핵 포스 현미경 검사에 의한 DNA 절편 검사에서의 DNA 병변 인식 연구

이 원자력 현미경 실험의 전반적인 목표는 DNA 복구 단백질과 DNA의 손상 부위의 상호 작용을 해결하고 다양한 단백질 복합체에 의한 서로 다른 DNA 상호 작용을 구별하는 것입니다. 이 방법은 특정 DNA 복구 시스템이 DNA의 표적 병변을 인식하는 방법과 같은 DNA 복구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 DNA 병변 인식 과정에 관련된 다양한 유형의 복합체를 직접 보고 분석할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 학사 연구 중에 이 접근 방식을 사용한 Nicolas Wirth입니다. 먼저 플라스미드에서 단일 가닥 DNA 갭을 생성하여 적절한 DNA 기질을 준비합니다. 변형된 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로 갭을 메우고, 마지막으로 적절한 제한 효소를 사용하여 혈장 DNA를 선형화합니다.

이 실험을 위해, 두 배 가닥 DNA 기질은 대략 1, 000의 기본적인 쌍 길이이고 DNA 병변 뿐 아니라 DNA에 단백질 선적을 위한 DNA 거품에게 불린 짝을 이루지 않는 지구를 포함한다. 다음으로, 먼저 10x 반응 버퍼와 물을 미세반응 튜브에 피펫팅하여 AFM 분석을 위한 단백질 DNA 샘플을 준비합니다. 그런 다음 조사 중인 DNA와 단백질을 추가합니다.

예를 들어, 여기에서는 DNA 샘플 100나노몰과 진핵생물 뉴클레오티드 절제 복구 단백질 XPD 및 p44 각각을 1마이크로몰로 합니다. 그런 다음 열 블록에서 섭씨 37도에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 배양 후 샘플을 잠시 스핀다운합니다.

다음으로, 샘플을 놓을 운모 기질을 준비합니다. 메스를 사용하여 더 큰 스트립에서 1cm x 1cm 크기의 운모 조각을 자릅니다. 그런 다음 접착 테이프 조각을 사용하여 운모의 최상층을 제거하여 깨끗하고 평평하며 해부학적으로 매끄러운 기판 표면을 드러냅니다.

단백질 DNA 샘플을 AFM 증착 완충액에서 50배에서 100배로 확장하고, 희석된 샘플 20마이크로리터를 즉시 운모 표면에 증착합니다. 희석 계수는 시료 농도에 따라 다릅니다. 샘플을 운모 표면에 침전한 직후, 몇 밀리리터의 여과된 탈이온수로 샘플을 3-4회 헹구고 과도한 액체를 닦아내십시오.

부드러운 질소 흐름을 사용하여 샘플을 불어 건조시킵니다. 마지막으로, 접착 테이프를 사용하여 샘플의 가장자리 부분을 현미경 슬라이드에 고정합니다. 샘플을 AFM 스테이지 중앙에 놓고 마그네틱 패드를 사용하여 현미경 슬라이드를 스테이지에 고정합니다.

그런 다음 AFM 팁을 팁 홀더에 삽입합니다. 클램프 아래 홀더의 팁을 고정합니다.amp손가락으로 조이도록 나사를 조입니다. 고정되면 팁 홀더를 AFM 측정 헤드에 넣습니다.

포지셔닝 나사를 사용하여 샘플을 중앙 위치로 이동합니다. AFM 측정 헤드를 샘플 위에 놓고 헤드가 다리가 스테이지 움푹 들어간 곳 안에 안정적으로 서 있는지 확인합니다. 그런 다음 최적의 신호 강도를 위해 캔틸레버 뒷면에 AFM 레이저를 정렬합니다.

AFM 비디오 창에서 반사 신호를 관찰하여 레이저를 조잡하게 배치하십시오. 이 AFM 모델의 경우 AFM 측정 헤드의 오른쪽과 뒤쪽 바퀴를 돌려 AFM 레이저의 X 및 Y 위치를 조정하여 캔틸레버 끝의 중앙으로 향하게 합니다. 그런 다음 두 개의 바퀴로 레이저 위치를 미세 조정하여 검출기 합계 신호를 최적화합니다.

검출기 어레이의 상단 및 하단 다이오드에서 나오는 다른 신호를 영점 조정하여 AFM 레이저 반사를 검출기 센터로 향하게 합니다. 이 단계에서는 이 AFM 모델의 측정 헤드 왼쪽에 있는 나사를 돌립니다. 다음으로, 소프트웨어의 마스터 패널 튜닝 창으로 이동하여 캔틸레버 상주 주파수를 결정합니다.

캔틸레버 발진을 구동하는 피에조의 1볼트 입력에 해당하는 진폭을 선택한 다음 발진 주파수를 상주 주파수보다 약간 낮은 음의 5%로 설정합니다. 이제 자동 주파수 조정을 수행하고 진동의 위상을 0으로 만듭니다. 드리프트를 피하기 위해 이미징을 시작하기 약 1시간 전에 시스템을 열 평형에 도달하도록 두십시오.

이미징을 시작할 준비가 되면 소프트웨어 메인 패널에서 보호 설정점을 설정하고 참여를 선택하여 팁이 샘플 표면에 접근할 수 있도록 준비합니다. 보호 설정 또는 설정점에 도달할 때까지 AFM 헤드의 앞바퀴를 수동으로 내립니다. 그런 다음 Z 센서 신호가 왼쪽으로 완전히 확장될 때까지 앞바퀴를 조심스럽게 더 내립니다.

진동 진동 테이블을 활성화하고 음향 차단 인클로저를 닫습니다. 다음으로, 햄스터 쳇바퀴를 사용하여 AFM 팁과 샘플의 미세한 맞물림을 통해 AFM 소프트웨어의 설정값을 낮춥니다. 반발 영역에서 태핑 모드 이미징을 수행하려면 위상 신호가 자유 레벨 위상보다 약간 낮아질 때까지 설정값을 낮추십시오.

그런 다음 샘플 스캔을 시작합니다. 픽셀 해상도가 각각 2, 048 또는 4, 096인 4마이크로미터 x 4마이크로미터 또는 8마이크로미터 x 8마이크로미터 정사각형의 이미지 표면적에서 초당 2.5마이크로미터의 스캔 속도를 사용합니다. 그리고 스캔 수행 버튼을 누릅니다. AFM 소프트웨어에서 이미지를 직접 육안으로 검사하여 관련 단백질 DNA 복합체를 사전 선택합니다.

XPD 샘플의 경우, 가능한 복합체에는 XPD p44 DNA뿐만 아니라 XPD와 p44의 분자 질량이 다르기 때문에 크기가 뚜렷하게 다른 XPD DNA 및 p44 DNA가 포함됩니다. 분석 창의 절편 도구를 사용하여 DNA에서 개별 단백질 피크의 부피를 측정하고 절편 창 커서로 단백질 피크 절편의 높이와 직경을 측정합니다. 이 값을 사용하여 복잡한 유형을 검증하기 위한 간단한 수학적 모델을 사용하여 피크의 부피를 결정할 수 있습니다.

마지막으로, 분자량이 알려진 다양한 단백질로 AFM 시스템을 보정하여 이러한 부피를 단백질 및 단백질 복합체의 대략적인 분자량으로 변환합니다. DNA 단편 길이, DNA에서 단백질 복합체의 위치, 표적 부위 특이성 또는 DNA 밴드 각도와 같은 추가 기능을 확인하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 여기에 표시된 것은 서로 다른 크기에 따라 구별할 수 있는 세 가지 유형의 DNA 결합 복합체가 있는 AFM 이미지입니다.

클래스 1 복합체는 헬리카제 활성화 보조 인자 p44와만 일치하고, 클래스 2 복합체는 XPD 단백질로만 구성되며, 클래스 3 복합체는 XPD와 p44 모두로 구성되며, XPD에 의한 군단 인식은 p44에 의한 헬리카제 활성의 활성화를 요구하며, 클래스 3 복합체만 병변 인식을 보여줍니다. 다른 병변 인식 전략을 확인하기 위하여는, DNA 기질에 단백질의 위치는 원핵생물과 진핵생물 NER helicase를 위해 빨강으로 표시된 DNA 병변에서 5개의 주요한 방향에 있는 DNA 거품에 단백질 선적을 위해 측정되었습니다. 단백질 위치 분포에서 DNA 병변 인식은 DNA 병변 위치에서 향상된 결합으로 인해 피크로 볼 수 있습니다.

원핵생물 NER helicase UVRB와 진핵생물 대응물인 XPD는 서로 다른 DNA 가닥 선호도를 나타내는 다양한 CPD 병변 인식 전략을 보여줍니다. 구체적으로, CPD 병변은 UVRB에 의해 전위된 가닥에서 인식되지만, XPD에 의해 반대의 전위되지 않은 가닥에서 우선적으로 인식됩니다. 일단 마스터하면 이 방법은 분석을 포함하여 몇 시간 또는 며칠 안에 완료할 수 있습니다.

고순도 단백질 및 DNA 샘플로 작업하여 AFM 이미지의 특징을 해석하고 생물학적 시스템과 해결하고자 하는 질문에 따라 DNA 기질을 신중하게 설계하는 것이 중요합니다. 또한 겔 전기영동 공간, 전기이동성 이동 또는 DNA 절개 분석과 같은 앙상블 방법은 물론 이러한 AFM 실험과 매우 상호 보완적입니다. 이러한 방법은 DNA 결합 친화성 또는 DNA 병변 절제 활동과 같은 추가 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 단백질 DNA 복합체를 직접 시각화할 수 있는 비교적 빠르고 간단한 접근 방식이며, 이러한 복합체는 생물학적 시스템에서 발생하는 과정에 대한 좋은 그림을 제공합니다.

물론 이것은 DNA 복구 과정을 이해하는 데 유용할 뿐만 아니라 다른 단백질 DNA 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 즐겨 사용하는 단백질 DNA 시스템에서 샘플을 준비하는 방법, AFM으로 이미지를 만드는 방법, 데이터 해석을 위해 유용한 매개변수를 추출하는 방법에 대해 꽤 잘 알게 될 것입니다.