새로운 방법으로 자유롭게 움직이는 신생아 쥐의 뇌파 기록

이 방법의 전반적인 목표는 일주일 이상 안정적으로 유지되는 새로운 전극 설정을 사용하여 자유롭게 움직이는 신생 쥐 새끼로부터 EEG를 기록하는 것입니다. 이 방법은 신경과학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 것이며, 신생아 간질 연구에 유용하게 활용될 것입니다. 이 기술을 사용함으로써 더 긴 시간 동안 고품질의 안정적인 EEG 신호를 기록할 수 있습니다.

이는 다양한 신경 병리학적 질환의 진단에 도움이 될 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 p8에서 p15 단계의 신생 쥐가 취급하기 매우 까다롭고 세심한 주의가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 전극이 통신 장치와의 신호 인터페이스 역할을 하기 위해서는 프롱(prong) 형태의 접점이 필요합니다.

컴퓨터 핀 로 사이(pin lo sai)가 이 역할을 수행합니다. 플라이어를 사용하여 컴퓨터 핀 로 사이에서 수핀과 암핀을 조심스럽게 분리하십시오. 그 다음, 수핀과 암핀을 서로 연결하여 전극을 형성하고, 시아노아크릴레이트로 연결 부위를 고정하십시오.

이와 같은 전극을 여러 개 제작합니다. 접착제가 경화되면 전극을 증류수가 채워진 비커에 10분 동안 담급니다. 그 후, 초음파 세척기에 넣어 전극을 세척합니다.

그런 다음, 비커를 45 °C로 설정된 오븐으로 옮겨 30분 동안 가열합니다. 마지막으로, 전극을 UV에 30분 동안 노출시켜 멸균합니다. 생물안전작업대 내에서, 먼저 멸균된 수술 도구와 수술용 멸균 뇌정위 고정 장치를 준비합니다.

그 다음, 2.5% isoflurane을 사용하여 신생 쥐 새끼를 마취합니다. 새끼 쥐가 깊게 마취되면 isoflurane 농도를 1%로 낮춥니다. 다음 단계로 넘어가기 전, 발가락 꼬집기 테스트(toe pinch)를 통해 쥐가 충분히 마취되었는지 확인합니다.

다음으로, 스테레오탁식 장치(stereotaxic apparatus)에 새끼 쥐의 머리를 고정합니다. 이바(ear bars)를 외이도에 위치시키고 조심스럽게 조여줍니다. 주의 사항: 신생 쥐의 두개골은 매우 부드럽습니다.

이제 두개골에 15 mm 길이의 정중선 절개를 가합니다. 그다음 포셉을 사용하여 두피를 조심스럽게 벌려 절개 부위를 넓힙니다. 절개 부위가 열린 상태를 유지하도록 식염수에 적신 솜을 사용하십시오.

이제 브레그마(bregma)와 람다(lambda)의 위치를 찾아 연필로 표시하십시오. 다음의 전극 삽입 단계는 매우 중요하므로 정확하게 수행해야 합니다. 먼저, 26-gauge 바늘을 사용하여 브레그마에서 전방으로 2 mm, 정중선에서 0.5 mm 이내의 전전두엽 피질에 버홀(burr hole)을 뚫습니다.

다음으로, 브레그마(bregma)에서 후방으로 1.8 mm, 정중선(midline)에서 외측으로 0.5 mm 지점의 해마에 버홀(burr hole)을 뚫습니다. 뇌 손상을 최소화하기 위해 바늘이 피질 표면 아래로 2 mm보다 더 깊게 침투하지 않도록 해야 합니다. 이제 포셉을 사용하여 피질 구멍에 기준 전극을 삽입하고, 해마 구멍에 기록 전극을 삽입합니다.

그런 다음, 전극 주변에 에리트로마이신 연고를 바르고 시아노아크릴레이트로 전극을 고정합니다. 접착제가 굳는 동안 치과용 시멘트를 끈적이고 점성이 있는 상태로 준비합니다. 치과용 시멘트의 점도가 매우 중요합니다.

치과용 시멘트가 너무 얇으면 전극 아래에 원치 않는 절연층이 형성될 수 있습니다. 반대로 시멘트가 너무 두꺼우면 과도한 질량으로 인해 전극이 더 쉽게 탈락될 수 있습니다. 시멘트를 도포하기 전에 두개골과 전극을 완전히 건조시키십시오.

그 다음, 치과용 시멘트를 사용하여 전극을 두개골에 고정합니다. 이어서, 전극에 피크린산을 도포하여 보호층을 추가로 형성합니다. 이제 동물을 정위 고정 틀에서 분리하고, 10% 포도당 용액 300 µL를 피하 주사합니다.

그 후, 동물을 가열 패드로 옮겨 보행이 가능해질 때까지 37 °C를 유지합니다. 보행이 가능해지면 수술 후 통증 완화를 위해 buprenorphine을 투여하고, 새끼를 어미가 있는 홈 케이지로 옮깁니다. 임플란트를 사용하기 전, 새끼가 회복될 수 있도록 최소 이틀 동안 기다립니다.

회복 기간이 지난 후, 새끼 쥐가 환경에 익숙해질 수 있도록 약 10분 동안 단독 수용하며 기록을 진행합니다. 전극을 증폭기에 연결하고, 증폭기를 컴퓨터에 연결된 AD 변환기에 연결합니다. 이때 연결선들이 엉키지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 데이터 수집 장치에서 기록을 위해 최소 10,000 hertz의 샘플링 속도를 선택하고 데이터 전송이 적절한지 확인합니다. 기선(baseline) 기록을 수집합니다. 기선 기록을 마친 후, 뇌전증 발작을 유도하기 위해 새끼 쥐의 복강 내에 kainic acid를 주입합니다.

주입 15분 후, 뇌전증성 방전(epileptic discharges)을 관찰하고 기록하십시오. 디지털화된 데이터를 저장하고, 신호 처리 소프트웨어를 사용하여 분석하십시오. 전력 스펙트럼 분석(power spectrum analysis)을 통해 신생아 EEG의 서로 다른 주파수 성분의 전력 수준을 확인하십시오.

EEG 대역인 1~100 Hz 범위에서 제곱 평균 제곱근(root mean square) 진폭을 구해 1분 단위 시간 프레임의 전력을 계산합니다. kainic acid 주입 10분 후, 반복적인 발작 간 및 발작 중 EEG 방전 패턴이 기록되었습니다. 기록된 가장 흔한 발작 형태는 강직 간대성 유형이었습니다.

발작성 강직 지속 시간은 약 15초였습니다. 또한 강직성 방전 이후에 클로닉 버스트(clonic bursts)가 뒤따르는 것이 관찰되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 p8에서 p15 사이의 신생 쥐 새끼에게 전극을 이식하고 고품질의 EEG 기록을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

준비가 완료되면, 수술의 복잡성에 따라 경추 삽입은 10분 이내에 완료될 수 있습니다.