Name: 마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 배우세요 마우스 망막 순환에서 적혈구와 백혈구의 유동 역학을 형광 염료로 표지하여 실시간 영상화하는 방법을. 이 기술은 당뇨병성 망막병증과 같은 망막 질환의 병태생리 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구 프로젝트는 싱가포르 국립 의료 연구 협의회 (National Medical Research Council, NMRC)의 New Investigator 기금으로 지원되었습니다. 연구팀은 2012 년 11 월부터 2012 년 10 월까지 National Medical Research Council (NMRC) 해외 연구 연수 펠로우 십을 통해 University University of London (UCL)의 안과 연구소 (IoO)에서 Agrawal 박사에게 제공 한 연구 훈련에 대해 감사를 표합니다. David Shima. Agrawal 박사는 시마 박사의 실험실에서 세포에 라벨을 붙이고 영상을 찍기위한 개념과 기술을 습득했습니다. 따라서 팀은 David Shima 교수, Kenith Meissner 박사, Peter Lundh 박사 및 Daiju Iwata 교수의 훈련 펠로우쉽 중 감독과지도를 인정하고자합니다.

이 연구에 사용 된 동물 프로토콜은 싱가포르 싱가포르 SingHealth의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻었으며 안과 / 안과 분야에서의 동물 사용을위한 안과 / 안과 연구 협회 (ARVO)의 성명서 연구. 1. 형광 염료를 이용한 적혈구 및 백혈구의 표지 <ol><li> 시약 준비 <ol><li> 멸균 된 증류수 1800 μL에 ICG 3 mg을 녹여 ICG (1.5 mg / mL)를 준비하십시오. 10x 인산 완충 식염수 (PBS) 200 μL를 추가합니다. </li><li> 멸균 증류수 6 ML에 1X PBS 4 ML을 추가하여 40 % 1X PBS를 준비합니다. 1x PBS 10 ML에 BSA 100 MG를 추가하여 PBS에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비합니다. BSA가 녹을 때까지 잘 섞는다. </li></ol></li><li> 밀도 구배 원심 분리를 이용한 적혈구 및 백혈구 분리 <ol><li> 생쥐 마취 (야생 타이(ARVO 지침에 따라 스케쥴 1에 따라) 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)의 조합을 사용하여 투여 하였다 (C57BL / 6). 페달 철수 반사 ( 즉 , 발가락 핀치)로 마취를 확인하십시오. </li><li> 29 게이지 바늘 (1 mL 주사기에 부착 됨)을 천천히 심장쪽으로 향하게하여 삽입하십시오. 바늘이 심장 안에 있는지 확인하려면 플런저를 약간 빼내고 혈액이 주사기 안으로 빠지는지 확인하십시오. 심장에서 0.8 - 1 mL의 피를 직접 뽑아냅니다. </li><li> 즉시 혈액 수집 튜브가 들어있는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (혈액 1.8 mL / mL)에 혈액을 옮기고 혈액 응고를 방지하기 위해 부드럽게 혼합하십시오. </li><li> pentobarbital (80mg / kg)을 복강 내 주사하여 마우스를 안락사하십시오. </li><li> 2 ML의 microcentrifuge 튜브와 centri에서 polysucrose과 나트륨 diatrizoate 솔루션 (1 : 1 비율, 밀도 1.077 g / ML)의 상단에 전혈을 계층화fuge (450 xg, 30 min)를 사용하여 혈장에서 백혈구와 적혈구를 분리시킵니다. </li><li> 피펫을 사용하여 상등액 (플라스마)을 제거하고 버립니다. 조심스럽게 피펫을 사용하여 버피 코트 (백혈구)와 적혈구 (적혈구 층)를 새롭고 분리 된 튜브로 옮깁니다. </li></ol></li><li> 적혈구의 ICG (1.5 %) 표지 <ol><li> 오염 물질을 제거하기 위해 1x PBS로 적혈구를 씻으십시오. 1x PBS (1 : 1)에 적혈구를 재 침투하여 50 % 헤마토크리트를 만듭니다. 50 % 헤마토크리트 0.5 mL (~ 250 μL 포장 된 적혈구)를 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 적혈구를 원심 분리하고 (750 xg, 5 분) 상등액을 버립니다. </li><li> pelleted erythrocytes에 40 % 1x PBS 200 μL를 추가 잘 혼합하고 5 분 동안 실온에서 품어. 적혈구 현탁액에 ICG (1.5 MG / ML)의 100 μL를 추가 튜브 부드럽게 혼합하여 5 분 실온에서 품어. 1x PBS 300 μL를 첨가하고쉐이커 배양기에서 37 ℃로 60 분간 방치 하였다. </li><li> 담체 적혈구 (750 xg, 3 분)를 원심 분리하고 1 ML 1X PBS에 resuspend. </li><li> 상청액이 맑아 때까지 1x PBS로 세포 ~ 3 ~ 5 번 씻으십시오 (1.3.3 단계). 마지막 세척 후 상층 액을 버리고 ICG 표지 된 적혈구의 50 % 헤마토크리트 (1.25 x 10 8 세포 / mL)를 얻기 위해 1 % BSA PBS (1 : 1)를 표지 된 미리 부풀린 적혈구에 첨가한다. </li></ol></li><li> 백혈구의 나트륨 fluorescein (1 %) 표시 <ol><li> 밀도 그라디언트 원심 분리 (단계 1.2.6에서)를 사용하여 혈액에서 버피 코트를 분리 후, 어떤 오염 물질을 제거하기 위해 10 분 동안 450xg에서 원심 분리하여 1x PBS 10 ML로 세포를 한 번 씻으십시오. 1x PBS 900 μL에 펠렛을 Resuspend. </li><li> 백혈구 현탁액의 900 μL에 10 % 나트륨 fluorescein의 100 μL를 추가하고 2 분 동안 실온에서 품어. centrifugi하여 10 ML 1X PBS로 세 번 레이블 세포를 씻으십시오ng (450 xg, 10 분). 100 μL 1X PBS에 세포를 Resuspend. </li></ol></li></ol> 2. 형광 라벨이 붙은 세포의 라이브 영상 <ol><li> ICG 표지 된 적혈구의 라이브 셀 이미징 <ol><li> 꼬리 정맥 또는 역 궤도 경로 를 통한 주사 용 세포를 준비하려면 ICG 표지 된 적혈구의 50 % 헤마토크리트를 1x PBS로 10 배 및 50 배 희석하여 각각 5 % 및 1 % 헤마토크리트 세포를 만듭니다. </li><li> 꼬리 정맥이 팽창하도록 5 분 동안 적외선 (250W 강도) 아래에 마우스를 놓습니다. 마우스를 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)로 복강 내 주사 (여기서는 스케줄 1에 따라 ARVO 지침에 따라)로 마취시킨다. </li><li> 눈의 각 동공을 0.5 % 트로피 아미드와 2.5 % 페닐에 프린 하이드로 클로라이드 한 방울로 증량하십시오. </li><li> 이미징을 위해 콘택트 렌즈를 한쪽 눈 위에 올려 놓습니다. 이미징을위한 매체로 안과 용 젤을 사용하고 건조를 방지하십시오.s의 각막. 마우스 눈의 굴절을 보상하기 위해 + 25 디옵터 렌즈가있는 공 촛점 레이저 스캐닝 검안경 (SLO) 카메라를 수정하십시오. </li><li> 마우스를 SLO 이미징 플랫폼 위에 놓습니다. 마우스의 각막이 SLO 기계의 광학 헤드를 향해 직면하는지 확인하십시오. </li><li> 이미징 모듈을 켭니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 &quot;New Patient&quot;버튼을 클릭하고 마우스 귀 태그 번호, 생년월일, 형광 염료의 백분율 및 분류 된 세포 유형과 같은 동물 식별 정보를 추가하십시오. <ol><li> 이미징 모듈을 조작하여 동물의 시신경을 이미징 스크린의 중앙에 배치합니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 &quot;Acquire&quot;버튼을 클릭하여 30 ° 또는 15 ° 앵글 뷰 설정으로 적외선 (IR) 안저 이미지를 가져옵니다. 망막의 중심, 동공 및 레이저의 광학 경로가 최상의 품질의 이미지를 얻기 위해 정렬되어 있는지 확인하십시오. <br/&gt; 참고 : 광학 경로는 조이스틱을 조작하여 가장 선명한 이미지와 최상의 조명 효과를 얻도록 조정됩니다. </li></ol></li><li> ICG 안저 영상을 가져 가라. <ol><li> ICG 필터 (790 nm)를 켜고 30 ° 또는 15 ° 각도로 카메라를 고속 모드로 설정하고 표준화를위한 모든 판독 값에 대해 ICG 밝기를 85로 설정하십시오. 제어판에서 &quot;Acquire&quot;버튼을 클릭하여 1 분 동안 8.8 / 15 프레임 / 초로 비디오 (기본 제어)를 촬영하십시오. </li></ol></li><li> 30 게이지 바늘에 부착 된 인슐린 주사기에 ICG로 표지 된 적혈구 100 μL를 넣으십시오. <ol><li> 꼬리 정맥 경로 를 통한 주사의 경우, 바늘 베벨을 꼬리 정맥에 삽입하십시오. 혈액이 주사기로 역류되었는지 확인하여 정맥 내 접근을 확인하고 혈액 순환 세포에 표식 세포를 주입하십시오. </li><li> retro-orbital 경로를 통한 주입의 경우, 눈에 인접한 바늘을 retro-orbital spac이자형. 주사기에 혈액의 역류를 확인하여 retro - orbital 액세스를 확인하고 순환에 라벨 세포를 주입. </li></ol></li><li> 주입 후 마우스를 재배치하고 IR 안저 영상 (단계 2.1.6.1 참조) 및 비디오를 ICG 필터 (단계 2.1.7.1 참조)로 가져옵니다. 망막 순환에서 라벨 세포는 세포 주입 직후 시각 수 있습니다. </li><li> 비디오 프레임을 획득 한 후 SLO보기 모듈 소프트웨어를 사용하여 비디오를 내보낼 때 .tiff 형식을 선택하여 비디오 시퀀스의 .tiff 이미지를 추출하십시오. 원하는 폴더에 파일을 저장하십시오. </li><li> 콘택트 렌즈를 꺼내 다른 눈 위에 올려 놓고 2.1.4 - 2.1.7 단계에 설명 된대로 이미징을 완료하십시오. </li><li> 이미징 후 마취에서 회복 될 때까지 체온을 유지하기 위해 마취 동물을 적외선 (250W) 아래에 두십시오. 동물이 완전히 회복되면 마우스를 다시 새장에 넣으십시오.</li></ol></li><li> 1 % sodium fluorescein으로 표지 된 백혈구의 라이브 셀 이미징 <ol><li> 마우스를 준비하고 2.1 절의 설명에 따라 장비를 설정하십시오. </li><li> 단계 2.1.4 - 2.1.6에서 설명한대로 마우스를 위치시키고 IR 안저 사진을 찍습니다. <ol><li> 표준화를 위해 모든 판독 값에 대해 30 ° 또는 15 ° 각도보기 및 85에서의 형광 강도를 갖는 고속 카메라 모드의 형광 물질 필터 (488 nm)를 사용하여 마우스의 형광 안저 혈관 조영상을 얻습니다. 8.8 / 15 프레임 / 초 (기준 2.1.7.1 참조)에 비디오 (기준선 제어)를 기록하십시오. 참고 : 여기서 여러 비디오 트랙 (1 분 비디오)이 서로 다른 시간 간격으로 획득되었습니다. </li></ol></li><li> 2.1.8 절에서 설명한대로 꼬리 정맥 또는 역 궤도 주사를 통해 마우스에 100 μL 표지 백혈구를 주사하십시오. </li><li> 주사 직후에 마우스를 위치시키고 IR 안저 영상 (단계 2.1.5 및 2.1.6 참조)과 fluo마우스의 혈관 조영술 재개 (2.2.2 절 참조). </li><li> 이미징 모듈의 초점 노브를 돌려 스캐닝 레이저의 초점을 조정하여 망막 또는 맥락막 혈관의 표시된 세포를 관찰합니다. </li><li> SLO보기 모듈 소프트웨어 (단계 2.1.10 참조)를 사용하여 비디오 프레임과 이미지를 가져 와서 원하는 폴더에 저장하십시오. </li><li> 절차가 끝나면 동물 관리를 위해 2.1.12 단계를 수행하십시오. </li></ol></li><li> MtrackJ 소프트웨어로 이미지 분석 <ol><li> &quot;파일&quot;을 클릭하여 ImageJ에서 이미지 시퀀스를 엽니 다. &quot;가져 오기&quot;를 선택하고 &quot;이미지 시퀀스&quot;를 선택하고 원하는 이미지 폴더를 선택한 다음 &quot;열기&quot;를 클릭하십시오. &quot;시퀀스 옵션&quot;팝업 창이 화면에 나타납니다. &quot;확인&quot;을 클릭하십시오; 이미지 시퀀스가 ​​열립니다. </li><li> &quot;이미지&quot;를 클릭하고 속도 측정을 위해 &quot;속성&quot;을 선택하여 이미지 비디오의 프레임 간격을 설정하십시오. 여기, 8.8 프레임es / s. </li><li> &quot;Plugins&quot;을 선택하여 MTrackJ 플러그인을여십시오. &quot;Tracking&quot;을 선택하고 &quot;MtrackJ&quot;를 선택하십시오. 메뉴가 나타납니다. </li><li> 추적 설정을 조정하려면 메뉴 아래의 &quot;추적&quot;을 선택하고 &quot;점 추가 후 다음 시간 프레임 색인으로 이동&quot;확인란을 선택하십시오. </li><li> 첫 번째 셀을 추적하십시오. <ol><li> 하나의 셀을 찾고 후속 프레임에서 동일한 셀을 추적하십시오. 메뉴에서 &quot;추가&quot;를 클릭하여 새 트랙을 추가하십시오. </li><li> 이미지 위에 커서를 놓고 (+ 기호) 적절한 셀을 클릭하십시오. 참고 : MTrackJ는 자동으로 다음 시간 프레임으로 이동하고 궤도의 첫 번째 점의 위치를 ​​표시하는 작은 원을 추가합니다. </li><li> 이미지 시퀀스의 프레임을 이동하면서 셀의 현재 위치를 계속 클릭합니다. 참고 : 때때로 궤도의 이전 점을 표시하는 원이 현재 위치를 보는 기능을 방해합니다. 이 경우,단계 2.3.5.3.1로 진행하십시오. <ol><li> 메뉴에서 &quot;표시&quot;를 클릭하고 &quot;현재 트랙 포인트 만 표시&quot;옵션을 선택하여 궤적의 표시 옵션을 변경하십시오. 모든 궤도를 보려면이 옵션의 선택을 취소하십시오. </li></ol></li><li> 첫 번째 셀의 궤도가 보일 때까지 계속 클릭하십시오. 그런 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하여 트랙을 저장하십시오. </li></ol></li><li> 두 번째 셀을 추적하십시오. <ol><li> 메뉴에서 &quot;추가&quot;를 클릭하여 새 트랙을 시작하십시오. 새 셀을 추적하려면 2.3.5.1 - 2.3.5.4 단계를 반복하십시오. 두 번째 트랙을 저장하려면 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 관찰 된 모든 추적 가능한 셀에 대해이 단계를 계속하십시오. 셀을 추적 한 후 메뉴 탭에서 &quot;측정&quot;및 &quot;확인&quot;을 클릭하여 결과를 가져옵니다. 참고 : 결과 창은 자동으로 열리 며 추후 분석을 위해 스프레드 시트에 저장하고 열 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다. 재정적 또는 이해 상충은 없습니다.

망막 및 맥락막 순환에서 혈류 역학을 연구하는 것은 많은 안구 질환의 병리 생리학을 이해하는 데 중요합니다. 망막 순환에서의 혈류 역학은 Fourier-domain optical coherence tomography (FD-OCT), laser speckle flowgraphy (LSFG) 및 망막 산소 측정법에 의해 연구 될 수있다. 이 방법은 망막 순환에서 총 혈류를 연구하기 위해 다른 접근법을 사용하지만 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 개별 세포 유형의 유동 역학을 연구 할 수 없다는 한계가 있습니다. 망막과 맥락막 조직에 영양분과 산소 공급뿐만 아니라 ...

망막 및 맥락막 순환에서 혈구의 유동 역학을 연구하면 잠재적으로 시력이 위협되는 안구 질환 및 기타 안구 염증성 질환의 병인을 이해하는 것이 필수적입니다. 그러나 혈장 단백질에 형광 염료를 결합시키는 기존의 혈관 조영술은 적혈구 또는 백혈구의 동력학에 관한 정보를 제공하지 않습니다 1 . 적혈구 망막 혈류 역학은 망막에서의 대사 적으로 효율적인 순환과 다양한 염증 조건에서 세포 이동, 인식, 부착 및 파괴를 이해하기위한 백혈구 유동 역학을 연구하는데 중요합니다 2 . 다양한 세포 유형 3 의 동정과 특성 규명에 사용되는 몇 가지 형광 분자가 있습니다. 혈액 세포의 혈류 역학은 적절한 형광으로 염색하여 측정 할 수 있습니다염료 및 적절한 이미징 기술 적용 4 . 연령 관련 황반변 성 (AMD)과 당뇨 망막 병증 (DR)과 같은 안구 질환에서 염증 반응의 존재는 병변에 림프구가 축적되는 것을 의미합니다 5 , 6 . 조직에서 면역 세포를 추적하면 질병 발병 기전과 관련된 복잡한 사건을 이해하는 데 도움이됩니다. 51 Cr과 125 I와 같은 방사성 동위 원소는 초기 연구에서 세포 추적자로 사용되었다. 이 염료는 독성이 있고 세포 생존 능력에 영향을줍니다. 방사성 마커 3 H와 14 C는 낮은 방출 에너지로 인해 세포에 덜 독성이 있지만 시스템 7,8 에서 신호를 검출하기가 어렵습니다. 여러 가지 형광 염료가 잠재적 인 문제를 극복하기 위해 도입되었습니다.i 방사능 마커 및 형광 현미경 및 유동 세포 계측법을 사용하여 체외에서 림프구 이동 을 추적 9,10 . Hoechst 33342와 thiazole orange는 DNA 결합 형광 염료이며, 생체 내에서 림프구를 추적하는데 사용됩니다 . Hoechst 33342는 DNA의 AT가 풍부한 영역에 결합하고, 막 투과성이며, 2 ~ 4 일 동안 형광 시그널을 유지하며 9 , 10 소실에 내성입니다. Hoechst 33342와 thiazole orange의 단점은 림프구 증식의 억제 11 과 짧은 반감기 9 입니다. (FDA), 2 &#39;, 7&#39;- 비스 - (2- 카르복시 에틸) -5- (및 -6) - 카르복시 플루 오레 신, 아세 톡시 메틸 에스테르 (BCECF-AM), 5- (및 -6) (CFDA) 및 5- (및 -6) - 카르복시 플루 오레 신 디 아세테이트 아세 톡시 메틸 에스테르 (CFDA-AM)림프구 이동 연구에 사용되는 세포질 형광 염료입니다. 그러나 FDA, CFDA 및 CFDA-AM은 세포 내 보유력이 낮습니다 9 . BCECF-AM은 증식 반응을 감소시키고 주 화성 및 과산화물 생산에 영향을 미친다. Calcein-AM은 형광 염료이며 단기 생체 내 림프구 이동 연구 에 유용합니다. 그것은 강한 형광 신호를 방출하고 대부분의 세포 기능을 방해하지 않으며 최대 3 일 동안 형광 신호를 유지합니다 12 , 13 . Fluorescein isothiocyanate (FITC)와 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)는 공유 결합 형광 염료이며 림프구 이동 연구에 사용됩니다. FITC는 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않으며 T 림프구보다 B 림프구에 더 강한 친 화성을 갖는다 14 , 15 </sup&gt;. CFDA-SE 표지 림프구는 8 주 이상 및 8 세포 분열 9 , 16 시간 동안 생체 내에서 추적 할 수 있습니다. C18 DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 및 PKH26은 막 - 백혈구 및 적혈구를 표지하기 위해 사용되는 형광 친 지성 카보시 아닌 염료를 삽입한다. C18 Dil과 DiO는 세포막에 결합 될 때 더 높은 신호를 나타내며 상대적으로 독성이 없습니다 12 , 17 . PKH2, PKH3 및 PKH26로 표지 된 세포는 독성이 적은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 의 형광 신호를 잘 유지합니다. 그러나, PKH2는 CD62L 발현을 감소시키고 ly를 감소시킨다<html> 림프구 생존율 23 . 상기 언급 된 대부분의 연구는 림프계에서 림프구 이동 및 증식을 추적하고 비 안과 순환에서 표지 된 적혈구를 연구하기 위해 수행되었다. 안과 순환에서 혈액 세포를 연구하기위한 표지 기술을 적용한 연구는 거의 없습니다. 주사 레이저 안검 내시경 (SLO)의 적용은 안저 혈관 조영술 24에 의한 생체 내 망막 및 맥락막 순환 에서 표지 된 세포를 연구하는데 큰 이점이 있습니다. SLG 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 30에 의해 망막 순환에서 백혈구를 연구하는데 사용되는 ICG, 아 크리 딘 오렌지, FITC, 나트륨 플루오 레세 인 및 CFDA와 같은 여러 가지 형광 염료가있다 .class = &quot;xref&quot;&gt; 31 , 32 , 33 , 34 . acridine 오렌지의 광 독성과 발암 성 26 , 27 , 세포 활동과 FITC의 간섭, 망막과 맥락막 혈관의 해상도를위한 혈관 내 조영제의 요구 사항은 생체 내 동물 실험 29 그들의 응용 프로그램을 제한합니다. Sodium fluorescein 및 ICG는 식품 의약품 안전청 (Food and Drug Administration)의 승인을 얻은 무독성이며 인체 검사시 안전합니다 32 , 35 . 유동 역학 연구의 대부분은 백혈구 또는 적혈구의 표지 및 망막 및 맥락막 혈관에서의 시각화와 관련이있다 36 , 37 , 38 , 39 </s업&gt;. 여기, 적혈구의 ICG 라벨링, 백혈구의 나트륨 fluorescein 라벨링, SLO를 사용하여 마우스 망막 순환에서 시각화 된 라벨 세포 추적 표준화 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Cardiogreen 폴리메틴 염료(Indocyanine green)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12633-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 100 mg/mL</td><td>Novartis</td><td>U1705A/H-1330292</td><td></td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 식염수(PBS) 초순수 등급</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>K2E(K2EDTA) - EDTA 농도 - 혈액 1.8 mg/mL의 마이크로테이너 튜브</td><td>BD, 미국</td><td>참조 365974</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-413-401</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>Insta BioAnalytik pte. ltd</td><td>FINE VORTEX</td><td></td></tr><tr><td>쉐이커 인큐베이터</td><td>Lab Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceva 케타민 주사 (케타민 염산염 100 mg/mL)</td><td>Ceva</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine 염산염 20 mg/Ml)</td><td>Troy Laboratories PTY. Limited</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)</td><td>Alcon&nbsp; Laboratories, Inc. 미국</td><td>NDC&nbsp; 0998-0355-15</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Mydfrin 5 mL (페닐에프린 염산염 2.5%)</td><td>Alcon&nbsp; Laboratories, Inc. 미국</td><td>NDC&nbsp; 0998-0342-05</td><td></td></tr><tr><td>바늘이 있는 테루모 주사기 1cc/mL Tuberculin</td><td>Terumo (Philippenes) Corporation, 필리핀</td><td>SS-01T2613</td><td></td></tr><tr><td>Vidisic Gel 10 G</td><td>Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>알코올 면봉</td><td>Assure 의료용 일회용품</td><td>7M-004-L-01</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 혈관 조영 시스템(Heidelberg Retina Angiograph 2)</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, 하이델베르크, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>ZEISS</td><td>모델: axio imager z1</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

망막 및 맥락막 혈류 역학은 녹내장, 당뇨병 성 망막증, 연령 관련 황반변 성 (AMD) 및 기타 안구 염증성 질환과 같은 다양한 안구 질환의 병태 생리 및 후유증에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 눈의 치료 반응을 모니터하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표지 세포의 살아있는 세포 이미징과 결합 혈액 세포의 적절한 라벨링, 망막과 맥락 순환에 흐름 역학의 조사 수 있습니다. 여기에서 마우스 적혈구 및 백혈구의 1.5 % indocyanine green (ICG) 및 1 % sodium fluorescein 표지의 표준화 된 프로토콜을 각각 설명합니다. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO)는 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 표지 된 세포를 시각화하기 위해 적용되었습니다. 두 방법 모두 생쥐 망막 순환에서 특이 적으로 형광 표지 된 세포를 보였다. 이러한 표지 방법은 다양한 안구 질환에서 더 넓은 적용 범위를 가질 수 있습니다모델.

1.5 % ICG로 표지 된 적혈구를 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 시각화 하였다. 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 및 5 % 헤마토크릿 모두 망막 순환에서 구별 할 수 있었다. 그러나 개별 표식 된 세포는 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 헤마토크리트로 더 명확하게 시각화되었습니다 ( 그림 1 ). 5 % 헤마토크리트에서 망막 혈관의 많은 수의 표식 세포로 인해 개별 세포를 표시 할 수 없었습니다. 두 조건 모두에서 약간의 erythrostasis가 peripapillary region에서 관찰되었지만, 표지 된 적혈구의 5 % 적혈구 용적률에서 더 두드러졌다 ( 그림 2 ). 백혈구는 상기 프로토콜에 따라 1...

안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다.

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

본 실험 과정의 전반적인 목표는 스캐닝 레이저 검안경을 사용하여 마우스의 망막 내 혈구 순환을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 백혈구(WBC)와 적혈구(RBC)의 망막 바닥 역학은 어떠한지, 그리고 이러한 흐름 역학이 질병의 병인에 어떻게 기여하는지와 같은 망막 질환에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 질병 표현형을 반영할 수 있으며 수행 방법이 매우 간편하다는 것입니다.이 절차는 저희 팀원인 Praveen, Bo Bo, Neha가 시연하겠습니다. 마우스 혈구 층을 분리하려면, 2 mL 튜브에 1:1 polysucrose와 sodium diatrizoate 용액을 넣고 그 위에 갓 채취한 전혈을 층분리하여 올립니다. 그런 다음 튜브를 30분 동안 원심분리합니다.다음으로 혈장 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 백혈구로 구성된 버피 코트(buffy coat) 층과 그 아래의 적혈구 층을 각각 별도의 튜브에 조심스럽게 수집합니다. 이어서 오염 물질을 제거하기 위해 적혈구를 1XPBS로 세척하고, PBS 1배수 부피로 재현탁합니다.그 다음 현탁액을 0.5 mL씩 분주하여 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 분주물을 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 침전된 적혈구에 약 200 µL의 40% 1XPBS를 첨가합니다. 이를 잘 혼합합니다.실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 각 현탁액에 100 µL의 ICG를 첨가합니다. 튜브를 뒤집어 섞은 후, 실온에서 5분 동안 배양합니다.다음으로 300 µL의 1XPBS를 추가하고 37 °C에서 완만하게 교반하며 1시간 동안 배양합니다. 그 다음 현탁액을 원심분리하여 펠렛 형태의 세포를 회수하고 1 mL의 1XPBS에 재현탁합니다. 상층액이 투명해질 때까지 1XPBS로 세포를 계속 세척합니다.상층액을 따라낸 후, ICG 표지 적혈구의 헤마토크릿 수치를 50%로 맞추기 위해 1% BSA와 PBS를 1배 부피만큼 다시 첨가합니다. 다음으로 버피 코트(buffy coat) 수집 과정을 진행합니다. 먼저 10 milliliters의 1XPBS로 세포를 한 번 세척하여 오염 물질을 제거합니다.샘플을 다시 원심분리한 다음 펠렛을 900 µL의 1X PBS에 재현탁합니다. 다음으로 10% sodium fluorescein 100 µL를 첨가하고 세포를 상온에서 2분 동안 배양합니다. 마지막으로 표지된 림프구를 10 mL의 1X PBS로 3회 세척합니다.원심 분리한 후 100 µL의 1XPBS에 다시 현탁합니다. 주사용 ICG 표지 적혈구를 준비하려면, 먼저 주사용 분취액을 헤마토크리트 5% 또는 1%가 되도록 희석합니다. 마우스를 마취하고 동공을 확장시킵니다.그런 다음 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다. 그리고 한쪽 눈에 콘택트렌즈를 착용시킵니다. 이제 안구의 굴절을 보정하기 위해 +25 디옵터 렌즈를 장착한 공초점 SLO 카메라를 사용하여 마우스를 촬영합니다.각막을 SLO 장비의 광학 헤드에 정확하게 맞춥니다. 다음으로 이미징 모듈을 켜고 시신경이 이미징 화면의 중심에 올 때까지 조절합니다. 그런 다음 30도 각도로 적외선 안저 영상을 촬영합니다.다음으로 적외선 안저 영상을 촬영합니다. 790 nanometer ICG 필터를 켜고 카메라 모드를 고속(high speed)으로 설정하며, 시야각은 15~30도로 유지합니다. 그런 다음 모든 측정값에 대해 ICG 강도를 85로 설정합니다.제어판에서 acquire 버튼을 클릭하여 초당 8.8~15 프레임의 속도로 1분 동안 기준 영상을 촬영합니다. 다음으로 30게이지 바늘이 달린 인슐린 주사기에 ICG 표지 적혈구 100 µL를 로드하여 꼬리 정맥에 주입하거나 안와 후방으로 주입합니다. 주입 직후, 새로운 적외선 안저 영상과 새로운 ICG 필터 영상을 촬영합니다.비디오를 획득한 후, 이미지 분석을 위해 TIFF 형식으로 내보냅니다. 무료로 제공되는 이미징 소프트웨어 패키지인 MHJ를 사용하여 이미지를 처리합니다. 파일을 연 후, 속도 측정을 위해 이미지 비디오의 프레임 간격을 설정합니다.그런 다음 MtrackJ 플러그인을 엽니다. 메뉴에서 tracking을 선택하고, 점을 추가한 후 다음 시간 프레임 인덱스로 이동하는 옵션을 활성화합니다. 이제 분석 대상 세포를 찾아 각 프레임별로 추적합니다.메뉴에서 'add'를 클릭하여 새 트랙을 추가한 다음, 선택한 세포를 클릭합니다. 이후 이미지가 프레임별로 진행됨에 따라 세포의 현재 위치를 계속해서 클릭합니다. 추적이 완료되면 궤적의 디스플레이 옵션을 표시 선택 항목에서 변경하여 현재 시간의 트랙 포인트만 표시하도록 선택합니다.세포의 궤적이 표시될 때까지 계속 클릭한 다음 트랙을 저장하십시오. 이제 add 명령으로 시작하여 첫 번째 세포와 동일한 방식으로 다음 세포의 추적을 진행하십시오. 관심 있는 모든 세포의 추적을 마친 후, measure 옵션을 사용하여 모든 트랙 측정값의 표시창을 여십시오.그 후 추가 분석을 위해 결과물을 저장합니다. 1.5% ICG로 표지된 적혈구를 1% 또는 5% hematocrit을 사용하여 C57 black 6J 마우스의 망막 혈류에서 시각화하였을 때, 세포 식별은 가능했으나 1% hematocrit에서 표지된 세포가 더 쉽게 관찰되었습니다. 주입 농도와 관계없이 유두 주변 부위에서 어느 정도의 적혈구 정체가 관찰되었으며, 이는 5% hematocrit에서 더 뚜렷하게 나타났습니다.백혈구를 1% sodium fluorescein으로 표지한 후, 형광 현미경을 사용하여 녹색으로 표지된 세포로 시각화하였습니다. 일부 응집 현상이 관찰되었습니다. 이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 고품질의 망막 이미지와 영상을 얻기 위해 동공을 확장하는 것이 중요합니다.

fluorescent-dye-labeling-erythrocytes-leukocytes-for-studying-flow

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

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가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 - 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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유세포 분석을 사용한 유리체 내 전달 형광 입자의 미세아교세포 흡수 측정

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망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

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생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

생쥐의 망막 혈관 구조는 혈관 패턴 형성의 메커니즘을 이해하는 데 특히 흥미롭습니다. 이 프로토콜은 광학 디스크에서 고정된 거리에서 형광 혈관 조영술 안저 영상에서 마우스 망막 혈관의 직경을 자동으로 측정합니다.

Mouse Fluorescent Angiography 이미지에서 망막 혈관 직경 측정

우리는 망막 혈관 구조와 부착 백혈구의 벽을 라벨링하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 이러한 부착 백혈구는 형광 현미경으로 염증의 매개 변수 또는 치료에 대한 염증의 반응으로 계산할 수 있습니다.

망막 혈관 구조에서 당뇨병 유발 부착 백혈구의 정량화

배우세요 마우스 망막 순환에서 적혈구와 백혈구의 유동 역학을 형광 염료로 표지하여 실시간 영상화하는 방법을. 이 기술은 당뇨병성 망막병증과 같은 망막 질환의 병태생리 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

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