마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

본 실험 과정의 전반적인 목표는 스캐닝 레이저 검안경을 사용하여 마우스의 망막 내 혈구 순환을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 백혈구(WBC)와 적혈구(RBC)의 망막 바닥 역학은 어떠한지, 그리고 이러한 흐름 역학이 질병의 병인에 어떻게 기여하는지와 같은 망막 질환에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 질병 표현형을 반영할 수 있으며 수행 방법이 매우 간편하다는 것입니다.

이 절차는 저희 팀원인 Praveen, Bo Bo, Neha가 시연하겠습니다. 마우스 혈구 층을 분리하려면, 2 mL 튜브에 1:1 polysucrose와 sodium diatrizoate 용액을 넣고 그 위에 갓 채취한 전혈을 층분리하여 올립니다. 그런 다음 튜브를 30분 동안 원심분리합니다.

다음으로 혈장 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 백혈구로 구성된 버피 코트(buffy coat) 층과 그 아래의 적혈구 층을 각각 별도의 튜브에 조심스럽게 수집합니다. 이어서 오염 물질을 제거하기 위해 적혈구를 1XPBS로 세척하고, PBS 1배수 부피로 재현탁합니다.

그 다음 현탁액을 0.5 mL씩 분주하여 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 분주물을 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 침전된 적혈구에 약 200 µL의 40% 1XPBS를 첨가합니다. 이를 잘 혼합합니다.

실온에서 5분 동안 배양합니다. 5분 후, 각 현탁액에 100 µL의 ICG를 첨가합니다. 튜브를 뒤집어 섞은 후, 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로 300 µL의 1XPBS를 추가하고 37 °C에서 완만하게 교반하며 1시간 동안 배양합니다. 그 다음 현탁액을 원심분리하여 펠렛 형태의 세포를 회수하고 1 mL의 1XPBS에 재현탁합니다. 상층액이 투명해질 때까지 1XPBS로 세포를 계속 세척합니다.

상층액을 따라낸 후, ICG 표지 적혈구의 헤마토크릿 수치를 50%로 맞추기 위해 1% BSA와 PBS를 1배 부피만큼 다시 첨가합니다. 다음으로 버피 코트(buffy coat) 수집 과정을 진행합니다. 먼저 10 milliliters의 1XPBS로 세포를 한 번 세척하여 오염 물질을 제거합니다.

샘플을 다시 원심분리한 다음 펠렛을 900 µL의 1X PBS에 재현탁합니다. 다음으로 10% sodium fluorescein 100 µL를 첨가하고 세포를 상온에서 2분 동안 배양합니다. 마지막으로 표지된 림프구를 10 mL의 1X PBS로 3회 세척합니다.

원심 분리한 후 100 µL의 1XPBS에 다시 현탁합니다. 주사용 ICG 표지 적혈구를 준비하려면, 먼저 주사용 분취액을 헤마토크리트 5% 또는 1%가 되도록 희석합니다. 마우스를 마취하고 동공을 확장시킵니다.

그런 다음 양쪽 눈에 안연고를 도포합니다. 그리고 한쪽 눈에 콘택트렌즈를 착용시킵니다. 이제 안구의 굴절을 보정하기 위해 +25 디옵터 렌즈를 장착한 공초점 SLO 카메라를 사용하여 마우스를 촬영합니다.

각막을 SLO 장비의 광학 헤드에 정확하게 맞춥니다. 다음으로 이미징 모듈을 켜고 시신경이 이미징 화면의 중심에 올 때까지 조절합니다. 그런 다음 30도 각도로 적외선 안저 영상을 촬영합니다.

다음으로 적외선 안저 영상을 촬영합니다. 790 nanometer ICG 필터를 켜고 카메라 모드를 고속(high speed)으로 설정하며, 시야각은 15~30도로 유지합니다. 그런 다음 모든 측정값에 대해 ICG 강도를 85로 설정합니다.

제어판에서 acquire 버튼을 클릭하여 초당 8.8~15 프레임의 속도로 1분 동안 기준 영상을 촬영합니다. 다음으로 30게이지 바늘이 달린 인슐린 주사기에 ICG 표지 적혈구 100 µL를 로드하여 꼬리 정맥에 주입하거나 안와 후방으로 주입합니다. 주입 직후, 새로운 적외선 안저 영상과 새로운 ICG 필터 영상을 촬영합니다.

비디오를 획득한 후, 이미지 분석을 위해 TIFF 형식으로 내보냅니다. 무료로 제공되는 이미징 소프트웨어 패키지인 MHJ를 사용하여 이미지를 처리합니다. 파일을 연 후, 속도 측정을 위해 이미지 비디오의 프레임 간격을 설정합니다.

그런 다음 MtrackJ 플러그인을 엽니다. 메뉴에서 tracking을 선택하고, 점을 추가한 후 다음 시간 프레임 인덱스로 이동하는 옵션을 활성화합니다. 이제 분석 대상 세포를 찾아 각 프레임별로 추적합니다.

메뉴에서 'add'를 클릭하여 새 트랙을 추가한 다음, 선택한 세포를 클릭합니다. 이후 이미지가 프레임별로 진행됨에 따라 세포의 현재 위치를 계속해서 클릭합니다. 추적이 완료되면 궤적의 디스플레이 옵션을 표시 선택 항목에서 변경하여 현재 시간의 트랙 포인트만 표시하도록 선택합니다.

세포의 궤적이 표시될 때까지 계속 클릭한 다음 트랙을 저장하십시오. 이제 add 명령으로 시작하여 첫 번째 세포와 동일한 방식으로 다음 세포의 추적을 진행하십시오. 관심 있는 모든 세포의 추적을 마친 후, measure 옵션을 사용하여 모든 트랙 측정값의 표시창을 여십시오.

그 후 추가 분석을 위해 결과물을 저장합니다. 1.5% ICG로 표지된 적혈구를 1% 또는 5% hematocrit을 사용하여 C57 black 6J 마우스의 망막 혈류에서 시각화하였을 때, 세포 식별은 가능했으나 1% hematocrit에서 표지된 세포가 더 쉽게 관찰되었습니다. 주입 농도와 관계없이 유두 주변 부위에서 어느 정도의 적혈구 정체가 관찰되었으며, 이는 5% hematocrit에서 더 뚜렷하게 나타났습니다.

백혈구를 1% sodium fluorescein으로 표지한 후, 형광 현미경을 사용하여 녹색으로 표지된 세포로 시각화하였습니다. 일부 응집 현상이 관찰되었습니다. 이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 고품질의 망막 이미지와 영상을 얻기 위해 동공을 확장하는 것이 중요합니다.