pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

이 형광 이미징 방법의 전반적인 목표는 막 단백질 이동 및 세포 내 분포의 변화를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 세포 표면의 소포 전달 속도 및 단백질 발현 속도에 대한 유전적 돌연변이 또는 약리학적 제제의 영향과 같은 단백질 이동의 변화에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 샘플을 손상시키지 않고 고해상도로 실시간으로 신속하게 측정을 수행할 수 있다는 것입니다.

이미징 48시간 전에 마우스 신경모세포종 2A 세포는 관심 단백질의 세포외 영역에 통합된 pH 민감성 형광체인 SEP를 포함하는 플라스미드 구조체로 transfection됩니다. 형질주입된 세포를 이미징할 준비가 되면 전사 형광 또는 TIRF 현미경을 사용하여 pH 7.4 세포외 용액 또는 ECS 2ml를 세포에 추가합니다. 번역 스테이지에 세포 접시를 놓고 스테이지 마운트를 사용하여 접시를 제자리에 고정합니다.

epifluorescence 모드에서 현미경의 초점을 맞추고 형광 transfection된 세포를 찾습니다. 셀은 여러 초점 평면에 걸쳐 집중된 상태로 유지됩니다. TIRF를 진행하기 위해 분리된 단일 세포를 찾습니다.

이미징 프로그램에서 노출 시간을 200밀리초로 설정하고 EM 게인을 설정하여 형광 강도를 최적화합니다. Stepper 모터를 사용하여 레이저 빔을 TIRF로 변환하여 대물렌즈를 가로질러 빔을 단계적으로 변환합니다. 임계각이 접근함에 따라 빔은 샘플 평면의 전체 내부 반사 지점에서 수렴할 때까지 접시의 가장자리를 가로질러 가시적으로 이동하며, 이 시점에서 접시의 가장자리를 따라 빔이 더 이상 보이지 않습니다.

초점 노브를 조정하여 셀이 TIRF 모드에 있는지 확인합니다. TIRF에서는 한 면의 세포만 초점을 맞출 수 있어 원형질막의 고해상도로 고도로 정의된 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 이미징 평면에서 건강한 transfection된 단일 세포를 찾습니다.

pH 7.4에서 세포의 초점이 맞춰진 이미지를 획득합니다. 원형질막(plasma membrane)과 소포체(endoplasmic reticulum)에 있는 SEP 표지된 수용체가 보여야 합니다. 레이저 빔이 샘플에 도달하는 것을 빠르게 차단하여 광 표백을 방지합니다.

여러 XY 위치를 기록할 수 있는 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 각 셀에 해당하는 스테이지 위치를 기록하십시오. 이러한 방식으로 접시당 20-30개의 세포 이미지를 캡처하는 동시에 소프트웨어를 사용하여 각 세포의 위치를 기록합니다. ph 7.4에서 모든 세포 이미지를 수집한 후 접시를 건드리지 않고 피펫팅을 통해 pH 7.4 ECS를 수동으로 제거합니다.

접시에 pH 5.4 ECS 2ml를 조심스럽게 넣고 10분 동안 기다립니다. 이 시간 동안 이전에 획득한 이미지를 저장하십시오. pH 7.4에서 이미지를 수집하는 데 사용되는 것과 동일한 조건에서 스테이지를 저장된 각 위치로 이동하고 pH 5.4에서 동일한 셀의 이미지를 획득합니다.

검출된 모든 형광은 소포체에 국한된 SEP 표지 수용체에서 비롯되기 때문에 세포는 덜 정의된 것처럼 보여야 합니다. pH 5.4 세포 이미지를 저장합니다. 단일 소포 삽입을 이미지화하려면 먼저 형질주입된 세포의 성장 배지를 2mL의 pH 7.4 ECS로 교체합니다.

다음으로, 형질주입된 세포의 접시를 현미경의 스테이지에 놓고 스테이지 마운트를 사용하여 접시를 제자리에 고정합니다. 앞에서 설명한 것처럼 TIRF에서 단일 세포에 초점을 맞춥니다. 장착된 경우 이미징 기간 동안 초점이 벗어나지 않도록 자동 초점을 설정합니다.

일련의 1, 000 프레임을 기록하고 200 밀리 초의 프레임 속도로 이미지를 연속적으로 캡처합니다. 이 기간 동안 형광의 폭발을 볼 수 있으며, 이는 원형질막과 융합하는 낮은 pH 트래픽 소포에 해당하여 SEP를 세포 외 pH 7.4에 노출시킵니다. 세포 내 국소화를 결정하기 위한 SEP 형광 분석을 시작하려면 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 이미지를 엽니다.

롤링 볼 설정을 사용하여 pH 5.4 및 pH 7.4 이미지에서 배경을 뺍니다. pH 7.4에서 단일 세포의 형광을 정량화하기 위해 강도 기반 임계값을 사용하여 먼저 이미지를 선택하고 조정한 다음 임계값을 선택합니다. 그런 다음 셀 주위의 관심 영역을 수동으로 선택합니다.

Analyze(분석) 탭 아래에 내장된 측정 기능을 사용하여 세포 면적, 평균 강도 및 통합 밀도를 측정합니다. pH 5.4에서 동일한 셀에 대해 이러한 측정을 반복합니다. pH 7.4 및 5.4 모두에서 세포 이미지에 대한 통합 밀도를 얻은 후 pH 7.4 값에서 pH 5.4 값을 빼서 원형질막 통합 밀도를 계산합니다.

이 차이는 TIRF 여기 영역 내의 원형질막에 있는 수용체의 상대적 수에 해당합니다. 이동의 척도로, 원형질막 집적 밀도를 pH 7.4의 총 집적 밀도로 나누고 100을 곱하여 TIRF 여기 부피에서 볼 수 있는 나머지 수용체와 비교하여 원형질막에 위치한 SEP 표지 수용체의 상대적 백분율을 계산합니다. 단일 소포 삽입 이벤트를 분석하려면 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 일련의 1, 000 TIFF 이미지를 엽니다.

롤링 볼 설정을 사용하여 모든 프레임에서 배경을 뺍니다. 녹음의 색상 균형을 조정하여 소포 삽입 이벤트에 해당하는 강렬한 영역을 최대화합니다. 3프레임 또는 600밀리초 이상 지속되는 형광 폭발을 수동으로 계산합니다.

pH 7.4에서 세포 이미지의 이 예는 원형질막과 소포체에 위치한 수용체를 보여줍니다. pH 5.4에서는 원형질막의 수용체가 형광을 발하지 않기 때문에 소포체 상주 수용체만 보입니다. pH 7.4와 pH 5.4에서 형광의 통합 밀도 차이는 원형질막에 국한된 수용체에 해당합니다.

단일 소포 삽입 이벤트는 pH 7.4에서 원형질막에서 최소 600밀리초 동안 지속되는 형광 폭발로 시각화됩니다. 삽입 직전에는 눈에 띄는 파열이 없습니다. 형광 강도의 증가는 SEP를 운반하는 수송 소포가 도착함에 따라 보입니다.

그런 다음 SEP 표지된 수용체는 이전에 삽입된 수용체와 구별할 수 없을 때까지 원형질막을 가로질러 확산됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 요리당 45분 안에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 말초 ER과 원형질막 사이의 단백질 분포 변화를 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.