Name: Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 채널로돕신의 염화물 선택성을 전체 세 패치-클램프 기록으로 결정하는 방법을 HEK293 세포에서. 이 기법은 광유도 전류와 생물물리학적 특성을 직접 측정하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우수한 기술 지원을 위해 Maila Reh, Tharsana Tharmalingam, 특히 Altina Klein에게 감사드립니다. 이 연구는 독일 연구 재단 (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 to PH)과 Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) 및 E4 (PH)의 우수 통합 클러스터 개념에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+sensory+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Algal sensory photoreceptors.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle.</a> Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+noninvasive+activation+and+inhibition+of+neural+and+network+activity+by+vertebrate+rhodopsin+and+green+algae+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
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<li>Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+selectivity+and+competition+in+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ion selectivity and competition in channelrhodopsins.</a> Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).</li>
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<li>Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Channelrhodopsin+with+a+Red-Shifted+Spectrum+and+Rapid+Kinetics+from+Mesostigma+viride%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride.</a> MBio. 2 (3), 1-9 (2011).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+highly+efficient+blue-shifted+channelrhodopsin+from+the+marine+alga+Platymonas+subcordiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis.</a> J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).</li>
<li>Hou, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+Chlamydomonas+Channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins.</a> Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).</li>
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<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
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<li>Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation+of+Channelrhodopsin+into+a+Light-Activated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel.</a> Science. 344 (6182), 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomonas+sulcata+ACR1%3A+A+Fast+Anion+Channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).</li>
<li>Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Natural+Green+Light+Absorbing+Chloride+Conducting+Channelrhodopsin+from+Proteomonas+sulcata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata.</a> J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).</li>
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<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol.+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
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<li>Amtmann, A., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+procedure+for+the+correction+of+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments+on+endo-+and+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes.</a> J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).</li>
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정의 된 이온 및 전기 조건에서 역전 전위의 결정은 ChR의 가벼운 활성화 후에 운반 된 이온 종에 대한 정보를 제공합니다. 독점적으로 하나의 이온 종이 복잡한 생리 학적 매질에서 변화되고 얻어진 역전 전위가 이론상의 Nernst 전위에 따라 이동하면,이 이온 종이 유일한 수송 된 것입니다. 그러나 ChR의 경우 전도 이온 간의 경쟁은 물론 다른 이온 종에 대한 침투성 때문에 Nernst 방정식에서 예상했던 것보다 반전 전위 이동이 일반적으로 덜 명확합니다. 이 경우 상황이 더욱 복잡해지고 잠재적으로 수행되는 모든 이온을 다양한 측정 솔루션을 필요로하는 별도로 교환해야합니다. 또한, 대부분의 CCR 및 제 1 인공 ACR ( 9 , 10 , 21) 은 양성자에 대해서는 전도성이지만, 양성자 농도양성자 농도는 역...

Channelrhodopsins (ChR)는 운동성 녹조류의 눈 지점에서 발생하는 광 게이 티드 이온 채널이며 광 택 및 공포 반응에 대한 기본 광 센서 역할을합니다 1 . ChR은 2002 년에 처음으로 기술 된 이래로 optogenetics의 새로운 분야에 대한 길을 열었고 골격근, 심장 또는 뇌의 다양한 흥분성 세포, 예를 들어 3 , 4 , 5 에 적용될 수 있습니다. 표적 세포에서 ChR을 발현 시키면 각 세포의 가벼운 조절 가능한 이온 투과성을 갖게된다. 연결 컨텍스트에서 이것은 활동 전위 (AP) 발화의 활성화 6 , 7 , 8 또는 억제 9,10 (수행 된 이온에 따라 다름)을 공간적 및 시간적ChR 변이체의 이온 선택성이 어떻게 그것의 광 생성 적용을 결정 하는지를 강조하는 빛의 정밀도. Chlamydomonas reinhardtii 와 Volvox carteri에서 처음으로 발견 된 ChR은 양성자뿐만 아니라 나트륨, 칼륨과 같은 1가 양이온, 칼슘과 마그네슘과 같은 2가 양이온에 덜 영향을 미친다 11,12,13. 오늘날, 70 가지 이상의 천연 양이온 전도성 채널 로돕신 (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 및 광전류 크기, 분광 감도, 동역학 및 양이온 선택도를 이용할 수 있습니다. 신경 과학에서 CCR은 a다시 세포를 활성화하고 AP를 트리거하는 데 사용되는 경우, 빛에 의해 구동되는 미생물 펌프는 수년간 뉴런을 조용하게하는 유일한 길항제였다. 2014 년에 두 그룹은 동시에 CCR이 분자 공학을 통해 추정 이온 전도 기공을 따라 극성을 바꾸어 음이온 전도성 채널로도 틴 (ACR)으로 전환 될 수 있음을 보여주었습니다 9 , 21 . 그 결과, 여러 가지 cryptophyte alga 22 , 23 , 24 에서 자연 ACR이 확인되었다. 가장 중요한 것은, ACR의 가벼운 활성화는 흡수 된 광자 당 단 하나의 전하만을 운반하는 미생물 펌프보다 훨씬 낮은 광 강도에서 신경 세포 활동의 억제를 허용하는 성인 뉴런에서 염화물 전류를 매개한다는 것이다. ChR 활동은 HEK293 세포의 빛 유도 전류의 전기 생체 학적 패치 클램프 기록으로 직접 해결할 수 있습니다. 패치 클램프기술은 원래 1970 년대 후반에 개발되었고, Hamill et al. 높은 전류 분해능과 멤브레인 전압의 직접 제어로 작은 셀 (전체 셀 모드)에서 전류 엔티티를 기록 할 수 있습니다. 세포 배양에 적용된이 기술은 이온 및 전기 기록 조건을 정확하게 제어하고 총 전류에 대한 이온의 상대적 기여와 함께 이온 선택성을 연구 할 수있게합니다. 여기서 우리는 염소 이온 전도도를 증명하기 위해 다양한 세포 외 염화물 농도 하에서 전류 - 전압 관계를 기록함으로써 Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 의 음이온 전도성 채널로도 펩신에 대한 이온 선택성의 시험을 예시한다.

<table><tbody><tr><td>HEK293 세포</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>인간 배아 신장 세포</td></tr><tr><td>Retinal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>all-trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrome</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Agar bridges</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrome</td><td>S0615</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-포도</td></tr>당 <tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-메틸-D-글루카민</td></tr><tr><td>Na-아스파르테이</td>트 <td>시그마 Aldrich</td><td>A6683</td><td>L-아스파르트산 나트륨염 일수화물</td></tr><tr><td>구연산</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>화학 역량 E. coli</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth medium</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>한천</td></tr><tr><td>플레이트 플라스미드 정제 키트</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin / Streptomycin</td><td>Biochrome</td><td>A 2213</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>커버 슬립 코팅</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>맞춤형</td><td></td><td>화재 연마</td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td>TPP</td><td></td><td>다양한 크기</td></tr><tr><td>클린 벤치</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>교반기</td><td>IKA</td><td>RCT 클래식</td><td></td></tr><tr><td>실버 와이어</td><td>과학 제품</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>전극, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)</td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Knick</td><td>765 Calimetric</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Fire polishing</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>바인더</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm 내부 직경</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Roth</td><td>P232</td><td>15 mm 직경</td></tr><tr><td>온도계</td><td>R&ouml; ssel Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>빔 스플리터</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10 투과</td></tr><tr><td>피펫 홀더</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>헤드 스테이지</td><td>분자 장치</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>분자 장치</td><td>DigiData1400</td><td>디지털 아날로그 컨버터</td></tr><tr><td>광원</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>540nm 전체 강도로 설정</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>셔터</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>셔터 드라이버</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Glass capilarries</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>보어실리케이트 모세혈관, 화재 광택 끝, OD 1.5 mm ID&nbsp; 0.86 mm</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td>, <td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>목욕 핸들러</td><td>Lorenz Messger&auml; tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>삼중대역 필터셋</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>형광 필터&nbsp; ECFP/EYFP/m체리&nbsp;</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>광 강도 측정</td></tr><tr><td>목표</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X / 1.0 DIC</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>녹음 챔버</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>현미경 내장 전원 공급 장치에서 전기 잡음을 피합니다.</td></tr><tr><td>진동 절연 테이블</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>맞춤 제작 또는 상업용 매칭 테이블</td><td></td><td></td></tr><tr><td>호스</td><td>모든 상업용; 예: Roth</td><td></td><td>욕조 처리 및 피펫 압력 적용을 위한 다양한 크기와 재료; 한천 다리</td></tr><tr><td>선형 shaker</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>액체 접합 전위 계산기</td><td>분자 장치 또는 Peter H. Barry</td><td></td>로부터 직접 <td>프로그램은 Clampex 수집 소프트웨어에 포함되어 있거나 p.barry@unsw.edu.au</td></tr><tr><td>데이터 수집 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>데이터 평가 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank 또는 Addgene</td><td>KF992074.1 또는 Addgene plasmid #85465</td><td>PsACR1</td></tr><tr><td>Amplifier guide</td><td>Molecular Devices</td><td>The Axon Guide</td><td></td></tr>를 위한 유전자 인코딩</tbody></table>

channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

지난 10 년 동안 channelrhodopsins은 신경 세포 학적 연구에서 없어서는 안되게되었고, 대상 세포에서 전기 과정을 비 침습적으로 조작하는 도구로 사용되었습니다. 이러한 맥락에서, 채널로도 딘의 이온 선택성은 특히 중요하다. 이 기사는 최근 HEK293 세포의 전기 생체 학적 패치 클램프 기록을 통해 Proteomonas sulcata 의 최근 확인 된 음이온 전도성 채널로도 딘에 대한 염화물 선택성에 대한 조사를 기술 합니다. 빛에 의해 제어되는 광전류를 측정하기위한 실험 절차는 기존의 패치 - 클램프 설정의 현미경에 결합 된 신속하게 전환 가능한 이상적인 단색 광원을 필요로합니다. 실험 이전의 준비 절차는 완충 용액의 준비, 액체 접합 전위에 대한 고려, 세포의 파종 및 형질 감염 및 패치 피펫의 당김과 관련하여 개략적으로 설명됩니다. 전류 - 전압 관계의 실제 기록transfection 후 24 시간에서 48 시간 사이에 다양한 염화물 농도에 대한 reversal potential을 결정합니다. 마지막으로, 전기 생리 학적 데이터는 염화물 전도의 이론적 고려 사항과 관련하여 분석된다.

<html> 그림 2 는 설명 된 프로토콜에 따라 측정 한 결과를 보여줍니다. 초록색 조명으로 조명하는 동안 Ps ACR1은 빠르게 일시적인 전류 레벨로 빠르게 감쇄하는 빠른 과도 전류를 특징으로합니다. 빛이 꺼지면 광전류는 밀리 세컨드 내에 0으로 감소합니다 ( 그림 2A ). 세포 외 염화물 농도를 바꾸면 획득 한 광전자 흔적에서 직접 볼 수있는 역전 전위가 이동합니다. 다중 측정으로부터의 역전 전위의 평가는 외부 염소 농도의 변화에 ​​의해 야기 된 극적인 역 전위 변화를 정량화합니다 ( 그림 2B ). 놀랍게도, 측정 된 반전 전위는 클로라이드의 계산 된 Nernst 전위와 직접적으로 일치한다 ( 그림 2C ). 이는 Ps ACR1의 높은 염화물 선택도를 확인한다. t &quot;fo : keep-toge...

이 기사에서는 HEK293 세포를 사용한 전기생리학적 전체 세포 패치 클램프 기록으로 채널로돕신의 이온 선택도를 측정하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 음이온 선택성 채널로돕신의 염화물 선택성을 조사하기 위한 실험 절차를 설명합니다. 그러나 이 절차는 뚜렷한 선택성을 가진 다른 채널로돕신으로 이전할 수 있습니다.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

이 실험의 전반적인 목표는 새로운 광의존성 이온 채널의 염화물 선택성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 광전류 진폭, 동역학 및 이온 선택성과 같은 채널로돕신의 생물물리학에서 중요한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 쉽게 복제할 수 있는 생물물리학적 채널 활성을 직접 판독할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 HEK 세포 준비에서 광전류 기록에 이르기까지 실험 절차의 각 단계를 최적화해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. HEK 세포의 시딩 및 절단은 Altina Klein에 의해 시연될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 별도의 비커에서 세포 내 완충 용액 100ml와 세포 외 완충 용액 500ml에 대한 고체 성분의 무게를 측정합니다.그런 다음 준비된 원액의 각각의 양을 첨가하십시오. 다음으로 초순수를 넣고 산과 염기를 사용하여 pH를 조심스럽게 조정합니다. 그런 다음 포도당과의 삼투압을 세포 내 및 세포 외 용액에 대해 각각 290 밀리오스몰 및 320 밀리오스몰로 조정합니다.이 절차에서는 최대 3개의 라이신 코팅 유리 덮개를 35mm 페트리 접시에 나란히 놓습니다. 그런 다음 각 접시에 10% FBS와 1마이크로몰 레티놀이 10%가 보충된 표준 DMEM 2밀리리터에 1.5배의 5번째 HEK 세포를 파종합니다. 각 접시에 대한 세포를 transfection하려면 FBS가 없는 250마이크로리터의 DMEM과 6마이크로리터의 트랜스펙션 시약에 2마이크로그램의 플라스미드 DNA 용액을 준비합니다.배양 15분 후 용액을 세포에 부드럽게 첨가합니다. 측정하기 전에 마이크로피펫 풀러를 사용하여 저항이 낮은 패치 피펫을 당기고 화염 광택을 냅니다. 측정 당일을 위해 피펫을 먼지가 없는 용기에 보관하십시오.녹음하기 30분 전에 모든 설정 구성 요소를 켜서 작동 온도까지 가열합니다. 버퍼가 실온에 있는지 확인합니다. 먼저 외부 버퍼의 누출을 방지하기 위해 측정 챔버를 실리콘으로 밀봉합니다.그런 다음 커버슬립 하나를 챔버에 넣고 닫습니다. 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해 세포외 완충액으로 챔버를 조심스럽게 채웁니다. 다음 실험 세트를 위해 다른 커버 슬립과 함께 페트리 접시를 인큐베이터에 보관하십시오.그런 다음 세포 시각화를 위해 40X 대물렌즈를 사용하여 측정 챔버를 현미경 아래에 놓습니다. 그런 다음 수조 전극 위에 오거 브리지를 놓고 유체 레벨 센서 및 수조 처리기의 관류 배출구와 함께 챔버에 놓습니다. 세포외 용액을 1ml의 새 외부 용액으로 두 번 교환하여 잔류 배양 배지와 분리된 세포를 제거합니다.세포에 초점을 맞추고 다른 세포에서 분리해야 하는 형질주입된 세포를 검색합니다. 그런 다음 트리플 밴드 필터 세트와 주황색 조명을 사용하여 mCherry를 여기시키고 시각화합니다. 다음으로, 당겨진 피펫 중 하나에 세포 내 용액을 채웁니다.그리고 피펫을 여러 번 뒤집어 기포를 제거합니다. 그런 다음 피펫을 피펫 홀더에 장착하고 팁이 막히는 것을 방지하기 위해 약간의 양압을 가합니다. 현미경 아래에서 패치 피펫의 끝을 찾고 micromanipulator를 사용하여 세포 가까이로 이동합니다.데이터 수집 소프트웨어 내에서 Bath 모드에서 멤브레인 테스트를 시작하고 전압 단계를 적용합니다. 피펫 저항이 1.3 - 3.0 메가옴의 원하는 범위에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 오프셋 전류를 영점화하고 증폭기의 피펫 오프셋 손잡이를 돌려 피펫 전위를 조정합니다.전체 세포 구성에서 패치를 설정하려면 위에서 패치 피펫을 사용하여 세포에 천천히 접근하고 세포에 닿기 직전에 양압을 해제합니다. 때때로 셀 연결 구성은 그 후에 자체적으로 형성됩니다. 세포에 접근한 후 멤브레인 테스트를 Bath 모드에서 Patch 모드로 변경합니다.피펫 커패시턴스 보상 손잡이를 돌려 피펫 커패시턴스를 보상하여 테스트 펄스의 평평한 응답을 얻습니다. 멤브레인 테스트를 셀 모드로 전환합니다. 그런 다음 강도를 증가시키는 음압 또는 음압의 짧은 펄스를 적용하여 씰을 파괴하지 않고 패치를 파열하여 전체 세포를 확인합니다.두 개의 전체 셀 매개변수, 셀 커패시턴스와 직렬 저항을 설정하여 직렬 저항 보상을 시작합니다. 직렬 저항 보상 패널에서 예측 및 보정을 최대 90%까지 켠 다음 전체 셀 보상 스위치를 켜고 전체 셀 매개변수를 반복적으로 조정하여 이상적으로 평평한 테스트 씰 응답을 얻습니다. 전체 세포 구성을 설정한 후 패치 피펫을 통해 세포 내 용액을 충분히 교체할 수 있도록 기록하기 전에 최소 2분을 기다립니다.서로 다른 유지 전위에서 광 유도 전류를 기록합니다. 다음으로, 패치를 파괴하지 않고 세포 외 완충액을 챔버의 저염화물로 최소 5회 교환하고 새로운 염화물 농도에서 다른 전류 전압 관계를 기록합니다. 이 그림은 녹색 조명으로 조명하는 동안 PsACR1이 고정 전류 수준으로 빠르게 감소하는 빠른 과도 전류를 특징으로 함을 보여줍니다.조명이 꺼진 후 광류는 밀리초 내에 0으로 감소합니다. 세포 외 염화물 농도를 줄이면 바깥쪽으로 향하는 광류가 완전히 제거됩니다. 세포 외 염화물 농도를 교환하면 전류 전압 플롯에서 추론할 수 있는 반전 전위의 이동이 발생합니다.여러 측정에서 반전 전위를 평가하면 외부 염화물 농도의 변화로 인한 극적인 반전 전위 이동을 정량화할 수 있습니다. 놀랍게도, 측정된 반전 전위는 PsACR1의 높은 염화물 선택성을 확인하는 염화물에 대해 계산된 Nernst 전위와 직접 일치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 채널로돕신을 발현하는 HEK 세포에서 광 유도 광류의 전기생리학적 기록을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.일단 마스터하면 전체 절차를 4일 만에 완료할 수 있지만 광류를 기록하는 데는 몇 시간이 걸립니다. 이 절차를 보완하여 부위 지시 돌연변이 유발 및 분광 방법을 수행하여 채널로돕신의 구조적 특징과 세포 메커니즘을 추가로 설명할 수 있습니다. 채널로돕신의 특성화 및 분자 공학은 신경 과학 연구자들이 빛에 의해 선택된 뉴런의 흥분성을 조작할 수 있는 길을 열었습니다.

whole-cell-patch-clamp-recordings-for-electrophysiological

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 전체 세포 구성을 설정하여 초파리의 옴마티듐(ommatidium)에 있는 광수용체 뉴런의 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이는 광 펄스에 의한 일시적인 수용체 전위 채널의 활성화를 강조하여 측정 가능한 양자 범프를 생성합니다.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptor(초파리 광수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록)

이 비디오에서는 형광 리포터와 융합된 광 의존성 이온 채널 단백질을 발현하는 배아 신장 세포 배양이 이온 이동에 대한 빛의 영향을 보여줍니다. 전체 세포 패치 클램프는 이온의 움직임을 모니터링하는 데 사용됩니다.

광유전학적 전기생리학: 빛에 의존하는 이온 채널을 가진 세포의 기록

우리는 수생 호랑이 도롱뇽 (에서 얇은 망막 조각의 준비를...

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

이 동영상의 목적은 성인 zebrafish의 내부 귀 기관에서 건강 손상 세포를 획득하고 자신의 전압 개폐 채널의 biophysical 속성을 특성화하기위한 패치 클램프 연구를 위해 사용에 대한 절차를 설명하는 것입니다.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

배우세요 채널로돕신의 염화물 선택성을 전체 세 패치-클램프 기록으로 결정하는 방법을 HEK293 세포에서. 이 기법은 광유도 전류와 생물물리학적 특성을 직접 측정하여 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

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