조직 준비와 슬라이싱 기술을 적절하게 수행한다면 2시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 아가로스 폐 팽창을 충분히 유도하고, 이후 이미징을 위해 섬세한 폐 슬라이스를 최대한 평평하게 유지하는 것이 중요합니다.이 절차에 이어, 아세틸콜린 또는 메타콜린으로 PCLS를 처리하는 것과 같은 다른 방법들을 수행하여 다양한 질환 상태에서의 칼슘 신호 전달 및 기도 수축성에 관한 추가적인 의문점들을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 폐 내 면역 세포의 국소화, 이동 및 상호작용을 시각화하기 위한 정밀 절단 폐 슬라이스를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

우리는기도를 통해 anesthetized 생쥐의 폐에 시험 물질의 비 수술 전달을 보여줍니다. 이 방법은 세균과 바이러스 병원균, 크린 시토킨, 항체, 구슬, 화학, 또는 염료로 폐 노출 수 있습니다. 우리는 더 이상 수확 및 유동세포계측법에 대한 폐, 폐 배수 림프절 (LDLNs) 처리 설명합니다.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수...

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

이 비디오는 폐 선암 세포의 PD-L1 발현을 연구하기 위한 유세포 분석을 위한 마우스 폐 세포 현탁액의 준비에 대해 설명합니다.

유세포 분석을 위한 마우스 폐 준비: 유세포 분석을 위한 폐 조직에서 세포 현탁액 생성

여기에 제시된 PCLS 뮤린 폐 조직의 혈관 수축을 보존하기 위한 프로토콜이 있으며, 그 결과 수많은 절차에 취약한 최대 10일 동안 보존될 수 있는 폐 혈관 및 기도의 정교한 입체 이미지가 생성된다.

정밀 절단 폐 슬라이스는 전 생체 폐 혈관 구조 및 수축 연구를위한 효율적인 도구로

이 연구에서, 우리는 뮤린 호흡기의 면역 집단을 분리하기위한 효과적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 9 색 기반 유세포 측정 패널을 사용하여 건강한 마우스의 폐에 존재하는 모든 선천적 및 적응 면역 세포를 확인하는 방법을 제공합니다.

뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.

정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구

여기에서는 Isolectin B4의 단일 염색을 사용하여 전체 마우스 폐 조직에 대한 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량화를 수행하는 간단하고 경제적인 프로토콜을 설명합니다.

소엽에 걸친 생쥐의 폐 미세혈관 밀도 정량화

우리는 형광 현미경을 통한 분석을 위해 폐 기도에서 곰팡이 포자의 자연스러운 위치를 보존하는 곰팡이 발병 모델에 대한 방법을 제시합니다.

기도에서 곰팡이 포자의 공간 역학을 보존하는 쥐 폐를 이미징하는 효율적인 방법

배우세요 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS) 기법을 이용하여 마우스 폐에서 면역 세포의 위치와 이동 패턴을 실시간으로 관찰하는 방법. 이 기술은 폐 면역학 연구와 염증 반응 분석에 활용됩니다.

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

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