Name: 효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 배우세요 G4 Resolvase1 단백질을 ATP 의존적 정화법으로 세균 발현 시스템에서 분리하는 방법을. 이 기술은 활성 효소를 얻어 다양한 생화학 분석에 활용할 수 있게 합니다.

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우리는 (JPV까지) 도자기 재단의 관대 한 선물을 포함하여, 우리의 재원을 감사드립니다 (PJS에) (PJS에) HealthGrant T32-CA079448 및 볼 주립 대학 시작 기금의 국립 연구소. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에 아무런 역할을하지 않았다.

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<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
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<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
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저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜은 DHX36 유전자 산물, G4-Resolvase1 (또한 RHAU 및 DHX36라고 G4R1) (그림 1)의 분리를위한 고효율 발현, 정제 및 정량 방식을 나타냅니다. G4-DNA 접합 구슬에 대한 그의 태그 친 화성 코발트 친 화성 구슬 정화 및 효소 정제 :이 프로토콜은 두 개의 정제 단계를 사용합니다. 후자 단계는 rG4R1는 G4 구조물 가진 꽉 선호도 높은 특이성 및 풀림 촉매 활성을 활용하는 것을 독특하다. G4 구조물 타이트 화성 (낮은 오후 범위 K D는) 상당히 비 - 특이 단백질의 존재를 감소시키는 G4 비드로부터 높은 염 (염화나트륨의 용해도 한계에 가까운) 세탁 전 용출을 허용한다. G4 구조물에 G4R1의 촉매 활성에는 ATP와의 MgCl 2를 첨가시 활성화 rG4R1 특정 용출을 허용한다. 이러한 2 단계의 정제 기법은 일관 고순도 생산대부분의 생화학 적 분석에 적합한 수량 rG4R1 (...

G4 구조는 DNA와 RNA의 구아닌이 풍부한 지역 내에 형성 안정성이 높은 핵산 차 구조이다. G4 구조 훅 스틴 - 결합 상호 작용을 통해 안정화 크게 G4 구조 (1, 2)의 주목할만한 열적 안정성에 기여하는 가의 양이온 (예. K +와 + 나)와 중앙 공동 내에 결합을 조정한다. 초기 생물 정보학 연구는 인간 게놈&gt; 375,000 &quot;잠재적 인 G4 형성 모티브&quot;3, 4 포함하는 것이 좋습니다. 최근의 연구 평가는 다른 연구는 인간 게놈 6 716310 별개의 잠재적 인 G4 형성 순서를 예측하면서 G4 주제의 수는 2-5 5 배 정도 높은 것이 좋습니다. G4는-형성하는 서열은 진화 적으로 보존 무작위로 분산되지 않습니다게놈. G4 주제는 유전자의 코딩 지역에서 농축되고, 모든 유전자 프로모터의 40 %의 위쪽으로는 G4 모티브 (7)를 포함한다. 흥미롭게도, 유전자의 G4 모티프의 농축 정도는 유전자의 기능을 제시하는 것으로 입증되었다. 예를 들면, 현상에 관여하는 프로토 - 암 유전자 및 유전자는 종양 억제 유전자 8,9보다 G4 구조 훨씬 더 농축있다. 높은 열 안정성으로 게놈 전체에서 거의 어디에나 존재 상당히 중요한 세포 과정에 영향을 미칠 가능성이, 상기 셀은 이러한 구조를 관리하기 위해 효소를 진화 것을 발견 놀랍지이다. 우리는 인간 (헬라) 세포 10 tetramolecular G4-DNA 해결 활동의 대부분의 소스로 특징으로 하나의 효소는 G4 Resolvase1 (또한 RHAU 및 DHX36라고 G4R1)입니다. 그 이후로,이 표시되어 그쪽으로t G4R1 단단히 바인딩 및 촉매 G4 결합 단백질 11, 12, 13에 대한 엄격한보고 된 KDS와 tetramolecular 및 단 분자 G4-DNA와 G4-RNA가 풀릴. 또한 G4R1의 G4 분해하는 활성 텔로미어 / 텔로 머라 생물학 11, 14, 15, 16, 전사 및 접합 17, 18, 19, 20, 개발 21 조혈 포함 생화학 및 세포 과정의 다양한 연루되었는지 (21), 및 면역 조절 22, 23. G4 시퀀스의 우세는 특히 게놈 및 다양한 휴대 페이지에 걸쳐 위치하고로G4R1 최근 표현 효율적이 단백질의 생화학 적 메커니즘과 동작을 밝히기 위해 rG4R1가 매우 중요 할 것이다 활성이 높은 정화 능력에 관여하는 연루되었는지 rocesses. 여기서 우리는 새로운 표현하고 효율적으로 활성 효소를 분리 rG4R1의 ATP 의존, G4-해결 활동을 활용 정화 방식 (그림 1)를 보여줍니다. G4R1 대한 경우와 같이,이 방식은, 효소 반응의 생성물은 더 이상 바인딩 기재되는 다른 ATP 의존성 핵산 효소를 정제하도록 채택 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS competent cells</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco 대단한 국물</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C1919</td><td>35 &마이크로; 박테리아 플레이트/대규모 배양에서 g/mL</td></tr><tr><td>카르베니실린(식물 세포 배양 테스트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &마이크로; 박테리아 플레이트/대규모 배양에서 g/mL</td></tr><tr><td>이소프로필&베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)</td><td>시그마-알드리치</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>리소자임(닭 달걀 흰자위에서)</td><td>시그마-알드리치</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1963-B</td><td>또는 표준 소스</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1966</td><td>년 또는 표준 소스</td></tr><tr><td>1.5 M Tris-HCl, pH 8.8</td><td></td><td></td><td>주조 분해능 젤 (단백질 정량 젤 용); 표준 소스</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.8</td><td></td><td></td><td>캐스팅 스태킹 젤 (단백질 정량 젤 용); 표준 소스</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetate, pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1981</td><td>또는 표준 소스</td></tr><tr><td>70 % 에탄올</td><td></td><td></td><td>표준 소스 염화</td></tr><tr><td>마그네슘 (1&nbsp; M solution)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>나트륨 Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1665</td><td>또는 표준 소스에서</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin hemisulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin paramagnetic beads</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8&nbsp;</td><td>유니버설 사이언티픽 서플라이 컴퍼니&nbsp;</td><td>0718</td><td>또는 표준 소스</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td></td><td>표준 공급원에서; 처음에는 NaOH로 pH를 조정한 다음 HCl로 pH를 다시 조정하십시오.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>A-락트알부민(소 우유에서 추출한 유형 1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>코발트 금속 친화성 비드</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-히스티딘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>아세트산, 빙하</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트(박테리아 소스에서)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/Bis 용액 (37.5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>으로 단백질 젤 러닝 버퍼를 만들기 위해 (192 mM 글리신, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)</td></tr><tr><td>10% 소듐 도데실 설페이트 (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1667</td><td>은 단백질 젤 러닝 버퍼(192 mM 글리신, 25 mM 트리스 베이스, 0.1% SDS)를 만들기 위해; 또는 표준 소스</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td><td>시그마-알드리치(Sigma-Aldrich</td><td>) 11666703001</td><td>또는 표준 소스</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP152-1</td><td>을 사용하여 단백질 겔 러닝 버퍼(192mM 글리신, 25mM 트리스 베이스, 0.1% SDS)를 만듭니다. 표준 출처:</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range Protein MW markers</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio")</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-비오틴 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 올리고 ("Z33-TAM")</td> <td>올리고 등</td><td></td><td>5' 탐라-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>형광 코팅 TLC 플레이트</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% in H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>멀티밴드 UV 램프</td><td></td><td></td> 365nm에서 UV <td>광선을 방출할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>탁상용 원심 분리기 (스윙 버킷 로터 포함)</td><td></td><td></td> <td>4 °C까지 냉각 가능; C</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td>4°C까지 냉각 가능; C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>또는 초음파 처리 펄스를 전달할 수 있는 동급 (30% 진폭, 2초 ON/2초 OFF)</td></tr><tr><td>50 & deg; C 수조</td><td></td><td></td><td>Z33을 4 중</td></tr><tr><td>37 &deg로 형성하기 위해; 박테리아</td><td></td><td></td>를 위한 C 인큐베이터 <td>TriEx4-DHX36 37 &deg로 형질전환된 Rosetta2 E. coli의 대규모 배양물의 박테리아 형질전환 및 초기 하룻밤 성장</td></tr><tr><td>용; C/14&nbsp; &데그; 박테리아를 위한 C 진탕 인큐베이터</td> OD600을 판독할 수 있는 <td>TriEx4-DHX36 분광광도계로 변형된 Rosetta2 E. coli의 대규모 배양물의 성장 및 단백질 유도,</td>염기 염기서열에 따라 올리고머 농도 판독 가능(예: Biorad SmartSpec 3000)온도계 표준 소스 PCR 스트립 튜브에서 발췌 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>표준 소스</td></tr><tr><td>15 및 50 mL 원심분리 튜브(폴리프로필렌)</td><td></td><td></td><td>표준 소스</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리 튜브(2.0 mL)</td><td></td><td></td><td>표준 소스</td></tr><tr><td>500 mL 원심분리 병(폴리프로필렌)</td>에서<td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 및 혈청학적 피펫의</td><td></td><td></td> 표준 어레이 <td>표준 소스</td></tr><tr><td>젤 로딩 팁</td><td></td><td></td><td>표준 소스의</td></tr><tr><td>자동 반복 피펫</td><td></td><td></td><td>rG4R1의 빠른 분취용; 표준 소스에서</td></tr><tr><td>열 순환기</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>Laemlli 샘플 버퍼로&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>대형 슬래브 겔 실행을 위한 장치</td><td>Biorad</td><td></td> 우리는 Biorad Magnet Life Technologies 12301D<td>의 Protean II xi cell 장치를 사용했습니다</td></tr>. <tr><td></td><td></td><td></td><td>One Lambda(현재 Thermo Fisher Scientific 브랜드)의 자석을 사용합니다. 그리고 Life는 Thermo의 자회사이기도 하므로 여기에 나열된 자석은 적절한 교체용</td></tr><tr><td>면도날</td><td></td><td></td><td>이어야 합니다.표준 소스에서</td></tr><tr><td>여과지 및 깔때기</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>유리 캐서롤 접시</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>오비탈 셰이커</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>투명 시트 보호기</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>스캐너 및 관련 TWAIN 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>표준 소스에서</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>Fuji Multiguage 또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>또는 동급&nbsp;</td></tr></tbody></table>

효소 활성 g4 resolvase1의 정화를위한 g-quadruplex dna 화성 접근

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

고차 핵산 구조는 모두 DNA와 RNA의 구아닌이 풍부한 지역에서 형성 할 수있는 G-quadruplexes (G4를, G4 구조)라는 높은 열적으로 안정하다. 이 인간 게놈에&gt; 375,000 추정 G4 형성 서열이 있고, 그들은 프로모터 영역, 번역되지 않은 지역 (UTRs)에 충실하고, 텔로미어 반복 내에서. 때문에 이러한 구조는 복제 및 전사와 같은 세포 과정에 영향을 미칠 가능성이있는 경우에, 셀들을 관리하는 효소를 진화했다. 하나의 효소는 생화학 실험실 및 나가미네 등에 의해 공동으로 특징이었다 G4 Resolvase 1 (G4R1)입니다. 매우 긴밀하게 (낮은 오후 범위에서 K d 개) 모두 G4-DNA와 G4-RNA에 결합하는 것으로. G4R1는 헬라 세포 용 해물에서 G4-해결 활동의 대부분의 원인과 이후 텔로미어 대사, 림프 개발, 유전자 전사, 조혈 및 면역 감시의 역할을 내포하고있다. EF 할 수있는 능력분히 표현하고 촉매 활성 G4R1는 G4의 구조와 G4-해결 효소의 운동의 상호 작용에 더 통찰력을 얻기에 관심이 실험실을 위해 중요하다 정화. 여기, 우리는 재조합 G4R1 (rG4R1)의 정제에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 설명 된 절차는 C- 말단 히스티딘 표지 된 효소의 전통적인 선호도 기반 정제 바인딩 및 ATP- 고도로 활성 효소를 정제 G4-DNA를 긴장을 rG4R1 능력의 이용 인간 코돈 최적화 된 세균의 발현 포함 종속 용출 단계. 프로토콜은 또한 rG4R1의 효소 활성 G4-DNA를 푸는 정제 효소의 능력을 조사하여 측정하는 품질 관리 단계를 포함한다. 방법도 정제 rG4R1의 정량화를 허용 것이 기재되어있다. 이 프로토콜의 대체 적응이 논의된다.

이 프로토콜 (그림 1)는 일상적으로 거의 순수, 촉매 활성 rG4R1을 산출한다. rG4R1 0.013 μL 범위 (도 위에서 설명한 G4 활성 분석으로 분석으로서, - TAMRA 표지 tetramolecular G4-DNA 0.2 pmol의 50 %가 0.2 이내에 단량체로 변환되는 효소 활성의 척도로서, 이는 전형적으로 관찰 2). 정제 rG4R1의 쿠마 염색은 G4-DNA 구슬을 결합 할 수 및 ATP 의존에서 용출 능력을 유지하고 그 rG4R1를 절단 나타낼 수 ~ 75 kDa의에서 작은 오염 밴드, 예상되는 120 kDa의 크기로 단일 밴드를 나타냅니다 방법 (그림 3). 관심의 밴드는 단백질 표준 곡선에 대해 정량화하고,이 프로토콜은 일반적으로 세균 배양의 20 ~ 100 nm의 정제 효소 1 당 L 200 μL를 가져옵니다. <p class="jove_content" fo:keep-to...

G4 Resolvase1는 G4 결합 단백질에 대한 소감보고 된 친화 G-quadruplex (G4) 구조에 결합 HeLa 세포에서 G4-DNA 풀기 활동의 대부분을 나타냅니다. 우리는 특히 촉매 활성 재조합 G4R1를 정화 친 화성 및 G4-Resolvase1의 ATP 의존 풀기 활동을 마구를 채우는 새로운 프로토콜을 설명합니다.

효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

이 방법의 전반적인 목표는 고유한 ATP 의존적 정제 단계를 사용하여 박테리아 발현 시스템으로부터 거의 순수하고 촉매 활성을 가진 G-quadruplex helicase G4 Resolvase1 단백질을 분리하는 것입니다. 이 방법은 연구자가 광범위한 인 비트로(in vitro) 생화학 분석에 사용할 수 있는 거의 순수하고 촉매 활성이 있는 재조합 G4 Resolvase1 단백질을 얻는 데 도움을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 준비 과정에서 잘못 접히거나 촉매 활성이 없는 효소를 배제할 수 있다는 점입니다.매우 높은 염 농도에서도 G4 비드에서 촉매 활성 효소를 용출시킬 수 없었던 점에 착안하여, ATP를 사용하여 G-quadruplex 헬리케이스를 용출시키는 아이디어가 고안되었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 G-quadruplex Resolvase1 또는 G4R1을 발현하는 대량의 박테리아 배양액을 준비하고 성장시키십시오. 실온에서 3 mL의 TN 버퍼로 박테리아 펠릿을 해동하십시오.병을 손에 쥐고 회전시켜 박테리아 펠렛을 해동 및 재현탁합니다. 해동 후 비교적 균일하게 현탁되면 TN 버퍼를 사용하여 부피를 5 mL로 맞춥니다. 다음으로, 배양액당 20 mg의 lysozyme을 250 µL의 물에 녹여 재현탁된 박테리아에 첨가합니다.병을 손으로 가볍게 흔들어주며 약 5~10분 동안 lysozyme이 박테리아를 용해하도록 둡니다. 용해가 진행됨에 따라 현탁액의 색이 약간 밝아지기 시작하며, 현탁액의 점도는 상대적으로 낮아집니다. PIC로 약칭되는 protease inhibitor cocktail 250 µL를 첨가합니다.그 다음, leupeptin 10 µL aliquot 하나를 첨가하고 충분히 혼합합니다. 현탁액을 얼음에 두고 차가운 TN buffer 10 mL와 beta mercaptoethanol 또는 BME 22 µL를 첨가합니다. 현탁액을 50 mL 튜브로 옮깁니다.디지털 초음파 파쇄기를 30% 진폭으로 설정하여 얼음 위에서 박테리아를 초음파 처리합니다. 2초 작동 후 2초 정지하는 펄스 방식으로 1분 동안 수행합니다. 초음파 처리 단계를 3회 반복하며, 각 단계 사이에 샘플을 얼음 위에서 최소 2분 동안 냉각시킵니다.다음으로, 냉각된 4X saline sodium citrate(SSC) 또는 SSC에 BME, PIC 및 leupeptin을 추가한 것과 동일한 부피를 넣고 현탁액을 혼합

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단백질 DNA 단지의 결정 구조는 단백질 기능, 메커니즘뿐만 아니라, 특정 상호 작용의 성격에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기, 우리는 함께 공동 결정의 길이, 순서 및 이중 DNA의 끝을 최적화하는...

SeqA-DNA 단지의 결정에 대한 DNA의 Duplexes의 최적화를 반복

박테리오파지 T7의 복제 단백질을 사용하여 지연 가닥 시작의 동역학을 조사하기 위해 민감한 겔 기반 불연속 분석법을 설명합니다.

보온재 가닥 DNA 합성의 속도론<em&gt; 체외</em&gt;는 박테리오파지 T7 복제 단백질에 의해

간단 하 고 효율적인 비용 효율적인 대규모 gRNA 라이브러리를 생성 하기 위한 방법 이어야 한다. 우리는 표적 DNA의 효소 소화에 따라 gRNA 라이브러리의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드를 CORALINA (제어 nuclease 활동을 통해 포괄적인 gRNA 라이브러리 세대) 비용이 많이 드는 사용자 지정 oligonucleotide 종합에 대안을 선물 한다.

대규모 gRNA DNA 소스에서 라이브러리 제작에 대 한 범용 프로토콜

단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

현재 프로토콜은 표적을 검출하기 위해 빠른 3단계 압타머 기반 지수 증폭 분석의 사용을 보여줍니다. 샘플 준비, 신호 증폭 및 색상 현상은 카페인보다 테오필린의 존재를 인식하기 위해 이 시스템을 구현하기 위해 다룹니다.

3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

Bis-3-chloropiperidines(B-CeP)는 in vitro에서 DNA 템플릿의 G-quadruplex 구조를 식별하고 특성화하는 데 유용한 화학 프로브입니다. 이 프로토콜은 B-CeP를 사용하여 프로빙 반응을 수행하고 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 반응 생성물을 분해하는 절차를 자세히 설명합니다.

In Vitro (시험관) Bis-3-Chloropiperidines에 의한 G-Quadruplex DNA 구조의 화학적 매핑

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

이 프로토콜은 형광 현미경 기반 단일 분자 DNA 복제 분석의 개요를 설명하여 DNA 중합효소와 G-4중 구조와 같은 장애물 간의 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

다양한 응용 분야에 걸쳐 구현하기 위해 향상된 효소 안정성을 제공하는 효소 포장 외막 소포체(OMV)의 생산, 정제 및 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

배우세요 G4 Resolvase1 단백질을 ATP 의존적 정화법으로 세균 발현 시스템에서 분리하는 방법을. 이 기술은 활성 효소를 얻어 다양한 생화학 분석에 활용할 수 있게 합니다.

효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근

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