유전자 인코딩 된 형광 산화 질소의 응용 프로그램 (• NO) 단일 세포에서 NO • 신호의 실시간 이미징을위한 프로브의 geNOps,

이 이미징 접근 방식의 전반적인 목표는 유전적으로 암호화된 새로운 종류의 형광 산화질소 프로브인 geNOps를 사용하여 개별 세포 수준에서 산화질소 신호를 실시간으로 모니터링하는 것입니다. 생물학 및 생리학에서 산화질소의 중요성을 고려할 때, 이 분자가 발견된 이래로 세포 또는 심지어 세포 이하 수준에서 이 분자의 시각화가 요구되어 왔습니다. 우리는 새롭고 다소 간단하게 제작된 형광 단백질 기반 프로브인 geNOps를 사용하여 산화질소 신호를 시각화합니다.

geNOps는 형광 소멸에 의해 산화질소에 직접적이고 즉각적으로 반응합니다. 이는 단일 세포에서 산화질소의 생성, 확산 및 분해에 대한 실시간 역학을 모니터링할 수 있음을 의미합니다. geNOps의 주요 장점은 기존의 형광 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도로 산화질소 신호를 실제로 볼 수 있다는 것입니다.

실온에서 내피 세포주 또는 HEK293 세포의 저장 완충액을 철(II) 부스터 용액의 웰당 1밀리리터로 교체하여 이 절차를 시작합니다. 어둠 속에서 정확히 20분 동안 세포를 배양합니다. 철 로딩 절차는 프로브의 완전한 응답성을 얻는 데 필수적이며 다양한 셀 유형 및 응용 분야에 맞게 조정할 수 있습니다.

그 후, 저장 버퍼로 세포를 한 번 세척하고 세포가 평형을 이룰 수 있도록 실온에서 최소 2시간 동안 2ml의 저장 버퍼로 각 웰을 배양합니다. 그런 다음 1ml의 저장 버퍼에서 저장 버퍼를 3.3마이크로몰 Fura-2AM으로 교체합니다. 세포를 빛으로부터 보호하고 45분 동안 배양합니다.

45분 후, 저장 버퍼로 세포를 두 번 세척하고 세포가 평형을 이룰 수 있도록 최소 30분 동안 다시 한 번 배양합니다. 절차를 시작하려면 먼저 금속 관류 챔버에 내피 세포주 또는 HEK293 세포로 코팅된 30mm 커버슬립을 고정합니다. 이미징 시스템을 켠 다음 금속 관류 챔버를 현미경에 놓습니다.

유입 튜브를 버퍼 저장소에 연결한 다음 관류 시스템을 켭니다. 이제 유출물을 진공 펌프에 연결하여 일관된 흐름을 보장하고 커버슬립의 배수를 방지합니다. 반자동 관류 시스템을 사용하여 생리학적 칼슘 완충액으로 중력 구동 관류를 시작합니다.

그런 다음 해당 소프트웨어를 사용하여 이미징 설정을 정의합니다. Fura-2 이미징의 경우 340나노미터 및 380나노미터의 여기 파장을 선택하고 G-geNOp를 자극하려면 480나노미터의 여기 파장을 선택하십시오. 다음으로, 여러 형광 세포에 초점이 맞춰질 때까지 현미경의 xyz-테이블을 이동하여 이미징 영역을 선택합니다.

그런 다음 관심 영역을 정의합니다. 각 이미징 필드에 대해 여러 개의 전체 단일 형광 세포를 포함하는 영역을 그립니다. 그런 다음 비슷한 크기의 배경 영역을 정의합니다.

전동 샘플 스테이지와 단색 광원이 있는 도립 및 고급 형광 현미경에서 데이터 수집을 시작하십시오. 또는 Fura-2AM의 경우 340나노미터 및 380나노미터, G-geNOp의 경우 480나노미터에서 셀을 여기합니다. 모든 채널에서 시간이 지남에 따라 선명한 형광 신호를 감지할 수 있도록 각 노출 시간을 설정합니다.

500나노미터 익사이터, 495나노미터 다이크로익 및 510-520나노미터 이미터로 구성된 적절한 필터 세트가 있는 CCD 카메라를 사용하여 Fura-2AM의 경우 510나노미터, G-geNOp의 경우 520나노미터의 방출광을 수집합니다. 그런 다음 3초마다 하나의 총 프레임을 기록합니다. 생리학적 칼슘 완충액에 처음 3분을 기록하여 각 형광 신호의 기준선을 얻습니다.

안정적인 기준선 형광이 관찰되면 100마이크로몰 히스타민 또는 생리학적 칼슘 완충액이 포함된 ATP로 전환하여 3분 동안 세포를 자극합니다. 그런 다음 5분 동안 히스타민이나 ATP 및 L-NNA가 없는 생리학적 칼슘 완충액으로 다시 전환하여 세포에서 화합물을 제거합니다. 그 후, 관류 시스템을 사용하여 생리학적 칼슘 완충액에 10마이크로몰 NOC-7을 2분 동안 투여합니다.

산화질소 공여체는 G-geNOp 형광에 큰 영향을 미치며, 일반적으로 10마이크로몰 NOC-7에 반응하여 세포를 20% 이상 감소시킵니다. EA.hy926 세포에서 NOC-7 효과는 작용제에 의한 G-geNOp 형광 소멸에 비해 더 강합니다. 그런 다음 생리학적 칼슘 완충액으로 약 10분 동안 산화질소 방출 화합물을 씻어내고 기저 형광이 회복되면 기록을 중지합니다.

여기에 표시된 것은 Fura-2AM이 로드된 G-geNOp를 발현하는 EA.hy926 세포의 대표적인 광시야 형광 이미지입니다. 그리고 여기는 100마이크로몰 히스타민에 반응하여 Fura-2 및 G-geNOp 신호의 동시 기록의 대표적인 시간 경과입니다. 표시된 바와 같이, 히스타민은 관류 시스템을 사용하여 3분 후에 제거되었습니다.

이 곡선은 G-geNOp를 일시적으로 발현하는 단일 Fura-2AM 로딩 내피 세포의 세포질 칼슘 및 산화질소 신호의 동시 기록을 나타냅니다. 세포는 칼슘 함유 완충액에서 3분 동안 100마이크로몰 히스타민으로 자극되었습니다. 그리고 여기에 표시된 대표자는 측정 전에 500마이크로몰 L-NNA로 전처리된 EA.hy926 세포의 시간 경과에 따라 동시에 기록된 칼슘 및 산화질소 신호입니다.

세포는 2밀리몰 칼슘의 존재 하에 100마이크로몰 히스타민으로 처리되었습니다. 이 그림은 100마이크로몰 ATP를 사용한 두 번째 세포 자극에 대한 반응으로 세포질 산화질소 신호를 나타내는 평균 곡선을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 최소한의 노력으로 산화질소 신호를 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

저는 이 기술이 연구자들이 다양한 세포 모델에서 산화질소 신호를 탐구하고 재조사할 수 있는 길을 열어줄 것이라고 믿습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 모델 시스템에서 산화질소의 실시간 이미징을 위해 geNOps 기술을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.