Name: 핵 포스 현미경 검사에 의한 DNA 절편 검사에서의 DNA 병변 인식 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 원자력 현미경을 이용한 DNA 손상 인식 메커니즘 연구 방법을. 뉴클레오타이드 절제 수복 시스템에서 단백질-DNA 상호작용을 직접 시각화하여 손상 인식 과정을 분석하는 기술입니다.

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PUC19N, CPD- 함유 올리고 뉴클레오타이드 및 p44는 Samuel Wilson, Korbinian Heil 및 Thomas Carell, Gudrun Michels 및 Caroline Kisker에 의해 각각 제공되었다. 이 연구는 도이체 Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 및 TE-671 / 4에서 IT 보조금으로 지원되었습니다.

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<li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li>
<li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li>
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<li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li>
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<li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules%3A+MutS-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li>
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<li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li>
<li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li>
<li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
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특정 표적 부위를 포함하는 긴 DNA 단편에 대한 단백질의 결합 위치에 대한 AFM 통계 분석은 단백질이 이들 부위 2 , 3 , 4 , 5 , 6 을 인식하기 위해 사용하는 특정 전략에 대한 흥미로운 세부 사항을 나타낼 수있다. 결과적인 위치 분포를 해석하기 위해, DNA 내 표적의 위치를 ​​정확히 알아야한다. 이것은 원형 플라스미드 DNA에 잘 정의 된 서열 위치의 특정 부위를 도입하고 제한 효소 기술을 사용하여이 특정 부위를 포함하는 DNA의 단편을 절단함으로써 달성된다. 단백질 결합 위치의 AFM 이미지 분석에서 정확한 길이를 가진 DNA 단편 (절단 된 단편의 전체 길이와 일치 함) 만 포함될 수 있습니다. 왜냐하면 이들만이 대...

원자 힘 현미경 (AFM)은 단백질 -DNA 상호 작용 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 의 분석을위한 강력한 기술입니다. 단일 분자 수준의 분해능으로 이종 샘플을 직접 시각화하기 위해서는 적은 양의 시료가 필요합니다. 이질성은 단백질의 상이한 형태 또는 올리고머 상태에 기인 할 수있다. 특히, 단백질 -DNA 샘플과 관련하여, 단백질 복합체는 일반적으로 DNA 결합 또는 DNA 내의 특정 표적 부위에 결합함으로써 유도 된 상이한 화학 양론 및 / 또는 형태를 나타낼 수있다. 이종 샘플은 또한 2 종 (또는 그 이상)의 상이한 종류의 단백질 및 상이한 단백질 복합체형태 ( 예를 들어 , 하나의 유형의 단백질 대 헤테로 메릭 복합체로 이루어진)는 DNA와 다르게 상호 작용할 수있다. 여기서 논의 된 연구는 공기 중의 AFM 이미징을 이용하여이 단백질의 표적을 나타내는 병변을 포함하는 긴 (~ 900 염기쌍, bp) DNA 단편에 결합 된 DNA 복구 단백질의 정적 건조 샘플을 이용한다. AFM의 분자 분해능이 높기 때문에 여러 종류의 단백질 복합체를 구별 할 수 있으며 DNA 조각에 결합하는 단백질의 결합 위치를 결정할 수 있습니다. 중요하게도, 병변은 잘 정의 된 위치에서 DNA 기질에 도입됩니다. DNA에 병변 부위의 위치가 알려지기 때문에 DNA에 결합 된 단백질의 분포는 (상이한) 단백질 복합체의 (상이한) 병변 인식 특성, 예를 들어 그들이 특정 유형의 병변을 얼마나 잘인지하는지에 대한 통찰력을 제공한다 손상되지 않은 DNA에) 2 , 3 , <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 4 , 5 , 6 . DNA에 대한 그들의 위치는 또한 병변에서 특이 적으로 결합 된 단백질 복합체와 DNA의 다른 곳에서 비특이적으로 결합 된 복합체 사이의 구별을 허용한다. 이들 상이한 복합 형 (병변 및 비 특이성 복합체에서 특이 적으로 결합 된 복합체)의 분리 된 특성화는 표적 부위 확인시 유도 된 복합체에서의 잠재적 인 구조 변화를 나타낼 수있다. 여기에 초점을 맞춘 DNA 복구 단백질은 핵산 절삭 수선 (NER) 경로에서 병변 인식을 담당하는 헬리 카아 제입니다. 박테리아에서 NER은 단백질 UvrA, UvrB 및 UvrC에 의해 달성됩니다. UvrA는 UvaA 2 / UvrB 2 DNA 스캐닝 복합체에서 초기 병변 감지를 담당합니다. UvrB에 의한 병변 검증시,이 복합체는 병변 부위에서 결합 된 단량체 UvrB로 전환되고,이 특정 복합체는 p원핵 세포 NER 엔도 뉴 클레아 제 UvrC. UvrC는 병변이있는 짧은 (12-13nt) 스트레치의 단일 가닥 DNA (ssDNA)를 절단합니다. 누락 된 스트레치는 DNA 폴리머 라제에 의해 재충전됩니다. 마지막으로, DNA 리가 제가 원래 합성 된 DNA 9,10 으로 새로 합성 된 신축성을 봉인합니다. 진핵 생물에서 NER 캐스케이드의 대부분의 단백질은 대형의 다중 전사 인자 II H (TFIIH) 복합체의 일부입니다. 삼량 체 CEN2-XPC-HR23B 복합체 를 통한 초기 병변 감지 후, TFIIH는 DNA 표적 부위로 모집된다. 복합체 내의 XPD가 NER 표적 병변의 존재를 확인하면, 진핵 생물 NER 엔도 뉴 클레아 제인 XPG 및 XPF는 병변 9 , 10을 함유 한 짧은 (24-32 nt) ssDNA 스트레치를 모집하도록 모집된다. 여기서는 원핵 생물과 진핵 생물 NER의 헬리 케이즈 UvrB와 XPD를 연구했습니다. 이 헬리콥터에는DNA (DNA bubble)는 두 개의 DNA 단일 가닥 중 하나에 연결되고,이어서 ATP 가수 분해에 의해 연료 가닥을 따라 이동합니다. 따라서 DNA 병변 이외에 DNA 버블이 단백질의 로딩 위치로 기능하는 기질에 도입되었습니다. 특정 병변 DNA 기판의 준비 절차는 이전에 11에서 설명 했습니다. 그것은 니카아제를위한 2 개의 밀접하게 이격 된 제한 부위를 갖는 원형 DNA 구조체 (플라스미드)를 필요로한다. 이 연구의 맥락에서, 플라스미드 pUC19N (2729 BP)이 사용되었다 (S. Wilson의 실험실, NIEHS에 의해 만들어졌다). 이 플라스미드는 48 뉴클레오타이드 (nt) 스트레치를 구성하는 니카타아제 Nt.BstNBI를위한 3 개의 밀접하게 이격 된 제한 사이트를 포함한다. 니카아제로 배양 한 후, 이들 부위 사이의 ssDNA의 스트레치를 제거하고 임의의 표적 특징을 함유하는 올리고 뉴클레오타이드로 대체 할 수있다. 각 단계 후, 완전한 효소 소화를 아가 로즈 겔로 시험한다전기 영동. Nicked 원형 DNA는 원래 supercoiled 플라스미드에 비해 낮은 전기 영동 이동성으로 인해 구별하실 수 있습니다. DNA의 갭핑 및 제거 된 스트레치의 특정 기질 올리고 뉴클레오타이드에 의한 대체는 닉 사이의 영역 내에서만 기질을 절개하는 제한 효소로 분해함으로써 평가 될 수있다. 효소에 의한 원형 플라스미드의 선형화는 따라서 갭 DNA에 대해 억제되고 특정 올리고 뉴클레오타이드의 삽입 후에 회복 될 것이다. 마지막으로, 두 endonuclease 제한 사이트 (이상적으로 단일 커터) 원하는대로 길이와 정의 된 위치뿐만 아니라 병변에서 거리에있는 DNA 버블에서 특정 대상 사이트와 선형 DNA 기판의 생성을 허용 5 &#39;또는 3&#39;방향. NER 헬리 케이즈에 의한 병변의인지 는 AFM 영상 을 통해 조사 할 수 있습니다. t에서 헬리 카스의 DNA 전좌가 스톨 된그 병변 부위는 DNA상의 단백질 위치 분포의 첨단으로 볼 수 있으며 병변 인식을 나타낸다. 이 헬리 카제의 DNA 전좌가 5 &#39;에서 3&#39;극성으로 나아가 방향성을 갖기 때문에 로딩 위치 (병변의 상류 또는 하류의 DNA 버블)의 위치에 대한 병변 인식의 의존성도 병변이 우선적으로인지되는지 여부를 나타냅니다 (translocated) 또는 반대쪽으로, 비 - 전위 된 ssDNA 가닥 5 , 9 . 다음 섹션에서는 사용 된 방법을 소개하고이 실험의 주요 결과를 간단히 설명합니다. 중요한 것은 여기에 제시된 DNA 수리에 대한 모범 사례와 유사하게 AFM 이미징은 DNA 복제 또는 전사 8 , 12 , 13 , 14 와 같은 서로 다른 DNA 상호 작용 시스템의 연구에 적용될 수 있습니다 </sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>Molecular Force Probe (MFP) 3D</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>원자력 현미경 (AFM)</td></tr><tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>해당 없음</td><td>컴퓨터</td></tr><tr><td>ThermoMixer 및 1.5 mL 블록</td> DNA 준비용 <td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>열 블록</td></tr><tr><td>Rotilabo Block-Heater H 250 및 0.5 mL 튜브용 블록</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Y264.1 & Y267.1</td><td>단백질-DNA 배양용 열 블록</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1704467</td><td>겔 캐스터 및 전원 공급 장치가 있는 전기영동 챔버</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1645050</td><td>전기영동 전원 공급 장치</td></tr><tr><td>Centifuge 5415 D 로터 포함</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td><td>Table centrifuge</td></tr><tr><td>Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15</td><td>Ultralum</td><td>900-1322-02</td><td>자외선 조사 테이블</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR 국제 / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N / A</td><td>UV 분광 광도계</td></tr><tr><td>TKAX-CAD 0.2 &mu; m 캡슐 필터</td><td>Unity Lab Services</td><td>N/A</td><td>물 탈이온화 및 필터 장치</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP software on Igor Pro</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>AFM 소프트웨어</td></tr><tr><td>ImageJ (오픈 소스 Java 이미지 처리)</td><td>NIH 이미지</td><td>N/A</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>엑셀 (Microsoft Office)</td><td>Microsoft Corporation</td><td>N/A</td><td>데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab Corporation</td><td>N/A</td><td>통계 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>AC240TS</td><td>Olympus</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>AFM 캔틸레버</td></tr><tr><td>등급 V-5 백운석</td><td>SPI 공급</td><td>1805</td><td>운모 시트</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell</td><td>Millipore Ireland Ltd.</td><td>UFC505096</td><td>원심분리기 필터</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extract II&nbsp;</td><td>&nbsp; Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>Agarose 젤 추출 키트</td></tr><tr><td>Rotilabo 셀룰로오스 종이 유형 111A</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AP59.1</td><td>AFM 증착 블로팅 페이</td></tr><tr><td>퍼 Anatop 25 (0.02 &mu; m)</td><td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td><td>주사기 필터</td></tr><tr><td>SSpI, BspQI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0132, DNA</td><td>기질 준비를 위한</td>R0712 제한 효소</tr><tr><td>XhoI, BglII</td><td></td><td>R0146, R0144</td><td>DNA 준비를 위한 제한 효소</td></tr><tr><td>니킹 제한 효소 Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0607</td><td>니카제</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0202S</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>Tris, HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855, 9105</td><td>완충 화학 물질</td></tr><tr><td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957, HN03, HN02, P026</td><td>염 화학 물질</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>염 화학 물질</td></tr><tr><td>DTT, TCEP, EDTA</td><td></td><td>6908, HN95, 8040</td><td>화학 물질 / 시약</td></tr><tr><td>아가로스, 아세트산, HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2267, 3738, K025</td><td>시약</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K054</td><td>뉴클레오티드</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 #1(표 1)</td><td>Biomers</td><td>맞춤형</td><td>상보형 DNA 올리고뉴클레오티드</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 #2, #3 및 #6(표 1)</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>맞춤형</td><td>플루오레세인 함유 올리고뉴클레오티드,</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드, 표 1의 #4&nbsp; 및 #5</td>, <td>비공개(예: TriLink 또는 GlenResearch에서 사용 가능),</td><td></td> <td>올리고뉴클레오티드를 함유한 CPD,</td></tr><tr><td>SafeSeal 반응 튜브, 0.5 mL 및 1.5 mL</td>, <td>Sarstedt</td><td>72.704 및 72.706</td><td>배양 튜브</td></tr>, <tr><td>GeneRuler, 1 kb</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA ladder</td></tr>, <tr><td>6x concentrate, gel loading, dye, purple</td>, <td>New England Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>DNA 로딩 염료</td></tr><tr><td>미도리 그린&nbsp;</td><td>Nippon Genetics Europe GmbH</td><td>999MG28055</td><td>DNA 염색</td></tr></tbody></table>

핵 포스 현미경 검사에 의한 dna 절편 검사에서의 dna 병변 인식 연구

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

AFM 이미징은 단백질-DNA 상호 작용 연구를 위한 강력한 기술입니다. 이 단일 분자 분석법은 이질적인 샘플에서 서로 다른 분자와 분자 어셈블리를 동시에 분리할 수 있습니다. DNA 상호 작용 단백질 시스템의 특정 맥락에서 DNA 단편을 포함하는 표적 부위의 다양한 단백질 복합체 형태 및 해당 결합 위치를 구별할 수 있습니다. 여기에서는 원핵 및 진핵 뉴클레오티드 절제 DNA 복구(NER) 시스템에서 DNA 병변 인식 연구에 대한 AFM의 응용 프로그램이 제시됩니다. DNA 및 단백질 시료 준비 절차가 설명되고 실험 및 실험의 분석 세부 사항이 제공됩니다. 이 데이터는 NER 단백질에 의해 표적 부위 검증을 달성할 수 있는 전략에 대한 중요한 결론을 내릴 수 있도록 합니다. 흥미롭게도, 그들은 병변의 유형에 따라 진핵 생물 NER 시스템에 대한 병변 인식 및 식별의 다른 접근 방식을 나타냅니다. 또한, 원핵 생물 및 진핵 생물 NER에 관여하는 두 개의 서로 다른 헬리 케이스의 뚜렷한 구조적 특성은이 두 시스템에 대해 관찰 된 서로 다른 전략을 설명하고 설명합니다. 중요한 것은 이러한 실험 및 분석 접근 방식이 DNA 복구 연구뿐만 아니라 복제 또는 전사 과정에 관여하는 것과 같은 다른 DNA 상호 작용 단백질 시스템과도 매우 유사하게 적용될 수 있다는 것입니다.

단백질 복합체 부피를 기준으로 다른 복합 형을 구별 원핵 생물 NER 헬리 케이즈 UvrB의 헬리 케이즈 활성은 DNA 결합에 의해 자극된다 22 , 23 . UvrB는 두 개의 단일 ssDNA 가닥 중 하나에 올바르게로드하기 위해 DNA에 짝을 이루지 않은 영역 (DNA 버블)이 필요합니다. 생체 내 에서,이 DNA 구조는 NER 캐스케이드의 다른 단백질을 통한 DNA 상호 작용에 의해 제공됩니다. 시험 관내 실험에서, 거품은 표적 병변에 근접하여 dsDNA 단편에 인위적으로 도입 될 수있다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 또한 UvrB 9 에 의한 DNA 결합을 향상시킵니다. 그러나 ...

여기에서는 뉴클레오티드 절제 복구 시스템을 예로 들어 단일 분자 AFM 이미징을 통한 다양한 DNA 병변 인식 접근 방식에 대한 연구를 시연합니다. DNA 및 단백질 시료 준비 절차와 AFM 실험을 위한 실험 및 분석 세부 사항에 대해 설명합니다.

핵 포스 현미경 검사에 의한 DNA 절편 검사에서의 DNA 병변 인식 연구

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

이 원자력 현미경 실험의 전반적인 목표는 DNA 복구 단백질과 DNA의 손상 부위의 상호 작용을 해결하고 다양한 단백질 복합체에 의한 서로 다른 DNA 상호 작용을 구별하는 것입니다. 이 방법은 특정 DNA 복구 시스템이 DNA의 표적 병변을 인식하는 방법과 같은 DNA 복구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 DNA 병변 인식 과정에 관련된 다양한 유형의 복합체를 직접 보고 분석할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 학사 연구 중에 이 접근 방식을 사용한 Nicolas Wirth입니다. 먼저 플라스미드에서 단일 가닥 DNA 갭을 생성하여 적절한 DNA 기질을 준비합니다. 변형된 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로 갭을 메우고, 마지막으로 적절한 제한 효소를 사용하여 혈장 DNA를 선형화합니다.이 실험을 위해, 두 배 가닥 DNA 기질은 대략 1, 000의 기본적인 쌍 길이이고 DNA 병변 뿐 아니라 DNA에 단백질 선적을 위한 DNA 거품에게 불린 짝을 이루지 않는 지구를 포함한다. 다음으로, 먼저 10x 반응 버퍼와 물을 미세반응 튜브에 피펫팅하여 AFM 분석을 위한 단백질 DNA 샘플을 준비합니다. 그런 다음 조사 중인 DNA와 단백질을 추가합니다.예를 들어, 여기에서는 DNA 샘플 100나노몰과 진핵생물 뉴클레오티드 절제 복구 단백질 XPD 및 p44 각각을 1마이크로몰로 합니다. 그런 다음 열 블록에서 섭씨 37도에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 배양 후 샘플을 잠시 스핀다운합니다.다음으로, 샘플을 놓을 운모 기질을 준비합니다. 메스를 사용하여 더 큰 스트립에서 1cm x 1cm 크기의 운모 조각을 자릅니다. 그런 다음 접착 테이프 조각을 사용하여 운모의 최상층을 제거하여 깨끗하고 평평하며 해부학적으로 매끄러운 기판 표면을 드러냅니다.단백질 DNA 샘플을 AFM 증착 완충액에서 50배에서 100배로 확장하고, 희석된 샘플 20마이크로리터를 즉시 운모 표면에 증착합니다. 희석 계수는 시료 농도에 따라 다릅니다. 샘플을 운모 표면에 침전한 직후, 몇 밀리리터의 여과된 탈이온수로 샘플을 3-4회 헹구고 과도한 액체를 닦아내십시오.부드러운 질소 흐름을 사용하여 샘플을 불어 건조시킵니다. 마지막으로, 접착 테이프를 사용하여 샘플의 가장자리 부분을 현미경 슬라이드에 고정합니다. 샘플을 AFM 스테이지 중앙에 놓고 마그네틱 패드를 사용하여 현미경 슬라이드를 스테이지에 고정합니다.그런 다음 AFM 팁을 팁 홀더에 삽입합니다. 클램프 아래 홀더의 팁을 고정합니다.amp손가락으로 조이도록 나사를 조입니다. 고정되면 팁 홀더를 AFM 측정 헤드에 넣습니다.포지셔닝 나사를 사용하여 샘플을 중앙 위치로 이동합니다. AFM 측정 헤드를 샘플 위에 놓고 헤드가 다리가 스테이지 움푹 들어간 곳 안에 안정적으로 서 있는지 확인합니다. 그런 다음 최적의 신호 강도를 위해 캔틸레버 뒷면에 AFM 레이저를 정렬합니다.AFM 비디오 창에서 반사 신호를 관찰하여 레이저를 조잡하게 배치하십시오. 이 AFM 모델의 경우 AFM 측정 헤드의 오른쪽과 뒤쪽 바퀴를 돌려 AFM 레이저의 X 및 Y 위치를 조정하여 캔틸레버 끝의 중앙으로 향하게 합니다. 그런 다음 두 개의 바퀴로 레이저 위치를 미세 조정하여 검출기 합계 신호를 최적화합니다.검출기 어레이의 상단 및 하단 다이오드에서 나오는 다른 신호를 영점 조정하여 AFM 레이저 반사를 검출기 센터로 향하게 합니다. 이 단계에서는 이 AFM 모델의 측정 헤드 왼쪽에 있는 나사를 돌립니다. 다음으로, 소프트웨어의 마스터 패널 튜닝 창으로 이동하여 캔틸레버 상주 주파수를 결정합니다.캔틸레버 발진을 구동하는 피에조의 1볼트 입력에 해당하는 진폭을 선택한 다음 발진 주파수를 상주 주파수보다 약간 낮은 음의 5%로 설정합니다. 이제 자동 주파수 조정을 수행하고 진동의 위상을 0으로 만듭니다. 드리프트를 피하기 위해 이미징을 시작하기 약 1시간 전에 시스템을 열 평형에 도달하도록 두십시오.이미징을 시작할 준비가 되면 소프트웨어 메인 패널에서 보호 설정점을 설정하고 참여를 선택하여 팁이 샘플 표면에 접근할 수 있도록 준비합니다. 보호 설정 또는 설정점에 도달할 때까지 AFM 헤드의 앞바퀴를 수동으로 내립니다. 그런 다음 Z 센서 신호가 왼쪽으로 완전히 확장될 때까지 앞바퀴를 조심스럽게 더 내립니다.진동 진동 테이블을 활성화하고 음향 차단 인클로저를 닫습니다. 다음으로, 햄스터 쳇바퀴를 사용하여 AFM 팁과 샘플의 미세한 맞물림을 통해 AFM 소프트웨어의 설정값을 낮춥니다. 반발 영역에서 태핑 모드 이미징을 수행하려면 위상 신호가 자유 레벨 위상보다 약간 낮아질 때까지 설정값을 낮추십시오.그런 다음 샘플 스캔을 시작합니다. 픽셀 해상도가 각각 2, 048 또는 4, 096인 4마이크로미터 x 4마이크로미터 또는 8마이크로미터 x 8마이크로미터 정사각형의 이미지 표면적에서 초당 2.5마이크로미터의 스캔 속도를 사용합니다. 그리고 스캔 수행 버튼을 누릅니다. AFM 소프트웨어에서 이미지를 직접 육안으로 검사하여 관련 단백질 DNA 복합체를 사전 선택합니다.XPD 샘플의 경우, 가능한 복합체에는 XPD p44 DNA뿐만 아니라 XPD와 p44의 분자 질량이 다르기 때문에 크기가 뚜렷하게 다른 XPD DNA 및 p44 DNA가 포함됩니다. 분석 창의 절편 도구를 사용하여 DNA에서 개별 단백질 피크의 부피를 측정하고 절편 창 커서로 단백질 피크 절편의 높이와 직경을 측정합니다. 이 값을 사용하여 복잡한 유형을 검증하기 위한 간단한 수학적 모델을 사용하여 피크의 부피를 결정할 수 있습니다.마지막으로, 분자량이 알려진 다양한 단백질로 AFM 시스템을 보정하여 이러한 부피를 단백질 및 단백질 복합체의 대략적인 분자량으로 변환합니다. DNA 단편 길이, DNA에서 단백질 복합체의 위치, 표적 부위 특이성 또는 DNA 밴드 각도와 같은 추가 기능을 확인하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 여기에 표시된 것은 서로 다른 크기에 따라 구별할 수 있는 세 가지 유형의 DNA 결합 복합체가 있는 AFM 이미지입니다.클래스 1 복합체는 헬리카제 활성화 보조 인자 p44와만 일치하고, 클래스 2 복합체는 XPD 단백질로만 구성되며, 클래스 3 복합체는 XPD와 p44 모두로 구성되며, XPD에 의한 군단 인식은 p44에 의한 헬리카제 활성의 활성화를 요구하며, 클래스 3 복합체만 병변 인식을 보여줍니다. 다른 병변 인식 전략을 확인하기 위하여는, DNA 기질에 단백질의 위치는 원핵생물과 진핵생물 NER helicase를 위해 빨강으로 표시된 DNA 병변에서 5개의 주요한 방향에 있는 DNA 거품에 단백질 선적을 위해 측정되었습니다. 단백질 위치 분포에서 DNA 병변 인식은 DNA 병변 위치에서 향상된 결합으로 인해 피크로 볼 수 있습니다.원핵생물 NER helicase UVRB와 진핵생물 대응물인 XPD는 서로 다른 DNA 가닥 선호도를 나타내는 다양한 CPD 병변 인식 전략을 보여줍니다. 구체적으로, CPD 병변은 UVRB에 의해 전위된 가닥에서 인식되지만, XPD에 의해 반대의 전위되지 않은 가닥에서 우선적으로 인식됩니다. 일단 마스터하면 이 방법은 분석을 포함하여 몇 시간 또는 며칠 안에 완료할 수 있습니다.고순도 단백질 및 DNA 샘플로 작업하여 AFM 이미지의 특징을 해석하고 생물학적 시스템과 해결하고자 하는 질문에 따라 DNA 기질을 신중하게 설계하는 것이 중요합니다. 또한 겔 전기영동 공간, 전기이동성 이동 또는 DNA 절개 분석과 같은 앙상블 방법은 물론 이러한 AFM 실험과 매우 상호 보완적입니다. 이러한 방법은 DNA 결합 친화성 또는 DNA 병변 절제 활동과 같은 추가 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 단백질 DNA 복합체를 직접 시각화할 수 있는 비교적 빠르고 간단한 접근 방식이며, 이러한 복합체는 생물학적 시스템에서 발생하는 과정에 대한 좋은 그림을 제공합니다.물론 이것은 DNA 복구 과정을 이해하는 데 유용할 뿐만 아니라 다른 단백질 DNA 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 즐겨 사용하는 단백질 DNA 시스템에서 샘플을 준비하는 방법, AFM으로 이미지를 만드는 방법, 데이터 해석을 위해 유용한 매개변수를 추출하는 방법에 대해 꽤 잘 알게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 방사선 조사된 세포핵의 이중 가닥 DNA 절단 부위에서 DNA 복구 단백질 γH2AX 및 53BP1의 국소화를 시각화하기 위한 면역형광 방법에 대해 설명합니다.

DNA 복구 단백질 상호 작용의 면역형광 기반 시각화

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 프로토콜은 레이저 미세 조사에 의한 DNA 수리 단백질 모집 측정과 같은 하류 현미경 연구를 위한 S상 세포를 효율적으로 식별하는 비침습적 방법을 설명합니다.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

이 작품은 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성을 검출 할 수있는 간단하고 시각적 인 방법을 제시한다. 액적 조작 및 다 염기 다형성의 검출을 포함하는 제안 된 방법은 전체 실험을 통해 고급 장비의 도움없이 23 ° C 부근 수행 될 수있다.

공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

배우세요 원자력 현미경을 이용한 DNA 손상 인식 메커니즘 연구 방법을. 뉴클레오타이드 절제 수복 시스템에서 단백질-DNA 상호작용을 직접 시각화하여 손상 인식 과정을 분석하는 기술입니다.

핵 포스 현미경 검사에 의한 DNA 절편 검사에서의 DNA 병변 인식 연구

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