Name: 키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 배우세요 제브라피시 망막 전구세포의 생체 내 실시간 추적을 통해 세포 비자율적 신호전달이 신경발생에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 유전자 녹다운과 형질전환 기법을 활용하여 세포 운명 결정 메커니즘을 규명합니다.

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이 작품은 (PO 1440 / 1-1) LP하는 PRJ에 ARC DECRA (DE120101311)에 의해과 독일 연구 협회 (DFG)의 연구 보조금에 의해 지원되었다. 호주 재생 의학 연구소는 빅토리아 주 정부와 호주 연방 정부의 자금 지원됩니다. 우리는 케이 등의 알에 게시 여기에 기술 된 실험을 실시 박사 제레미 잉 치 케이를 인정합니다. 2016 년 우리는 교수 Higashijima에서 형질 전환 어류의 규정에 대한 감사 및 PROFS 감사합니다. H2B-RFP 및 H2A-GFP 구조를 생성하기위한 PCS2 + 플라스미드 박사 윌킨슨의 제공을위한 터너와 렆. 우리는 우리의 동물을 돌보는에 대한 FishCore 시설 직원 (모나 쉬 대학) 감사합니다.

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효율적 특정 포스트 - 유사 분열 세포 유형 또는 패터닝 된 조직으로 분화하는 배아 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포를 지시하는 것을 목표로 할 때 넓이가있는 이웃하는 셀은 중요한 세포의 운명 결정 인자의 발현의 타이밍에 영향을 이해하는 것이 필수적이다. 또한, 살아있는 동물의 개발 세포에서 이러한 분자 이벤트를 검사하면 추가로 관련 동적 생체 내에서 이러한 이벤트와 관련된 특정 세포 컨텍스트에 (공간적) 정보를 제공합니다. 이러한 연구는 쉽게 모든 척추 동물 모델에서 달성 될 수 없다. 제시된 프로토콜에서, 의무 제브라 피쉬 배아는 척추 동물의 망막의 아직 매우 조직, 비교적 간단한 3 차원 패턴 화 된 조직으로, 생체 내에서 이러한 문제를 해결하기 위해 척추 동물 모델로 이용된다. 이것은 특히 망막 세포 고갈 가설을 테스트하여 예시유형 유전자 발현시기 망막 전구 세포의 발달 운명에 영향을 준다. 우리는 추가로 예를 들어, 다시 평가 시간에 ...

<html> 생체 내 척추 동물의 중요한 발달 과정을 시각화하는 능력은 정상과 질병 조건을 공부 제브라 피쉬에게 키 모델을 만들기에 기여하고있다 (1 검토, 2). 특히, 신경 망막은 중추 신경계의 접근 가능한 부분이다. 망막 인해 고도로 조직 아직 비교적 간단한 구조 및 척추 동물 종 3에서 고도로 보존 된 신경 세포 유형에 쉽게 신경의 연구를 수행하기 위해 빌려 준다. 이러한 증식, 세포주기 출구, 비대칭 세포 분열, 운명 사양, 차별화 및 신경 회로의 형성과 같은 세포 행동의 역학은 3 일의 postfertilization에 의해 제브라 피쉬의 중심 망막에 완료 retinogenesis의 전체 과정에 걸쳐 올 수 있습니다 ( DPF) 4, 5,REF &quot;&gt; (6, 7). 또한, 전술 한 각 단계에서 상이한 유전자의 기능적 요구 병용 단 후 부검시에 평가 될 수있는 유전자 녹아웃 기술의 적용으로 인한 표현형 다른 척추 동물 모델에 비해 이점을 제공 제브라 망막 평가할 수있다 의 조직을 고정. 특히, 시각화 및 망막 리포터 유전자 형광 단백질의 발현을 모니터 할 수있는 트랜스 제닉 라인의 사용은 우리가 특정 신경 세포 유형 기원의 기초의 유전자 발현의 시간 해상도를 얻을 수있다. 인해 지브라 피쉬의 급속한 발전으로, 이러한 이벤트는 따라서 신경 세포 식별 획득 및 셀의 동작과 관련하여 유전자 발현의 시간 중요도에 깊은 통찰력을 제공하여 전체 개발 기간을 시각화 할 수있다. 마지막으로,이 방법은 유전자 기능의 두 가지 주요 형태로 통계 결과 이식을 통해 키메라의 생성과 제브라 효율적으로 결합 될 수있다. 우선, 그들이 비 표지 야생형 환경에서 개발하면서 특정 유전자를 넉다운시킨 도너 배아에서 이식 세포 검사, 세포 자율 방식으로 유전자 기능에 대한 관련 정보를 얻을 수있게 해준다. 따라서, 그들은 일반적으로 더 이상 유전자 -4,6-에서 기능성 단백질을 생성 할 수 없다 전구 세포의 발달 운명 결과의 시험을들 수있다.이 표현되는 전구 세포 내 망막 운명 결정 인자의 기능에 관한 중요한 통계 리드 8,9. 이 방법을 활용하여, 우리는 많은 운명의 결정 요인 (예를 들어, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2가) 세포의 역할을하는 것으로 나타났습니다-autonomously 특정 망막 신경 세포의 운명을 구동하는 단계; 유전자 발현의 부족은 주로 유전자 녹다운 세포가 다른 세포 운명 4, 6, 7, 10을 채용하여 생존 유지되도록 운명 스위치로 이끈다. 둘째, 이러한 키메라 실험은 서로 다른 유전 적 환경에서 개발할 때 형 선조 동작 방식 야생 평가하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 일반적으로 조작 된 호스트 환경 (예를 들어, 유전자 녹아웃 / 최저) 대 WT 관심 (리포터 유전자)의 유전자를 발현 WT 세포의 발달을 비교하여, 유전자 발현 및 세포 운명 얻어진 효과를 평가할 수있다 . 호스트 환경의 특정 신경 세포 유형의 부재가 예를 들어, 소수 O로 분화 향해 바이어스 그들 셀 비 자율 방식으로 야생형 전구 동작에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다신경 세포 타입 4, 7, 11, 12을 r에 누락. 망막 신경 세포가 (13에서 검토) 특정 신경 세포 운명 결정하는 유전자의 순차적 초과 식 (운명의 유전자 발현)에 의해 보존 histogenic 위해 태어난 것을 감안할 때, 우리는 입증하기 위해 이러한 방법을 사용하는 방법 야생형 전구 세포의 운명 유전자 발현의 타이밍 이러한 전구 세포가 유도 된 비정상적인 세포 조성 망막 호스트 환경에서 개발할 때 영향을받습니다. 비교적 널리 사용되는 표준 및 기술의 조합은 망막 전구 세포를 8, 9 개발 운명 유전자 발현의 타이밍의 시험을 가능하게하는 방법을 여기에서는 증거 이러한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 당의 용이성으로 시간 경과 영상을 결합하는 실험 방법을 설명합니다전 생체 개발 제브라 피쉬 배아에 이식을 형성하는 개별 mosaically에게 발달 retinogenesis의 전체 기간 동안 표지 세포를 수행합니다. 기능 유전자 조작을 수행함으로써 어느 호스트 배아 도너 배아, 또는 둘 모두에서 하나의 유전자 기능의 셀 자율성을 평가할 수있다. 이 방법은 여기에 설명 된 개별 구성 요소가 적합있는 다른 시스템에서 유사한 연구 질문에 널리 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Agarose 코팅 접시는 며칠 전에 준비하고 건조를 방지하기 위해 파라필름으로 밀봉하고 4 &#176에서 보관할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>Agarose 저용융</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td>는 <td>더 큰 부피로 준비하고 전자레인지에 넣어 액화시킨 다음 40 &#176에서 용융된 상태로 유지할 수 있습니다. C 수조. 1mL 분취액을 준비할 수 있습니다(장착된 배아 그룹당 1개).</td></tr><tr>비슷한 직경의 <td>borosillicate 유리 모세관 w/o 필라멘트</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0035</td><td>대안을 사용할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr>비슷한 직경의 필라멘트 <td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td> 대체품<td>이 있는 borosillicate 유리 모세관</td><td>튜브를 사용할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 페트리 접시(직경 60mm)</td>모든 <td>크기의 유리 대체품</td><td>1070506</td> <td>Science Supply</td></tr><tr><td>사출 튜브(2m)</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>이식 시 바늘 홀더를 주사기에 연결합니다.</td></tr> 미세 <tr><td>사출 금형(쐐기 모양의 돌출부가 있는 플라스틱 금형)</td><td>적응형 과학 도구</td><td>PT-1</td> 대안은 마이크로 니<td>들을 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td> 홀더</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>주사 바늘의 외경에 맞는 대안</td></tr>은 <tr><td>마이크로 인젝터</td><td>Narishige 또는 Eppendorf Femtojet</td><td></td> 가스 압력 마이크로 매니퓰레이터<td>를 사용하는 공압 인젝터</td></tr>를 <tr><td></td> 사용할 수 있습니다 <td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>유사한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr>마이크로<td>로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>바늘 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>모델 P-2000</td><td>이 풀러에 사용되는 설정은: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75입니다. 적절한 팁 치수를 가진 경우 어떤 바늘 풀러도 사용할 수 있습니다:</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Interpath</td><td>PM996</td>, <td>모든 파라핀 필름</td></tr><tr><td>, 파스퇴르 피펫, 플라스틱</td><td>, Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr>, <tr><td>파스퇴르 피펫 유리</td><td>, Hirschmann Laborgeraete</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG&</td><td>nbsp; 프로테아제 유형 XIV</td></tr><tr><td>N- 페닐 티오 우레아</td><td>시그마</td><td>P7629-25G</td><td>PTU는 독성이 있으며 분말에 대한 빈번한 노출을 피하기 위해 원액으로 준비 할 수 있으며 구매 / 사용 전에 MSDS와 상담하십시오.</td></tr><tr><td>Qiaquick 젤 추출</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>DNA를 정제하기 위한 모든 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Rneasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA를 정제하기 위한 모든 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>SP6 mMessage kit</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>SP6을 사용하여 DNA를 전사하는 모든 대안</td></tr></tbody></table>

키메라 zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

유전 적 및 기술적 장점은 제브라 척추 유전자 조작의 결과가 급속한 발달 기간 동안 생체 내에서 추적 될 수있는 키 모델 생물 만들었다. 다중 처리는 세포 증식, 유전자 발현, 세포 이동 및 형태 형성을 포함하여 연구 될 수있다. 중요한 것은, 이식을 통해 키메라의 생성을 용이하게 호스트 환경의 영향하에 모자이크 표시와 개별 세포의 추적을 가능하게 수행 될 수있다. 예를 들어, 개별 이식 공여자 세포 (모르 폴리 마이크로 인젝션을 통해 예를 들어) 호스트 배아 기능 유전자 조작 및 라이브 영상, 외부의 영향 (유 전적으로 변형 환경에 의해 제공되는) 셀 비 자립적 신호를 조합하여 평가 될 수있다. 여기서 우리는이 방식 세포 운명 determin의 타이밍에 대한 프록시로서 형광 유전자 발현의 개시를 비교하기 위해 사용되는 방법을 보여다른 유전 호스트 환경에서 ATION. 이 글에서 공여 세포를 표시 유전자 호스트 배아 최저 키메라 배아를 생성하는 데 사용되는 이식 기술을 설명하고, 제조 및 생체 저속 촛점에서 실행을위한 프로토콜을 일으킬 제브라 피쉬 배아 마이크로 인젝션을위한 프로토콜을 제공 여러 개의 배아의 영상. 이러한 유전자 발현의 개시에 따라 이벤트의 타이밍을 비교하면 특히 다단 촬상을 행하는 것은 매우 중요하다. 이것은 다수의 제어와 동시에 처리 실험 배아에서 데이터 수집이 필요합니다. 이러한 접근 방식은 쉽게 장기 나 영상을 살 액세스 선택의 조직에서 외부의 영향에 대한 연구를 위해 확장 될 수있다, 이식이 이루어 배아 운명의지도에 따라 쉽게 대상이 될 수 있음을 제공했다.

이 작품은 야생형 망막 전구 세포가 morphant 호스트 배아 내에서 개발할 때 유전자 발현 타이밍의 변화를 평가하기 위해 실험 프로토콜을 제시한다. 실험 호스트 배아 망막 7, 26의 중간 태어난 수평 및 무 축삭의 interneurons 부족 Ptf1a의 morphants이다. 이러한 표준 제어 모르 주사 하였다 호스트 배아를 제어하기 위해 비교 하였다. (망막 포함), 중추 신경계의 뉴런에 걸쳐 다양한 형태의 신경 세포가 발생하기 때문에 고도로 보존 후의 운명의 진행은 세포 비 자율 피드백에 의존 순서 27, 28, <sup ...

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

이 절차들의 전반적인 목표는 발달 중인 세포 내부 또는 그 주변 환경의 유전자 발현 변화가 발달 과정 중의 시간적 프로세스에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 것입니다. 이 방법은 운명 결정의 타이밍이 세포 내부에서 세포 자율적으로 발현되는 유전자에 의해 제어되는지, 아니면 인접한 세포에서 세포 비자율적으로 제어되는지와 같은 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전적으로 서로 다른 환경에서 발달하는 생체 내 척추동물의 개별 전구세포를 추적할 수 있다는 점에 있습니다.시연은 저희 실험실의 연구 보조원인 Stefanie Dudczig가 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 제브라피시 배아와 Morpholinos 또는 mRNA가 충전된 미세 주입 바늘을 준비한 후, 접시 안의 미네랄 오일 한 방울에 바늘 끝을 담급니다. 풋 페달을 눌러 주입량을 측정하고, 마이크로미터 슬라이드 또는 접안렌즈 눈금자로 측정했을 때 주입량이 1 nanoliter가 될 때까지 가스 압력 및/또는 지속 시간을 조정합니다.현미경 슬라이드를 페트리 접시에 놓고, 전이 피펫을 사용하여 단세포 단계의 배아를 슬라이드 가장자리를 따라 배치합니다. 다음으로, 미세 전이 피펫을 사용하여 주입 중 움직임을 방지하기 위해 액체를 가능한 한 많이 제거합니다. 그런 다음, 얇은 팁의 절반을 잘라낸 Microloader 피펫 팁을 사용하여 배아를 단일 열로 정렬합니다.그 다음, 바늘을 단세포기 배아 쪽으로 내려 chorion과 yolk를 한 번의 매끄러운 동작으로 관통합니다. 바늘 끝이 yolk의 중심에 위치하면, 풋 페달을 한 번 눌러 1 nl의 H2AGFP 또는 H2BRFP mRNA를 단세포기 배아의 yolk에 미세주입합니다. 주입 바늘을 제거하고, 배아가 담긴 배양 접시를 이동시켜 다음 배아를 위치시킨 후, 모든 배아 열에 주입이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다.모든 배아에 주입을 마친 후, 디쉬를 30~45도 각도로 기울이고 스퀴즈 보틀을 이용해 E3 배지를 부드럽게 흘려주어 주입된 배아들을 새롭고 깨끗한 페트리 디쉬로 옮깁니다. 수정 후 3시간이 지나면, 2X~5X 배율의 형광 현미경에서 RFP 필터를 사용하여 공여 배아의 표지 신호를 확인합니다. 형광 신호가 강하고 발달 상태가 좋은 배아를 선택합니다.텍스트 프로토콜에 따라 주입 플레이트와 페트리 접시를 준비한 후, 다이아몬드 나이프를 사용하여 유리 팁을 회전시키며 긁어 팁이 떨어질 때까지 절단하여, 조작하기 편한 길이로 가늘게 뽑힌 롱폼 유리 파스퇴르 피펫 팁을 만듭니다. 이때 절단면이 직선이 되도록 하십시오. 그 다음, 탈막 처리된 배아가 손상되지 않도록 분젠 버너에서 절단면을 회전시키며 유리 전송 피펫을 화염 연마하여 끝부분을 매끄럽게 만듭니다.배아의 난막을 제거하려면, 잘 발달된 숙주 및 공여 배아를 각각 별도의 10 milliliter 삼각 플라스크에 넣고 액체를 최대한 제거합니다. 이전에 준비한 0.5 milligram per milliliter 프로테아제 용액 5 milliliters를 각 플라스크에 넣고, 해부 현미경으로 관찰하면서 배아를 부드럽게 흔들어 줍니다. 계속해서 흔들어 주다가 첫 번째 배아가 난막 밖으로 나오는 즉시, 액체의 대부분을 따라내고 플라스크 벽면을 따라 E3 배지를 부드럽게 채워 넣는 방식으로 E3 배지를 이용해 빠르게 세 번 헹구어 프로테아제 용액을 제거합니다.첫 몇 개의 탈맥막 배아가 관찰되는 즉시, 빠르고 부드럽게 세척하여 효소적 탈맥막 과정을 중단시키십시오. 이식에는 세포 덩어리가 대칭적이고 난황에 명백한 변형이나 손상이 없는 탈맥막 배아만을 선택하십시오. 포배기 이식을 수행하려면, 바늘을 바늘 홀더에 장착하고 이식 장치의 튜브에 연결하십시오.주사기를 수동으로 조작하여 바늘로 액체를 흡입하고 배출함으로써 밀봉 상태를 테스트합니다. 다음으로, 유리 피펫을 사용하여 공여 배아를 아가로스 몰드의 첫 번째 열로 옮깁니다. 그 후 수용 배아를 아가로스 몰드의 두 번째에서 여섯 번째 열로 옮깁니다.이식 바늘을 공여 배아의 할구 세포 위에 살며시 얹고, 약 20~50개의 세포를 이식 바늘 안으로 천천히 흡입합니다. 이때 난황이 함께 흡입되지 않도록 주의하십시오. 미세조작기를 사용하여 공여 배아로부터 이식 바늘을 들어 올립니다.주입 접시를 왼쪽으로 옮기고, 이식용 바늘 팁을 세포 덩어리의 측면을 통해 첫 번째 호스트 배아의 동물극으로 삽입합니다. 운명 지도(fate mapping)에서 이 영역이 전뇌 안구 영역으로 발달함을 보여주므로, 표면 근처에 5~10개의 세포를 배치합니다. 이미징을 위해 배아를 고정하려면, 플라스틱 전송 피펫으로 최대 5개의 배아를 빨아들인 후 중력에 의해 배아가 팁 끝에 모이도록 합니다.미리 준비한 1% low-melt agarose가 들어 있는 플라스틱 튜브 표면에 전송 피펫을 접촉시켜, E3 전송량을 최소화하면서 배아가 튜브 안으로 가라앉도록 합니다. 다음으로, agarose 플라스틱 튜브에서 배아 5개를 0.5~1 mL의 agarose가 담긴 페트리 접시로 옮기고, 동일한 전송 피펫을 사용하여 작은 방울만 남을 때까지 과잉 agarose를 제거합니다. 팁 끝을 잘라낸 마이크로 로딩 피펫을 사용하여 agarose가 응고될 때까지 배아들을 측면으로 정렬합니다.그런 다음 개별 아가로스 드롭에 한 번에 최대 5개의 배아를 계속 마운팅합니다. 정립 현미경으로 이미징하는 경우, 배아를 페트리 접시 가장자리에서 1cm 이내에 배치하지 마십시오. 이미징 중에 배아가 이탈하거나 측면으로 이동하는 것을 방지하기 위해, 추가적인 1% low-melt agarose를 사용하여 접시 측면의 아가로스 드롭들을 서로 연결합니다.적절한 마운팅 각도와 강한 심장 박동을 보이며, 유전자 발현 파동이 시작되는 발달 중인 망막의 전복측 사분면에 소수의 이식된 공여자 세포가 있는 배아를 선택합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미징을 수행합니다. 이 그림에서 보여주는 것처럼, 단세포 단계 배아의 난황에 1 nanoliter의 mRNA를 미세 주입하면 수정 후 3시간까지 형광 리포터 단백질이 발현되며, 이 단계에서 가장 밝은 공여자를 선택합니다.수정 후 24시간에, 관련 망막 위치에 공여 세포를 이식한 배아를 대상으로 16~24시간 동안 타임랩스 이미징을 수행하였습니다. 단일 광학 Z-섹션의 이 공초점 이미지는 발달 중인 눈의 명시야 영상을 적색 채널로 겹쳐서 보여주며, 표지되지 않은 숙주 환경 내에서 적색으로 표지된 소수의 공여 세포를 나타냅니다. 이 현미경 사진들은 표지되지 않은 야생형 숙주에 이식된 atoh7:gapGFP 형질전환 배아 유래의 발달 중인 야생형 공여 세포를 타임랩스 이미징으로 촬영한 것입니다.여기서 보는 바와 같이 몇몇 세포에서 외래유전자 발현의 시작이 나타납니다. 숙련되면 미세주입은 2시간 이내에 수행할 수 있으며, 배아 선택, 준비 및 이식은 같은 날 3시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이러한 절차 이후 또는 이와 병행하여, 사후 분석을 위해 특정 연령의 배아를 고정할 수도 있습니다.예를 들어, 공여 세포 중 특정 유전자나 단백질을 발현하거나, 특정한 형태를 가지거나, 또는 특정 위치로 이동한 세포의 비율을 정량화할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 제브라피쉬 배아를 유전적으로 조작하고 유전적으로 서로 다른 공여자와 수용자 사이에 키메라를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 고정된 조직에서는 답을 얻을 수 없는 질문들을 해결하기 위해, 인 비보(in vivo) 타임랩스 이미징을 위한 배아 마운팅 방법을 익힐 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Zebrafish 세포 이식은 조직 특정 chimeras를 생성하는 유전 발생학의 조합이 가능합니다. 이 비디오는 gastrula 우리 연구실은 forebrain의 접합면의 형성 중에 astroglial 인구와 구체적인지도 단서의 역할을 조사하기 위해 허용해야 세포 transplantations를 개최 보여줍니다.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

조건부 성인 zebrafish의 망막에서 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법은 intravitreally 안티 센스 morpholinos를 주입하여 망막에 그들을 electroporating 포함하는, 설명되어 있습니다. 그 결과 단백질은 재생이나 그대로 망막에있는 단백질의 역할을 테스트 수 며칠에 대한 무너뜨렸다입니다.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

세포 이식, 세포골격 라벨링 및 기능 손실/이득 접근법을 결합한 이 프로토콜은 생체 내 세포 이동에서 후보 유전자의 기능을 분석하기 위해 이동하는 제브라피시 전향 prechordal plate를 사용하는 방법을 설명합니다.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

망막 조직을 이미징 전통적인 생 화 확 적인 방법에서 수집 될 수 없는 단일 셀 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜 confocal 영상에 대 한 제 브라에서 망막 조각의 준비를 설명합니다. 형광 유전자 센서를 인코딩 또는 표시기 염료 별개 망막 세포 유형에 수많은 생물 학적 과정의 시각화를 허용.

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

배우세요 제브라피시 망막 전구세포의 생체 내 실시간 추적을 통해 세포 비자율적 신호전달이 신경발생에 미치는 영향을 연구하는 방법을. 유전자 녹다운과 형질전환 기법을 활용하여 세포 운명 결정 메커니즘을 규명합니다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

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