Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

이 실험의 전반적인 목표는 새로운 광의존성 이온 채널의 염화물 선택성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 광전류 진폭, 동역학 및 이온 선택성과 같은 채널로돕신의 생물물리학에서 중요한 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 쉽게 복제할 수 있는 생물물리학적 채널 활성을 직접 판독할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 HEK 세포 준비에서 광전류 기록에 이르기까지 실험 절차의 각 단계를 최적화해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. HEK 세포의 시딩 및 절단은 Altina Klein에 의해 시연될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 별도의 비커에서 세포 내 완충 용액 100ml와 세포 외 완충 용액 500ml에 대한 고체 성분의 무게를 측정합니다.

그런 다음 준비된 원액의 각각의 양을 첨가하십시오. 다음으로 초순수를 넣고 산과 염기를 사용하여 pH를 조심스럽게 조정합니다. 그런 다음 포도당과의 삼투압을 세포 내 및 세포 외 용액에 대해 각각 290 밀리오스몰 및 320 밀리오스몰로 조정합니다.

이 절차에서는 최대 3개의 라이신 코팅 유리 덮개를 35mm 페트리 접시에 나란히 놓습니다. 그런 다음 각 접시에 10% FBS와 1마이크로몰 레티놀이 10%가 보충된 표준 DMEM 2밀리리터에 1.5배의 5번째 HEK 세포를 파종합니다. 각 접시에 대한 세포를 transfection하려면 FBS가 없는 250마이크로리터의 DMEM과 6마이크로리터의 트랜스펙션 시약에 2마이크로그램의 플라스미드 DNA 용액을 준비합니다.

배양 15분 후 용액을 세포에 부드럽게 첨가합니다. 측정하기 전에 마이크로피펫 풀러를 사용하여 저항이 낮은 패치 피펫을 당기고 화염 광택을 냅니다. 측정 당일을 위해 피펫을 먼지가 없는 용기에 보관하십시오.

녹음하기 30분 전에 모든 설정 구성 요소를 켜서 작동 온도까지 가열합니다. 버퍼가 실온에 있는지 확인합니다. 먼저 외부 버퍼의 누출을 방지하기 위해 측정 챔버를 실리콘으로 밀봉합니다.

그런 다음 커버슬립 하나를 챔버에 넣고 닫습니다. 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해 세포외 완충액으로 챔버를 조심스럽게 채웁니다. 다음 실험 세트를 위해 다른 커버 슬립과 함께 페트리 접시를 인큐베이터에 보관하십시오.

그런 다음 세포 시각화를 위해 40X 대물렌즈를 사용하여 측정 챔버를 현미경 아래에 놓습니다. 그런 다음 수조 전극 위에 오거 브리지를 놓고 유체 레벨 센서 및 수조 처리기의 관류 배출구와 함께 챔버에 놓습니다. 세포외 용액을 1ml의 새 외부 용액으로 두 번 교환하여 잔류 배양 배지와 분리된 세포를 제거합니다.

세포에 초점을 맞추고 다른 세포에서 분리해야 하는 형질주입된 세포를 검색합니다. 그런 다음 트리플 밴드 필터 세트와 주황색 조명을 사용하여 mCherry를 여기시키고 시각화합니다. 다음으로, 당겨진 피펫 중 하나에 세포 내 용액을 채웁니다.

그리고 피펫을 여러 번 뒤집어 기포를 제거합니다. 그런 다음 피펫을 피펫 홀더에 장착하고 팁이 막히는 것을 방지하기 위해 약간의 양압을 가합니다. 현미경 아래에서 패치 피펫의 끝을 찾고 micromanipulator를 사용하여 세포 가까이로 이동합니다.

데이터 수집 소프트웨어 내에서 Bath 모드에서 멤브레인 테스트를 시작하고 전압 단계를 적용합니다. 피펫 저항이 1.3 - 3.0 메가옴의 원하는 범위에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 오프셋 전류를 영점화하고 증폭기의 피펫 오프셋 손잡이를 돌려 피펫 전위를 조정합니다.

전체 세포 구성에서 패치를 설정하려면 위에서 패치 피펫을 사용하여 세포에 천천히 접근하고 세포에 닿기 직전에 양압을 해제합니다. 때때로 셀 연결 구성은 그 후에 자체적으로 형성됩니다. 세포에 접근한 후 멤브레인 테스트를 Bath 모드에서 Patch 모드로 변경합니다.

피펫 커패시턴스 보상 손잡이를 돌려 피펫 커패시턴스를 보상하여 테스트 펄스의 평평한 응답을 얻습니다. 멤브레인 테스트를 셀 모드로 전환합니다. 그런 다음 강도를 증가시키는 음압 또는 음압의 짧은 펄스를 적용하여 씰을 파괴하지 않고 패치를 파열하여 전체 세포를 확인합니다.

두 개의 전체 셀 매개변수, 셀 커패시턴스와 직렬 저항을 설정하여 직렬 저항 보상을 시작합니다. 직렬 저항 보상 패널에서 예측 및 보정을 최대 90%까지 켠 다음 전체 셀 보상 스위치를 켜고 전체 셀 매개변수를 반복적으로 조정하여 이상적으로 평평한 테스트 씰 응답을 얻습니다. 전체 세포 구성을 설정한 후 패치 피펫을 통해 세포 내 용액을 충분히 교체할 수 있도록 기록하기 전에 최소 2분을 기다립니다.

서로 다른 유지 전위에서 광 유도 전류를 기록합니다. 다음으로, 패치를 파괴하지 않고 세포 외 완충액을 챔버의 저염화물로 최소 5회 교환하고 새로운 염화물 농도에서 다른 전류 전압 관계를 기록합니다. 이 그림은 녹색 조명으로 조명하는 동안 PsACR1이 고정 전류 수준으로 빠르게 감소하는 빠른 과도 전류를 특징으로 함을 보여줍니다.

조명이 꺼진 후 광류는 밀리초 내에 0으로 감소합니다. 세포 외 염화물 농도를 줄이면 바깥쪽으로 향하는 광류가 완전히 제거됩니다. 세포 외 염화물 농도를 교환하면 전류 전압 플롯에서 추론할 수 있는 반전 전위의 이동이 발생합니다.

여러 측정에서 반전 전위를 평가하면 외부 염화물 농도의 변화로 인한 극적인 반전 전위 이동을 정량화할 수 있습니다. 놀랍게도, 측정된 반전 전위는 PsACR1의 높은 염화물 선택성을 확인하는 염화물에 대해 계산된 Nernst 전위와 직접 일치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 채널로돕신을 발현하는 HEK 세포에서 광 유도 광류의 전기생리학적 기록을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일단 마스터하면 전체 절차를 4일 만에 완료할 수 있지만 광류를 기록하는 데는 몇 시간이 걸립니다. 이 절차를 보완하여 부위 지시 돌연변이 유발 및 분광 방법을 수행하여 채널로돕신의 구조적 특징과 세포 메커니즘을 추가로 설명할 수 있습니다. 채널로돕신의 특성화 및 분자 공학은 신경 과학 연구자들이 빛에 의해 선택된 뉴런의 흥분성을 조작할 수 있는 길을 열었습니다.