효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근

이 방법의 전반적인 목표는 고유한 ATP 의존적 정제 단계를 사용하여 박테리아 발현 시스템으로부터 거의 순수하고 촉매 활성을 가진 G-quadruplex helicase G4 Resolvase1 단백질을 분리하는 것입니다. 이 방법은 연구자가 광범위한 인 비트로(in vitro) 생화학 분석에 사용할 수 있는 거의 순수하고 촉매 활성이 있는 재조합 G4 Resolvase1 단백질을 얻는 데 도움을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 준비 과정에서 잘못 접히거나 촉매 활성이 없는 효소를 배제할 수 있다는 점입니다.

매우 높은 염 농도에서도 G4 비드에서 촉매 활성 효소를 용출시킬 수 없었던 점에 착안하여, ATP를 사용하여 G-quadruplex 헬리케이스를 용출시키는 아이디어가 고안되었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 G-quadruplex Resolvase1 또는 G4R1을 발현하는 대량의 박테리아 배양액을 준비하고 성장시키십시오. 실온에서 3 mL의 TN 버퍼로 박테리아 펠릿을 해동하십시오.

병을 손에 쥐고 회전시켜 박테리아 펠렛을 해동 및 재현탁합니다. 해동 후 비교적 균일하게 현탁되면 TN 버퍼를 사용하여 부피를 5 mL로 맞춥니다. 다음으로, 배양액당 20 mg의 lysozyme을 250 µL의 물에 녹여 재현탁된 박테리아에 첨가합니다.

병을 손으로 가볍게 흔들어주며 약 5~10분 동안 lysozyme이 박테리아를 용해하도록 둡니다. 용해가 진행됨에 따라 현탁액의 색이 약간 밝아지기 시작하며, 현탁액의 점도는 상대적으로 낮아집니다. PIC로 약칭되는 protease inhibitor cocktail 250 µL를 첨가합니다.

그 다음, leupeptin 10 µL aliquot 하나를 첨가하고 충분히 혼합합니다. 현탁액을 얼음에 두고 차가운 TN buffer 10 mL와 beta mercaptoethanol 또는 BME 22 µL를 첨가합니다. 현탁액을 50 mL 튜브로 옮깁니다.

디지털 초음파 파쇄기를 30% 진폭으로 설정하여 얼음 위에서 박테리아를 초음파 처리합니다. 2초 작동 후 2초 정지하는 펄스 방식으로 1분 동안 수행합니다. 초음파 처리 단계를 3회 반복하며, 각 단계 사이에 샘플을 얼음 위에서 최소 2분 동안 냉각시킵니다.

다음으로, 냉각된 4X saline sodium citrate(SSC) 또는 SSC에 BME, PIC 및 leupeptin을 추가한 것과 동일한 부피를 넣고 현탁액을 혼합합니다. 4°C로 사전 냉각된 tabletop centrifuge에서 용해물을 2,300 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 사전 냉각된 새 50 mL 튜브로 옮깁니다.

배양액당 1 mL의 streptavidin paramagnetic beads(또는 SPB 현탁액)를 취하여 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 자석을 사용하여 SPB를 펠렛화합니다. 그 다음 2X SSC 및 5 mM EDTA pH8로 SPB를 두 번 세척합니다.

다음으로, 세척한 SPB를 동일한 용액 200 microliters에 재현탁합니다. 3 OD 분량의 G4 DNA 한 알리코트를 SPB 현탁액에 첨가합니다. 피펫팅을 여러 번 빠르게 반복하여 혼합합니다.

그런 다음, 튜브를 로테이터에 넣고 상온에서 최소 30분 동안 회전시킵니다. 회전 과정이 끝나면 0.4% lactalbumin 1mL를 첨가하여 G4가 결합된 SPB를 블로킹하고, 필요할 때까지 얼음 위에 보관합니다. 히스티딘 태그가 붙은 재조합 G4R1을 코발트 비드에 결합시키기 위해, 정제된 박테리아 용해물이 담긴 각 50mL 튜브에 코발트 비드 슬러리 1mL를 첨가합니다.

혼합물을 회전시키며 상온에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 4°C 탁상 원심분리기를 사용하여 코발트 비즈를 110 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 액체를 조심스럽게 흡입하여 제거하되, 침전된 코발트 비즈가 흐트러지지 않도록 수 밀리리터의 액체는 남겨둡니다.

그 다음, 10~15 mL의 차가운 4X SSC 및 BME로 비드를 세척하고, 이전과 동일하게 비드를 펠렛화합니다. 다음으로 정제된 용해물을 펠렛화된 코발트 비드 위에 붓습니다. 회전기 위에서 실온으로 20분 더 인큐베이션한 후, 10~15 mL의 4X SSC 및 BME로 비드를 세척합니다.

그 다음, 4°C에서 100 ×g로 5분 동안 비드를 원심 분리하여 침전시킵니다. 두 번째 세척 후, 액체를 흡입하여 제거하고 튜브 바닥에 비드와 액체를 약 2 mL 남깁니다. 1 mL wide bore 피펫 팁을 사용하여 단백질이 결합된 코발트 비드를 미리 냉각된 2 mL 튜브로 옮깁니다.

4°C의 마이크로원심분리기를 사용하여 2mL 튜브에 담긴 비드를 고속으로 짧게 원심분리합니다. 단백질이 결합된 코발트 비드가 손실되지 않도록 주의하며 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 히스티딘 용출 버퍼(HEB) 0.5mL를 비드 위에 피펫으로 가한 뒤, 튜브를 뒤집어 비드를 재현탁합니다.

그런 다음 코발트 비드를 HEB에 넣어 저온실 내의 로테이터에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 현탁액을 4°C 마이크로 원심분리기에서 18,000 ×g로 1분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 조심스럽게 단백질이 포함된 상층액을 제거하되, 코발트 비드 위에 소량의 액체가 남도록 합니다.

상층액을 미리 냉각시킨 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 총 3회의 HEB 용출 과정 동안 반복합니다. 그 후 pH 6.0의 0.2 molar EDTA로 1회 용출합니다.

EDTA가 코발트를 킬레이트함에 따라 코발트 비드의 색상이 분홍색에서 흰색으로 변합니다. 이 네 번째이자 마지막 용출액을 15 mL 튜브로 옮긴 후, 1 mL 피펫 팁 끝에 겔 로딩 팁을 장착하여 코발트 비드에 남아 있는 잔류 용출 버퍼를 피펫팅하십시오. 팁을 튜브 바닥까지 밀어 넣어 단백질이 포함된 잔류 용출 버퍼를 수집할 수 있습니다.

자석을 이용하여 준비된 G4 SPB를 튜브 벽면으로 이동시킨 후 상층액을 제거합니다. 그런 다음, G4 SPB에 3X res buffer 1 mL를 첨가하고 피펫으로 섞어줍니다. 3X res buffer에 부유된 G4 SPB를 약 2 mL의 단백질 함유 HEB EDTA가 들어 있는 15 mL 튜브에 피펫으로 옮깁니다.

비드가 가라앉지 않도록 가끔씩 흔들어주며 37 °C 항온수조에서 15분 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질이 결합된 G4 SPB를 세척한 후, 자석을 이용하여 얼음 위에서 G4 SPB를 펠렛화하고, 미리 데워둔 용출 버퍼 100 µL에 비드를 재현탁합니다. 비드를 즉시 미리 데워둔 PCR 튜브로 옮기고 37 °C에서 30초 동안 배양합니다.

5 M NaCl 12 µL를 즉시 첨가하고 피펫으로 20~30회 격렬하게 섞어줍니다. 고농도의 염과 용출 버퍼에 포함된 ATP의 조합은 G4 비즈로부터 재조합 G4R1을 용출시키는 역할을 합니다. 자석을 이용하여 G4 SPB를 즉시 펠렛화하고, 단백질이 포함된 용출액을 얼음 위에 놓인 새로운 PCR 튜브로 옮깁니다.

용출과 전이를 반복한 후, 최종 생성물은 정제된 재조합 G4R1이 포함된 약 200 µL의 용출 버퍼입니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고활성 재조합 G4R1이 정제되었는지 확인하기 위해 품질 관리 효소 활성 분석을 수행하십시오. G4 분석을 통해 재조합 G4R1의 효소 활성도를 측정할 수 있습니다.

효소의 0.2에서 0.013 µL 범위 내에서, tetramethylrhodamine이 표지된 tetramolecular G4 DNA 0.2 pmol의 50%가 단량체로 전환되는 것이 일반적으로 관찰됩니다. 정제된 재조합 G4R1의 Coomassie 염색 결과, 예상 크기인 120 kDa에서 단일 밴드가 나타났으며, 약 75 kDa에서 소량의 오염 밴드가 확인되었습니다. 이 밴드는 G4 DNA 비드에 결합하여 ATP 의존적 방식으로 용출되는 능력을 유지하고 있는 절단된 재조합 G4R1을 나타내는 것일 수 있습니다.

관심 밴드는 단백질 표준 곡선을 기준으로 정량화합니다. 이 프로토콜을 통해 일반적으로 박테리아 배양액 1L당 20~100 nM 농도의 정제된 효소 200 µL를 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 고유한 ATP 의존적 정제 단계를 사용하여 박테리아 발현 시스템으로부터 거의 순수하고 촉매 활성이 있는 G4 Resolvase1 단백질을 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

숙련된 상태에서 냉동 박테리아 펠렛이 미리 준비되어 있다면, 재조합 G4R1의 정제는 약 6시간 만에 수행할 수 있습니다. 효소의 최적 촉매 활성을 유지하기 위해 별도의 언급이 없는 한 준비물을 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다. 항상 프로테아제 억제제를 사용하십시오.

튜브 내에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 정제된 효소를 빠르게 냉동하고, 불필요한 동결-해동 반복을 피하십시오. 이 기술은 개발 이후, 연구자들이 광범위한 DNA 및 RNA 기질에 대한 이 단백질의 결합 친화도와 헬리케이스 활성을 정확하게 정의할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 방법은 효소 반응의 생성물이 더 이상 효소의 결합 기질이 되지 않는 다른 ATP 의존성 핵산 효소의 정제에도 적용될 수 있습니다.