마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

이 절차의 전반적인 목표는 스캐닝 레이저 검안경을 사용하여 마우스 내 혈액 세포의 망막 순환을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 WBC 및 RBC의 망막저 역학이 무엇인지, 그리고 이들의 흐름 역학이 질병 발병에 어떻게 기여할 수 있는지와 같은 망막 질환에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 질병 표현형을 재현할 수 있고 수행하기가 매우 쉽다는 것입니다.

이 절차는 팀원인 Praveen, Bo Bo 및 Neha가 시연합니다. 쥐의 혈액 세포를 분리하기 위해 2 밀리리터 튜브에 1 : 1 폴리 자당과 나트륨 디아 트리조 에이템 용액 위에 갓 채취 한 전혈을 층을 이룹니다. 그런 다음 튜브를 30분 동안 원심분리합니다.

다음으로 플라즈마 상층액을 흡인하고 버립니다. 그런 다음 백혈구로 구성된 담황색 털 층과 적혈구의 기본 층을 별도의 튜브에 조심스럽게 수집합니다. 다음으로, 적혈구를 1XPBS로 세척하여 오염 물질을 제거하고 PBS 1량에 재현탁합니다.

그런 다음 현탁액의 50밀리리터 부분 표본을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 부분 표본을 스핀다운하고 상층액을 버리고 약 200마이크로리터의 40%1XPBS를 펠릿화된 적혈구에 추가합니다. 잘 섞는다.

그리고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후 각 현탁액에 100마이크로리터의 ICG를 추가합니다. inversion을 사용하여 튜브를 혼합한 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로 300 마이크로 리터의 1XPBS를 넣고 섭씨 37도에서 부드럽게 교반하여 한 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 현탁액을 원심 분리하고 펠릿화된 세포를 유지하며 1XPBS 1밀리리터에 재현탁합니다. 상층액이 투명해질 때까지 1XPBS로 세포를 계속 세척합니다.

상층액을 디캔팅 한 후 1%BSA와 PBS를 한 부피로 다시 첨가하여 ICG 표지 적혈구의 50%헤마토크릿을 달성합니다. 다음으로 버피 코트 컬렉션을 처리합니다. 먼저 10ml의 1XPBS로 세포를 한 번 세척하여 오염 물질을 제거합니다.

샘플을 다시 원심분리한 다음 펠릿을 900마이크로리터의 1XPBS에 재현탁합니다. 다음으로 100마이크로리터의 10%플루오레세인나트륨을 첨가하고 실온에서 2분 동안 세포를 배양합니다. 마지막으로 표지된 림프구를 10mL의 1XPBS로 3회 세척합니다.

원심 분리기를 만들고 100 마이크로리터의 1XPBS에 다시 현탁시킵니다. ICG 표지된 적혈구를 주사용으로 준비하려면 먼저 주사용 분취액을 5% 또는 1%의 헤마토크릿으로 희석합니다. 생쥐를 마취시키고 동공을 확장시킵니다.

그런 다음 양쪽 눈에 안과 연고를 바릅니다. 그리고 한쪽 눈에 콘택트렌즈를 끼웁니다. 이제 눈의 굴절을 보정하기 위해 포지티브 25 디옵터 렌즈가 있는 컨포칼 SLO 카메라를 사용하여 마우스를 이미지화합니다.

Fresh는 각막을 SLO 기계의 광학 헤드로 완벽하게 안내합니다. 그런 다음 이미징 모듈을 켜고 시신경이 이미징 화면의 중앙에 올 때까지 조작합니다. 그런 다음 30도 각도에서 적외선 안저 이미지를 촬영합니다.

다음으로 적외선 안저 비디오를 촬영합니다. 790나노미터 ICG 필터를 켜고 카메라 모드를 고속 추가로 설정하고 시야각을 15-30도로 유지합니다. 그런 다음 모든 판독값에 대해 ICG 강도를 85로 설정합니다.

제어판에서 획득 버튼을 클릭하여 1분 동안 초당 8.8-15프레임으로 기본 비디오를 촬영합니다. 다음으로, 30 게이지 바늘로 인슐린 주사기에 100마이크로리터의 ICG 표지 적혈구를 로드하고 세포를 꼬리 정맥에 주입하거나 후안와로 주입합니다. 주입 직후 새로운 적외선 안저 이미지와 새로운 ICG 필터 비디오를 촬영합니다.

비디오를 획득한 후 이미지 분석을 위해 TIFF 형식으로 내보냅니다. 무료로 제공되는 이미징 소프트웨어 패키지인 MHJ를 사용하여 이미지를 처리합니다. 파일을 연 후 속도 측정을 위한 이미지 비디오의 프레임 간격을 설정합니다.

그런 다음 MtrackJ 플러그인을 엽니다. 메뉴에서 추적을 선택하고 포인트를 추가한 후 다음 타임프레임 인덱스로 이동하는 옵션을 토글합니다. 이제 관심 있는 셀을 찾고 각 프레임을 추적합니다.

메뉴에서 추가를 클릭하여 새 트랙을 추가한 다음 선택한 셀을 클릭합니다. 그런 다음 이미지가 프레임에서 프레임으로 진행될 때 셀의 현재 위치를 계속 클릭합니다. 추적이 완료되면 표시 선택 항목에서 궤적에 대한 표시 옵션을 변경하고 현재 시간의 추적 점만 표시하도록 선택합니다.

셀의 궤적이 표시될 때까지 계속 클릭한 다음 트랙을 저장합니다. 이제 add 명령으로 시작하여 첫 번째 셀과 마찬가지로 다음 셀을 추적하십시오. 관심 있는 모든 셀을 추적한 후 측정 옵션을 사용하여 모든 트랙 측정값의 표시를 엽니다.

그런 다음 추가 분석을 위해 출력을 저장합니다. 1.5% ICG로 표지된 적혈구는 1% 또는 5% 헤마토크릿을 사용하여 C57 블랙 6J 마우스의 망막 순환에서 시각화되었으며, 세포는 구별할 수 있었지만 1% 헤마토크릿에서는 표지된 세포가 더 쉽게 시각화되었습니다. 주사된 농도로 인해 유두주위 영역에서 일부 적혈구 정체가 관찰되었으며 5% 헤마토크릿에서 더 잘 보였습니다.

백혈구는 1% 플루오레세인나트륨으로 표지되고 형광 현미경을 사용하여 녹색 표지 세포로 시각화되었습니다. 약간의 덩어리가 관찰되었습니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 양질의 망막 이미지와 비디오를 얻기 위해 눈을 확장하는 것이 중요합니다.