효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근

이 방법의 전반적인 목표는 고유한 ATP 의존성 정제 단계를 사용하여 박테리아 발현 시스템에서 G-quadruplex helicase G4 Resolvase1 단백질을 분리하여 거의 순수하고 촉매 활성이 높은 효소를 분리하는 것입니다. 이 방법은 연구자들이 광범위한 체외 생화학 분석에서 거의 순수하고 촉매 활성인 재조합 G4 Resolvase1 단백질을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 제제에서 잘못 접히거나 촉매적으로 비활성 효소를 제외한다는 것입니다.

ATP를 사용하여 G-quadruplex helicase를 용리시키려는 아이디어는 예외적으로 높은 염 농도에서도 G4 beads에서 촉매 활성 효소를 용리화할 수 없었기 때문에 시작되었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 G-quadruplex Resolvase1 또는 G4R1을 발현하는 대규모 박테리아 배양을 준비하고 성장시킵니다. 박테리아 펠릿을 실온에서 3ml의 TN 완충액으로 해동합니다.

병을 손에 들고 소용돌이쳐 박테리아 펠릿을 해동하고 다시 현탁시킵니다. 일단 해동되고 비교적 고르게 매달려 있으면 TN 버퍼로 부피를 최대 5ml까지 가져옵니다. 다음으로, 배양액당 250마이크로리터의 물에 20mg의 라이소자임을 용해시키고 재현탁된 박테리아에 추가합니다.

라이소자임이 약 5분에서 10분 동안 박테리아를 소화하도록 하면서 손에 든 병을 휘젓습니다. 현탁액의 색은 소화가 진행됨에 따라 약간 밝아지기 시작하고 현탁액은 상대적으로 점성이 없습니다. 250마이크로리터의 프로테아제 억제제 칵테일 약칭 PIC를 추가합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 루펩틴 분취액 1개를 넣고 철저히 섞습니다. 현탁액을 얼음 위에 놓고 10ml의 차가운 TN 완충액과 22마이크로리터의 베타 메르캅토에탄올 또는 BME를 추가합니다. 서스펜션을 50ml 튜브로 옮깁니다.

30% 진폭으로 설정된 디지털 초음파 발생기로 얼음 위의 박테리아를 초음파 처리합니다. 2초 동안 켜고 2초 동안 1분 동안 펄스를 켤 수 있습니다. 초음파 처리를 세 번 반복하여 초음파 처리 단계 사이에 최소 2분 동안 샘플을 얼음에서 식힙니다.

다음으로, 차가운 4 X 식염수 구연산나트륨 또는 SSC와 BME, PIC 및 류펩틴을 동일한 부피로 첨가하고 현탁액을 혼합합니다. 섭씨 4도로 사전 냉각된 탁상용 원심분리기에서 2, 300회 G에서 20분 동안 용해물을 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 미리 냉각된 새 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.

배양액당 1ml의 streptavidin 상자성 비드 또는 SPB 현탁액을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 자석으로 SPB를 펠릿화합니다. 그런 다음 2개의 X SSC와 5개의 밀리몰 EDTA PH8로 SPB를 두 번 세척합니다.

다음으로, 세척된 SPB를 동일한 용액 200마이크로리터에 재현탁합니다. SPB 현탁액에 G4 DNA의 3 OD 부분 표본 1개를 추가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 빠르게 혼합합니다.

그런 다음 튜브를 회전기에 놓고 실온에서 최소 30분 동안 회전합니다. 이 회전 기간이 지나면 0.4% 락트알부민 1ml를 첨가하여 G4 결합 SPB를 차단하고 필요할 때까지 얼음에 보관합니다. 히스티딘 태그가 지정된 재조합 G4R1을 코발트 비드에 결합하려면 정화된 박테리아 용해물이 들어 있는 각 50ml 튜브에 1ml의 코발트 비드 슬러리를 추가합니다.

혼합물을 회전체에서 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후 섭씨 4도의 탁상용 원심분리기에서 5분 동안 110배 G로 코발트 비드를 스핀다운합니다. 액체를 조심스럽게 흡입하고 펠릿 코발트 비드를 방해하지 않도록 몇 밀리리터의 액체를 남겨 두십시오.

그런 다음 10-15 밀리리터의 차가운 4 X SSC와 BME로 비드를 씻고 이전과 같이 비드를 펠릿으로 만듭니다. 다음 정화 용해물을 펠릿 코발트 비드에 붓습니다. 로테이터에서 실온에서 20분 더 배양하고 10-15ml의 4 X SSC와 BME로 비드를 세척합니다.

그런 다음 구슬을 섭씨 4도에서 5분 동안 100배 G로 펠릿화합니다. 두 번째 세척 후 액체를 흡입하고 튜브 바닥에 약 2ml의 구슬과 액체를 남겨 둡니다. 1ml 너비의 보어 피펫 팁을 사용하여 단백질 결합 코발트 비드를 사전 냉각된 2ml 튜브로 옮깁니다.

2밀리리터 튜브의 비드를 섭씨 4도의 마이크로 원심분리기에서 고속으로 간단히 원심분리합니다. 피펫팅을 통해 상층액을 부드럽게 제거하고 버리며, 단백질 결합 코발트 비드를 잃지 않도록 주의합니다. 0.5ml의 히스티딘 용출 완충액 또는 HEB를 비드에 피펫팅하고 튜브를 뒤집어 재현탁합니다.

그런 다음 차가운 방에서 5 분 동안 회전기에 HEB의 코발트 비드를 배양합니다. 다음으로, 18, 000 시간 G에서 1 분 동안 섭씨 4도 마이크로 원심 분리기에서 현탁액을 원심 분리하십시오. 코발트 비드 위에 소량의 액체를 남기고 조심스럽게 피펫팅하여 상등액을 함유한 단백질을 부드럽게 제거합니다.

상등액을 미리 냉각된 15ml 튜브로 옮깁니다. 총 3개의 HEB 용리에 대해 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 PH 6.0에서 0.2 몰 EDTA로 한 번 용리합니다.

코발트 비드의 색상은 EDTA가 코발트를 킬레이트화함에 따라 분홍색에서 흰색으로 바뀝니다. 이 네 번째이자 마지막 용리액을 15ml 튜브로 옮긴 후, 1ml 피펫 팁 끝에 있는 겔 로딩 팁을 사용하여 코발트 비드의 잔류 용리 완충액을 피펫팅합니다. 팁을 튜브 바닥으로 떨어뜨리면 용리 완충액이 포함된 잔류 단백질을 수집할 수 있습니다.

준비된 G4 SPB를 자석으로 튜브 측면으로 파일럿하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 1ml의 3 X res 버퍼를 G4 SPB와 피펫에 추가하여 혼합합니다. HEB EDTA를 함유한 약 2밀리리터의 단백질이 들어 있는 15밀리리터 튜브에 3개의 X 해상도 버퍼에 현탁된 G4 SPB를 피펫팅합니다.

구슬이 가라앉지 않도록 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 가끔 저어줍니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 결합 G4 SPB를 세척한 후 G4 SPB를 얼음 위에 자석으로 펠릿화하고 비드를 100마이크로리터의 사전 예열 용리 완충액에 재현탁합니다. 즉시 비드를 사전 예열된 PCR 튜브에 옮기고 섭씨 37도에서 30초 동안 배양합니다.

즉시 12마이크로리터의 5몰 염화나트륨과 피펫을 위아래로 격렬하게 20-30회 첨가합니다. 용리 완충액에 함유된 고염과 ATP의 조합은 G4 비드에서 재조합 G4R1을 용리하는 역할을 합니다. 즉시 G4 SPB를 자석으로 펠릿화하고 용리액이 포함된 단백질을 얼음 위의 새 PCR 튜브로 옮깁니다.

용출 및 이동을 반복한 후 최종 생성물은 정제된 재조합 G4R1을 함유하는 약 200마이크로리터의 용출 완충액입니다. 마지막으로, 품질 관리 효소 활성 분석을 수행하여 고활성 재조합 G4R1이 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정제되었는지 여부를 테스트합니다. G4 분석은 재조합 G4R1 효소 활성의 척도를 제공합니다.

효소의 0.2 내지 0.013 μlit 범위 내에서 일반적으로 0.2 피코몰의 테트라메틸로다민으로 표지된 테트라분자 G4 DNA의 50%가 단량체로 전환되는 것이 관찰됩니다. 정제된 재조합 G4R1의 Coomassie 스탠딩은 예상되는 120킬로달톤 크기의 단일 밴드와 약 75킬로달톤의 경미한 오염 밴드를 나타냅니다. 이 밴드는 ATP 의존적 방식으로 G4 DNA 비드를 용리로 결합하는 능력을 유지해 온 절단된 재조합 G4R1을 나타낼 수 있습니다.

관심 대역은 단백질 표준 곡선에 대해 정량화됩니다. 이 프로토콜은 일반적으로 박테리아 배양 1리터당 200마이크로리터의 20-100나노몰 정제 효소를 얻습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 거의 순수하고 촉매 활성이 높은 효소를 분리하기 위해 고유한 ATP 의존성 정제 단계를 사용하여 박테리아 발현 시스템에서 G4 Resolvase1 단백질을 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

마스터링이 완료되고 동결 박테리아 펠릿을 미리 준비하면 재조합 G4R1의 정제는 약 6시간 내에 수행할 수 있습니다. 효소의 최적의 촉매 활성을 유지하려면 달리 명시되지 않는 한 제제를 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다. 항상 프로테아제 억제제를 사용하십시오.

튜브에 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 정제된 효소를 신속하게 동결하고 불필요한 동결 해동 주기를 피하십시오. 개발 후 이 기술은 해당 분야의 연구자들이 광범위한 DNA 및 RNA 기질에 대한 이 단백질의 결합 친화도 및 헬리카제 활성을 정확하게 정의할 수 있는 길을 열었습니다.

이 방법은 또한 효소 반응의 생성물이 더 이상 효소의 결합 기질이 아닌 다른 ATP 의존성 핵산 효소의 정제에 적용할 수 있습니다.