Name: pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 TIRF 현미경과 pHluorin 태그를 활용한 막단백질 세포내 분포 및 소포 이동 실시간 모니터링 방법을. 마우스 신경모세포에서 고해상도 단백질 역학을 정량 분석합니다.

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이 작업은 National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817 및 National Institute on Drug Abuse DA 040047의 일부 지원을 받았습니다.

1. 세포 배양 및 형질 <ol><li> 성장 미디어에서 마우스 신경 모세포종의 2A (N2A) 세포를 유지한다. <ol><li> 높은 혈당 200 ml의 둘 베코의 이글 배지 (DMEM)에서 500 ml의 N2A 성장 미디어를 확인, 250 ml의 혈청 미디어, 50 ml의 소 태아 혈청 (FBS)를 감소, 5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 배). </li><li> 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 T75 플라스크에 세포를 유지한다. </li><li> 분할 세포 1시 15분 필요한 경우, 또는 약 80~90%의 포화 상태. 이것은 일반적으로 2 ~ 3 회입니다. </li></ol></li><li> 코트 35mm 유리 폴리 D 라이신과 바닥 접시. <ol><li> 층류 바이오 안전성 캐비닛에 멸균 35mm 요리의 유리 바닥 지역에 0.1 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 DDH으로 2 O 3 ~ 4 회 접시를 씻어. </li><li> 이상 1 시간 동안 요리에 완전히 건조 할 수 있습니다. </li><li> Steril필요한 경우 바이오 안전성 캐비닛에 UV 광을 사용하여 요리를이지는. </li></ol></li><li> TIRFM 이미징 N2A 세포를 플레이트. <ol><li> 부착 세포에서 성장 미디어를 제거합니다. </li><li> 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 5 분 동안 1 ㎖의 1X 트립신 (+ EDTA)로 배양하여 플라스크로부터 세포를 분리. </li><li> 9 ml의 성장 배지를 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다. 피펫을 사용하여 미디어, 트립신 및 분리 된 세포를 섞는다. </li><li> 시각적으로 혈구를 사용하여 세포 수를 계산하고 각 폴리 D 라이신 코팅 유리 바닥 접시에 90,000 세포를 추가 할 수있는 올바른 볼륨을 계산합니다. 이 밀도는 효율적인 형질 전환 및 단일 세포 TIRF 이미징이 필요합니다. </li><li> 90,000 세포를 포함하는 각각의 유리 바닥 접시에 2 ml의 성장 매체를 추가합니다. </li><li> 16 ~ 24 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 접시를 품어. </li></ol></li><li> N2A 형질 전환 <ol><li> 인용의 SEP 형광 물질을 함유하는 플라스미드 구조체를 구하는관심있는 단백질의 세포 외 영역으로. 이러한 PCR 증폭 5 표준 클로닝 기술이 구조를 생성하는데 사용될 수있다. 주 : 소포체 또는 피킹 소체의 루멘 내에 존재하고 세포막의 세포 외 용액에 노출되도록 9월 멤브레인 단백질의 세포 외 영역에 포함되어야한다. GFP와 유사한 클로닝 전략을 사용할 수있다 SEP에서 크기가 유사하다. </li><li> 1.5 ㎖의 혈청 감소 배지 도금 세포상의 성장 배지를 교환 (예하는 Opti-MEM), 약 30 분간 형질 감염 시약을 첨가하기 전에. 주 : 수용체에서 약물 유도 된 변화를 연구하기 위해, 약물의 적절한 농도가 트랜시에 첨가 할 수있다. </li><li> 250 μL로 감소 혈청 미디어 구성 원하는 각 플라스미드의 500 NG를 추가 (튜브 1). </li><li> 별도의 튜브 C로 형질 전환 시약의 2 μl를 추가감소 혈청 미디어의 ontaining 250 μL. 5 분 동안 실온에서 튜브 (2)를 부화. 플라스미드 DNA를 형질 전환 시약의 비율은 관심있는 각각의 단백질을 발현하도록 최적화되어야한다. </li><li> 형질 전환 시약 플라스미드 혼합물 500 μl를 함유 한 용액을 만들 튜브 1과 2를 결합. 25 분 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 접시 당 2 ML의 총 부피의 500 ㎕를 형질 혼합하는 사전 도금 셀을 추가합니다. </li><li> 24 시간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 24 시간 후, 형질 믹스를 제거하고 성장 배지로 세포를 씻어 각 접시에 성장 배지 2 ㎖를 추가합니다. 주 : 약물 트랜시에 첨가하면,이 단계에서 다시 보충 할 수있다. </li><li> 24 시간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 이미지 세포 형질 전환 후 48 시간. </li></ol></li></ol> 전체에서 2. 라이브 셀 이미징영원한 반사 형광 현미경 (TIRFM) <ol><li> 이미징 설정 <ol><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 스캐닝 스테이지 반전 형광 현미경 설정하여 촬상을 수행한다. 이것은 488 나노 DPSS 레이저 소스의 정렬을 필요로하는, 스테퍼 모터는 488 nm의 빔 위치 및 높은 개구 수 (NA 1.49) 60X 또는 100X 오일 침지 목적을 조정한다. </li><li> 적절한 여기 필터 (대역 통과 10분의 488 ㎚)를 통해 레이저 빔을 통과한다. 스테퍼 모터에 장착 된 실행 프로그램에 연결된 단일 모드 광섬유를 통해 편광 된 레이저 빔을 맞추고. 표면 형광 모드에서 여기 빔은 대물의 뒤쪽 개구의 중앙을 중심으로한다. </li><li> 임계각에 도달되지 않고 빔이 더 이상 샘플 투과 대신 완전히 유리 CEL 반사까지 TIRF을 달성하기 위해, 대물 렌즈의 후방 개구에 걸쳐 레이저 광을 집광 번역 스텝 모터를 사용리터 인터페이스를 제공합니다. </li><li> 적절한 방출 필터 이미징 소프트웨어 (예 MetaMorph로부터)로 제어되는 EMCCD (512 X 512 픽셀)을 이용하여 캡처 이미지가 배출 통로에 설치 (50분의 525 ㎚). </li></ol></li><li> 이미징 솔루션을 준비 <ol><li> DDH 150 mM의 NaCl을 4 mM의 KCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를 10 mM의 HEPES 및 10 mM의 글루코스를 혼합함으로써 200 ㎖의 세포 외 용액 (ECS)를 준비 2 O. 원액의 NaCl, KCl을,의 MgCl 2, 및 CaCl2를 미리 준비하고, 촬영의 일 신선한 HEPES 포도당과 결합 될 수있다. </li><li> pH 7.4의 100 ml의 ECS를 포함하는 용액의 pH를 조정합니다. 5.4의 pH에 ​​ECS의 나머지 100 ㎖를 조정합니다. ECS 2 ㎖ (PH 7.4)로 형질 감염된 세포를 씻어. </li><li> 촬영하기 전에 형질 감염된 세포에 ECS의 2 ㎖ (산도 7.4)를 추가합니다. </li></ol></li><li> TIRF의 라이브 세포 이미징 <ol><li> includin, 전체 시스템을 켭니다g 488 nm의 레이저, 카메라, 번역 단계, 및 이미징 프로그램입니다. 표면 형광 빔을 초점과 60X 목표에서 약 1 mW의 전원을 조정합니다. </li><li> 목적에 기름을 추가하고 번역 무대에서 형질 감염된 세포의 접시를 배치합니다. 세포가 여러 차례 묘화 할 수 있도록 스테이지에 대하여 이동하지 않도록하는 단계 마운트를 사용하여 제자리에 고정 접시. </li><li> 표면 형광 모드에서, 초점 현미경 및 형광 형질 감염된 세포를 찾아. 세포는 여러 초점면에 걸쳐 초점을 맞춘 상태로 유지됩니다. TIRF를 진행하는 하나의 분리 된 세포를 찾습니다. </li><li> 촬상 프로그램에서 200 밀리 초에 대한 노출 시간을 설정하고, EM 게인을 설정함으로써, 형광 강도를 최적화한다. </li><li> 스텝 모터를 이용하여 단계적으로 대물 걸쳐 광을 변환하여 TIRF에 레이저 빔을 전환. 이 일에 수렴 할 때까지 임계각 방식으로, 상기 빔은 가시적 접시의 가장자리에 걸쳐 번역 할샘플 평면에 총 내부 반사의 전자 점. </li><li> 세포가 초점 노브를 조정하여 TIRF 모드에 있는지 확인합니다. TIRF에서, 셀의 한면은 세포막의 고해상도 매우 정의 이미지를 생성한다 (유리 인터페이스 즉, 약 150 나노 미터)에 집중 될 수있다. </li></ol></li><li> 세포 내 현지화를 결정하는 영상 9월 <ol><li> 이미징면에서 건강하고, 형질 전환, 단일 세포를 찾습니다. </li><li> pH가 7.4에서 셀의 초점을 맞춘 이미지를 획득. -9 월 표시되어야합니다 세포막과 소포체에 대한 수용체를 표시. </li><li> 신속 광표백을 방지하기 위해 시료에 도달하는 레이저 빔을 차단. </li><li> 다수의 XY 위치를 기록 할 수있는 현미경 영상 소프트웨어를 사용하여 각 셀에 대응하는 상기 스테이지의 위치를 ​​기억. </li><li> 소프트웨어를 사용하는 동안 접시 당 20 ~ 30 세포 단계를 반복 2.4.1-2.4.4 각 셀의 위치를 ​​기록합니다. </li><li> AFpH 7.4의 모든 셀 이미지 수집 터 수동 피펫을 이용하여 pH를 7.4 ECS 용액을 제거한다. 이 기억 된 무대 위치를 이동할 수 있기 때문에 접시를 만지지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 접시에 pH가 5.4 ECS 2 ㎖를 추가하고 10 분을 기다립니다. 이 기간 동안, 이전에 획득 된 영상을 저장합니다. </li><li> , pH 7.4의 영상을 수집 저장된 각 위치로 상기 스테이지를 이동하여 pH 5.4에서 동일한 셀의 이미지를 획득하는 데 사용되는 조건과 동일한 조건에서. 모든 검출 된 형광 수용체를 표시 9월 제한 소포체에서 발생하기 때문에 세포는 덜 정의 보일 것입니다. pH가 5.4 셀 이미지를 저장합니다. </li></ol></li><li> 라이브 세포 이미징 하나의 소포 삽입 이벤트 <ol><li> 2 ml의 pH가 7.4 ECS로 형질 세포의 성장 매체를 교체하거나 라이 보 비츠의 L-15 미디어. 라이 보 비츠의 L-15 미디어의 pH는 필요한 경우 화상을 장시간에 걸쳐 수행 될 수 있도록, CO 2 독립적이다. </li><li> PLAC현미경의 무대에 형질 전환 세포의 접시를 전자. 안전하고 위의 단계 2.3 다음 TIRF의 단일 셀을 초점을 맞추고있다. </li><li> 장착하면 초점이 영상의 기간 동안 표류하지 않도록, 자동 초점을 설정합니다. </li><li> 연속적으로 200 밀리의 프레임 레이트로 이미지를 캡처, 1000 일련의 프레임을 기록한다. 형광의 버스트는 세포 외 pH를 7.4로 9월 노출, 세포막과 융합 낮은 pH 밀매 소포에 해당하는이 시간 동안 볼 수 있습니다. </li><li> 또 다른 하나의 셀을 찾아 위의 단계를 반복합니다. 필요한 경우 자동 초점을 재설정합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 분석 및 데이터 처리 <ol><li> 9월 형광 분석은 세포 내 현지화를 결정 <ol><li> 이러한 MetaMorph로부터 또는 ImageJ에 (http://imagej.nih.gov/ij/)와 같은 영상 분석 소프트웨어를 이용하여 세포 영상을 연다. 롤링 볼의 설정을 사용하여 모두의 pH 5.4와 pH 7.4의 이미지에서 배경을 뺍니다.</li><li> 하나의 세포에서 형광을 정량화하는 강도 기반 임계 값을 사용합니다. 수동으로 pH 7.4의 이미지 셀 주위의 관심 영역을 선택합니다. </li><li> , 셀 면적을 측정 강도를 의미하고, 통합 밀도 ImageJ에있는 플러그인을 사용하거나이 분석 탭에서 &quot;측정&quot;기능 내장 사용. </li><li> 신중 마찬가지로 관심 강도 계 임계 영역과 조절, pH를 5.4에서 동일한 셀 3.1.1-3.1.3 단계를 반복한다. </li><li> 집적 밀도는 모두 7.4의 pH 5.4에서 세포 이미지 획득 후, pH 7.4의 값에서 5.4의 pH 값을 감산하여 세포막 집적 밀도를 계산한다. 차이점은 TIRF 여기 영역 내의 플라즈마 막에 대하여 수 수용체에 대응한다. </li><li> 피킹의 척도로 9 월의 상대적인 비율은 TIRF의 excitati 보이는 나머지 수용체에 비해 세포막에있는 수용체를 표지 계산100을 곱한 pH를 7.4 총 집적 밀도 밀도 집적 세포막을 분할하여 볼륨. </li></ol></li><li> 하나의 소포 삽입 이벤트를 분석 <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 1000 TIFF 이미지 시리즈를 연다. 롤링 볼 설정을 사용하여 모든 프레임의 배경을 뺀다. </li><li> 삽입 이벤트 소포에 대응하는 강한 영역을 최대화하기 위해, 기록의 색 밸런스를 조정한다. 수동으로 이상 3 프레임 (&gt; 600 밀리 초)을 지속 형광의 버스트를 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

9월의 pH 민감성은 세포막에 존재하는 수용체 소포체에서 세포 수용체와 구별 될 수있게하고, 그 삽입 이벤트를 해결하는 데 사용될 수 수용체 담지 소체 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . 표면 바이오 틸 리간드 등 여러 가지 기술이 널리 단백질 표면 레벨을 측정하기 위해 사용되는 바인딩. 어떤 경우에는, 웨스턴 블랏은 ER 및 PM 상주 단백질을 구별하는데 사용될 수있다. 이 9 월 기반 기술은 표면 발현을 빠르게 판독 및 PM의 ER에 지역화 된 단백질의 변화를 정량화하는 능력을 제공하고, 기존의 측정에 ...

수용체 발현, 배포 및 조립 변화는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 낭포 성 섬유증, 및 약물 중독 1, 2, 3, 4, 5를 포함하여 질병의 다양한 접속되어있다. 예를 들어, 니코틴 및 다른 니코틴 성 리간드 피킹, 식, 및 상향 조절 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10의 변화 선도 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChRs)의 피킹에 영향을 미친다. 니코틴은 셀 내에 조립 nAChRs의 총 개수를 증가 원형질막으로 피킹을 증가시키는D 일부 아형 고감도 버전을 선호 단위체 어셈블리를 변화시킨다. 질병 모델에서 인신 매매, 어셈블리 및 수용체의 발현에 뚜렷한 변화를 해결하는 것은 약물 표적을 정의하는 데 필수적인 중요한 기계적인 세부 사항을 제공합니다. 이상적인 방법은 빠른 속도로 세포 내 수용체와 세포막에 지역화 된 그 구별 것이다. 이것은 특정 단백질의 대부분은 nAChRs와 마찬가지로, 세포 내에서 존재하는 경우에 특히 도전적이다. nAChRs의 대부분 소포체 로컬 라이즈되기 때문에, 기존의 측정은 분비 경로를 따라 위치 파악 및 피킹 변화를 파악하는 데 필요한 공간 - 시간 해상도 부족하다. nAChRs의 수용체 인신 매매와 표현 연구는 주로 11 방사능 리간드 결합, 바이오 틸 분석 (12), 웨스턴 블롯 (13), 또는 면역 침전의 techniq를 사용하여 수행되었다<html> 단말 (12). 이러한 세포의 리포터 분자 또는 고정의 결합 특이성에 의존하는 동시에 세포막 거주자 세포 수용체를 구분할 수있는 능력이 부족하다. 따라서, 이온 채널 조립 및 소포 역학 연구는 크게 낮은 처리량 전기 생리학 기술 (14)에 의존하고있다. 뛰어난 공간 및 시간 해상도는 형광 현미경의 발전으로 가능하다. 이러한 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그 변종과 같은 유전자 인코딩 된 기자 분자는, 비특이적 결합 문제를 제거하고 감도 (15)을 증가시킨다. superecliptic pHluorin SEP ()로 알려진 GFP의 pH에 민감한 변형은, 현지화 5, 7, 8 결정하는 세포 내 구획 사이 고유의 pH 차이를 악용 할 수 있습니다REF &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. -9 월 pH가 6 이상이되면 형광, 그러나 낮은 pH에서 오프 상태로 유지된다. 따라서, 그 내강 측 9월 태그 수용체 소포체에 존재하는 경우 검출되는 ( 트래픽 관리 소포에 국한 ER) 또는 원형질막 (PM)에 삽입시 아니지만. 세포막에 수용체와 접촉하는 세포 외 pH를 조작하면, 결과적으로 형광이 수용체 따라서 검출 바꾼다. 동일한 셀이면 순차적 중성 세포 외 pH를 6보다 낮은 다음 pH가 양쪽에서 촬상되어 이미지 차이는 세포막에있는 수용체에 기인한다. 이것은, 동시에 세포 측정 (주연 ER) 및 세포막 상주 수용체 5 허용 7,8 </suP&gt; 9. 세포 외 pH가 중성 일 때 단일 소포 삽입 이벤트는 해결 될 수있다. 낮은 pH를 피킹 소포는 세포막과 융합되면 소포의 내강 측 형광 7, 18, 19, 20의 버스트로서 검출 전환을 일으키는 중성 세포 외 용액에 노출된다. -9 월 원형질막 주변 소포체에 국부적 수용체의 측정을 가능하게하고, 이들의 세포 내 영역 5, 7, 18 간 수용체의 피킹을 측정하는 수단을 제공한다. 세포막에서 높은 해상도를 달성하기 위해, 유 전적으로 인코딩 9월와 수용체는 전반사의 형광 현미경 (TIRFM)에 의해 이미징된다. 이 방법은 특히 인유용한 수용체의 대부분은 TIRFM는 세포막의 시인성을 향상하기 때문에, 세포 내 영역에 국부적 인 경우. TIRFM는 오후에 삽입시 9 월 표지 수용체를 들고 하나의 소포의 인신 매매 역학의 해상도를 할 수 있습니다. 전반사는 셀과 유리 커버 슬립 (21, 22) 사이에서 서로 다른 굴절률을 가진 재료의 계면에서 발생한다. 유리 세포 용액의 계면에서 전반사를 달성하기 위해 배향되는 488 nm의 여기, 조사시 -9 월 형광. 이 샘플이 볼륨 내에서만 흥미 진진한 형광으로 약 150 nm의 침투 소멸 파를 생성합니다. 음원이 범위 내에서 중성 pH 환경에서 수용체를 함유 만 9월는 세포막 또는 주변 소포체에있는 것에 대응하는 검출된다. 검출 한정 t이기 때문에세포 내 영역에서 소멸 파, 배경 형광에 의한 O 여기 감소하고 신호대 잡음비가, 22 (21)을 증가시킨다. 또한, 상기 셀의 대부분을 관통하지 않는 방사선 때문에, 광 손상은 시간에 걸쳐 라이브 세포 이미징을 허용하는 최소화된다. 그 결과, SEP를 TIRFM은 분비 경로를 따라 막 수용체의 세포 내 위치 파악 및 피킹 동역학을 측정하기 위해 요구되는 높은 분해능과 감도를 제공 유전자 코드와 결합된다.

<table><tbody><tr><td>시약/재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크, 필터 캡 포함, sterile, Greiner Bio One, 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 유리 바닥 페트리 접시, sterile</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium&lrm; (DMEM), High Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-965-084&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 감소 세럼 중간</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼, 인증, 미국 원산지, 표준 (멸균 필터)&nbsp;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드 없음</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 배지, 페놀 레드 없음</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>선택적</td></tr><tr><td>리포펙타민</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td>부드럽게 섞는다. 소용돌이 하지 마십시오</td></tr> 염화<tr><td>나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-포도당</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>목표 이멀젼 오일&nbsp;</td><td>올림푸스</td><td>타입 F</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscope Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>60X, 1.49 NA 오일 이멀젼 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>전동 스테이지</td><td>이전</td><td>IXPROXY</td><td></td></tr><tr><td>전동 액추에이터(스테퍼 모터)</td><td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph(또는 기타 이미징 프로그램)</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488nm 레이저</td><td>Market Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단일 모드 광섬유</td><td>Thorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>미러</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>이색성 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>대역통과 필터, 488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>대역통과 필터, 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

phluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

이해 막 단백질 인신 매매, 조립, 표현은 세포 내 소기관에 거주하는 사람들과 세포막에 지역화 된 그 구별 접근 방식이 필요합니다. 전통적인 형광 기반 측정은 다른 소기관에 존재하는 막 단백질을 구별하는 능력이 부족하다. 최첨단 방법론은 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 pH에 민감한 형광 물질을 결합하여 전통적인 방법을 초월. TIRF 조명 따라서, 배경 감소, 신호 대 잡음 비를 증가하고, 분해능이 향상 글래스 샘플 계면으로부터 약 150 nm의 최대 샘플을 여기시킨다. TIRFM의 여진 볼륨은 주연 ER로 세포막 근처 소기관을 포함한다. Superecliptic pHluorin (-9 월) GFP의 pH에 ​​민감한 버전입니다. 유전자 관심의 세포막 단백질의 세포 외 도메인으로 구월 인코딩하는 형광에 대한 위치 결정을응급실과 세포의 세포 외 영역에서의 내강 쪽. -9 월 pH가 6보다 큰 경우 형광, 그러나 더 낮은 pH 값에서 오프 상태로 남아있다. 따라서, (PM) 플라즈마 막에서 소포체 (ER) 또는 삽입에 거주하는 경우 만 인신 매매 소포 또는 골지 같은 다른 세포 소기관에 국한하지 않을 경우 9월의 형광 태그 수용체. 세포 외 pH를 세포막에 수용체의 형광을 지시하기 위해 조정될 수있다. 동일한 셀의 중성 및 산성 pH에서 세포 TIRF 형광 이미지 간의 차이는 세포막에있는 수용체의 상대적인 수에 대응한다. 이 세포 내와 세포막 거주자 수용체의 동시 측정을 할 수 있습니다. 세포 외 pH가 세포막과 융합 형광 상태로 전환 낮은 산도 피킹 소포에 대응 중성 일 때 단일 소포 삽입 이벤트는 측정 할 수있다. 이 versatil전자 기술은 막 단백질의 현지화, 표현, 인신 매매를 연구하기 위해 이용 될 수있다.

수용체에 9월 법인은 라이브 셀에서 그 수용체의 직접 검출 할 수있다. TIRFM와 결합이 세포막과 TIRF 여기의 영역의 세포 내 위치에서 특정 수용체의 분포에 상대적 발현 수준의 평가를 허용한다. 단일 소포 인신 매매 사건도 해결할 수 있습니다. 플라즈마 멤브레인에 9 월 표지 수용체의 상대 식 수준 여진시의 SEP 형광은 주위 용액의 pH에 ​​의해 결정된다. 9월가 세포막 상주 수용체와 융합 될 때, pH는 세포에 5, 7, 8, <...

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

이 형광 이미징 방법의 전반적인 목표는 막 단백질 수송 및 세포 내 분포의 변화를 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 유전적 돌연변이 또는 약물이 소포 전달 속도와 세포 표면의 단백질 발현에 미치는 영향과 같은 단백질 수송의 변화에 대한 통찰을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 시료를 파괴하지 않고 고해상도로 실시간으로 빠르게 측정을 수행할 수 있다는 점입니다.이미징 48시간 전에 마우스 신경모세포종 2A 세포에 관심 단백질의 세포 외 영역에 통합된 pH 민감성 형광체인 SEP를 포함하는 플라스미드 구조물을 트랜스펙션합니다. 트랜스펙션된 세포가 전반사 형광 또는 TIRF 현미경 이미징 준비가 되면, 세포에 pH 7.4의 세포 외 용액(ECS) 2mL를 첨가합니다. 세포가 담긴 디쉬를 이동 스테이지 위에 놓고, 스테이지 마운트를 사용하여 디쉬를 고정합니다.에피형광 모드에서 현미경의 초점을 맞추고 형광이 발현된 형질전환 세포를 찾습니다. 세포는 여러 초점 평면에서 초점이 유지된 상태로 보일 것입니다. TIRF를 진행하기 위해 단일하게 분리된 세포를 찾으십시오.이미징 프로그램에서 노출 시간을 200 milliseconds로 설정하고, EM gain을 조절하여 형광 강도를 최적화합니다. 스테퍼 모터를 사용하여 레이저 빔을 대물렌즈 가로 방향으로 단계적으로 이동시켜 빔을 TIRF 모드로 전환합니다. 임계각에 가까워짐에 따라 빔이 디쉬 가장자리를 따라 눈에 보이게 이동하며, 샘플 평면에서 전반사가 일어나는 지점에 수렴하면 디쉬 가장자리를 따라 더 이상 빔이 보이지 않게 됩니다.초점 조절 노브를 조정하여 세포가 TIRF 모드에 있는지 확인하십시오. TIRF에서는 세포의 단일 평면만 초점을 맞출 수 있어, 세포막의 고해상도이며 매우 선명한 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 이미징 평면에서 건강하게 형질전환된 단일 세포를 찾으십시오.pH 7.4에서 세포의 초점 영상을 획득합니다. 세포막과 소포체에 있는 SEP 표지 수용체가 보여야 합니다. 광퇴색을 방지하기 위해 레이저 빔이 샘플에 닿지 않도록 빠르게 차단하십시오.여러 XY 위치를 기록할 수 있는 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 각 세포에 해당하는 스테이지 위치를 기록하십시오. 이러한 방식으로, 소프트웨어를 통해 각 세포의 위치를 기록하면서 디시당 20~30개의 세포 이미지를 캡처하십시오. pH 7.4에서의 모든 세포 이미지 수집이 완료되면, 디시에 닿지

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

우리는 여기에서 pH 에 민감한 녹색 형광 단백질 변이체, pHluorin의 사용을 설명, 축 슨 유도 수용체의 스파티오-측두동역학을 연구 하는 세포 표면에 인신 매매. pHluorin 태그 수용체는 병아리 배아의 전기 기공을 사용하여 세포 배양 및 생체 내에서모두 표현된다.

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

여기에서는 형광 측정 방법을 사용하여 부착 대식세포 세포주에 의한 형광 입자의 식세포작용을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 입자 내부화의 고처리량 정량화와 그에 따른 액틴 중합화를 용이하게 합니다.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

배우세요 TIRF 현미경과 pHluorin 태그를 활용한 막단백질 세포내 분포 및 소포 이동 실시간 모니터링 방법을. 마우스 신경모세포에서 고해상도 단백질 역학을 정량 분석합니다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

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