질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을 체외 세포 배양

이 절차의 목표는 배양된 세포에서 사이토크롬 P450 또는 CYP의 활성을 측정하는 것입니다. CYP는 의약품 및 독성 물질의 대사에 관여하는 핵심 효소이며 이들의 발현은 종종 체외에서 유지되지 않습니다. CYP 효소의 정상적인 발현은 세포가 in vitro에서 배양될 때 종종 손실됩니다.

따라서 많은 체외 모델은 의약품 및 독성 물질의 대사를 이해하는 데 관련성을 잠재적으로 제한하고 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 배양된 세포에서 CYP 활성을 평가할 때 간단하다는 것입니다. 프로브 기질과 억제제를 사용하여 질량 분석법을 포함한 다양한 정량화 플랫폼이 제시됩니다.

시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포가 있는 극저온 바이알을 얻습니다. 제공된 프로토콜은 간 세포주를 예로 사용합니다. 멸균 상태에서 작업하는 동안 극저온 바이알을 조심스럽게 열어 과도한 압력을 해제한 다음 극저온 바이알의 내용물을 섭씨 37도에서 예열된 9ml의 Williams'E 배지로 채워진 10ml 튜브에 피펫으로 넣습니다.

용액을 실온에서 400 회 g에서 10 분 동안 원심 분리하십시오. 상등액을 버린 후, 5 밀리리터의 독점적 인 해동 배지에 세포를 다시 현탁시키고 섭씨 37도로 예열하고 글루타민을 보충합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 생존 가능한 세포를 계수한 후, 웰당 60, 000개의 생존 가능한 세포의 밀도와 0.5 밀리리터의 해동 배지의 최종 부피로 24 웰 콜라겐 코팅 플레이트에 세포를 파종합니다.

배양에서 며칠 후, 세포는 subconfluent 섬유주 구조를 형성합니다. 최적의 대사 활동은 일반적으로 7일에서 10일 사이에 관찰되며 4일째에 가장 낮습니다. 분화된 기도 상피 배양을 준비하려면 삽입물의 공기-액체 계면에서 성장한 상업적으로 이용 가능한 완전히 분화된 1차 기도 상피를 사용하십시오.

멸균 핀셋을 사용하여 아가로스 매트릭스에서 세포 삽입물을 부드럽게 제거하고 700마이크로리터의 독점 배양 배지가 사전 로드된 새 플레이트로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에서 참조되는 방법(예: 경상피 저항 또는 섬모 박동 빈도)을 사용하여 기도 조직의 무결성을 평가합니다. 실험에 앞서, 기도 세포를 위한 두 개의 세포 삽입물을 준비하고 간 세포를 위한 웰을 최소 3번의 반복으로 준비합니다.

한 시리즈는 억제 실험에만 사용하고 다른 시리즈는 대사 프로브에만 사용하십시오. 세 번째 계열의 셀을 미디어 빈 컨트롤로 준비합니다. 실험 당일, 세포 배양 배지를 450마이크로리터의 새 배지로 교체합니다.

억제 실험을 위해 준비된 일련의 세포에 10x CYP 억제제를 함유한 배지 50마이크로리터를 추가하고 30분 동안 사전 배양합니다. 다음으로, 억제 계열의 배지를 450마이크로리터의 새 배지로 교체하고 10x CYP 억제제와 10x 프로브 기질을 모두 포함하는 50마이크로리터의 배지를 추가합니다. 50x 프로브 기판이 있는 매체 10마이크로리터를 다른 셀에 추가한 다음 배지로 희석된 동일한 양의 차량을 블랭크 셀 컨트롤에 추가합니다.

, 제로 백그라운드 제어 시점 동안 0-5분 동안 세포를 배양한 후, 배지를 별도의 라벨링된 튜브에 수집하고 향후 처리를 위해 배지를 동결합니다. 그런 다음 세포 배양기에서 16시간 동안 시점 2개의 세포를 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 대사 산물의 정량화를 위해 동일한 방법을 사용하여 배지를 수집합니다.

250마이크로리터의 배양 배지를 1.5ml 마이크로튜브로 옮기고 4-메틸럼벨피페론 내부 표준 원액을 첨가하여 최종 농도인 100나노몰에 도달합니다. 한 번에 1마이크로리터씩 1몰 HCl을 추가하여 배지의 pH를 4.5에서 5.0 사이로 조정합니다. pH 스트립에 2-10 마이크로리터의 배지를 피펫팅하여 pH를 확인한 다음 Helix pamatia의 베타글루쿠로니다아제 아릴설파타아제 150 단위를 추가합니다.

섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 후 250마이크로리터의 차가운 메탄올을 첨가하여 반응을 중지합니다. 섭씨 45도에서 진공 원심분리기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. 500마이크로리터의 30%아세토니트릴-물 용액으로 샘플을 재구성합니다.

질량 분석 기반 정량 분석을 수행하려면 각 직렬 희석 표준물질 250마이크로리터를 amber ultra performance 액체 크로마토그래피 유리 바이알에 추가하여 UPLC-MS 자동 시료 주입기에 주입할 수 있습니다. 또한 테스트 샘플을 황색 UPLC 바이알에 넣고 UPLC 자동 샘플러에 넣습니다. 모든 바이알을 무작위 추출한 후 정량화할 특정 프로브에 따라 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 설정을 사용하여 UPLC-MS를 실행합니다.

질량분석기 정량화 도구에서 Quantitate, Build Quantitation Method 도구를 사용하여 획득한 합성 표준물질 및 내부 표준물질에서 검량선을 생성한 다음 Quantitation Wizard를 사용하여 샘플 배치 및 샘플을 선택하여 정량화하고 정량화 Method를 실행합니다. CYP1A1, CYP1B1을 유도하려면 텍스트 프로토콜에 있는 플레이트 레이아웃을 사용하십시오. 배지에서 10 나노몰 TCDD의 최종 농도로 유도하도록 지정된 세포를 72시간 동안 배양합니다.

이 기간이 지나면 매체를 제거하고 PBS로 웰을 세 번 헹구고 새 배지를 추가합니다. luminogenic reporter probe로 세포를 배양하기 전에 배지에서 CYP1A1, CYP1B1 억제제를 사용하여 유도된 세포의 지정된 하위 집합을 30분 동안 사전 배양합니다. 발광 소품, luciferin 6'chloroethyl ether를 최종 농도 50 마이크로 몰로 non-induced, induced 및 induced plus 억제제 세포에 첨가하십시오.

4시간 동안 배양한 다음 25마이크로리터의 배양 배지를 흰색의 불투명한 96웰 플레이트로 옮기고 제조업체에서 제공한 25마이크로리터의 루시페린 검출 시약을 추가합니다. 실온에서 20분 동안 배양한 후 광도계를 사용하여 즉시 플레이트를 읽습니다. CYP1A1, CYP1B1에 의해 촉매 작용되는 루시페린 6'클로로에틸 에테르의 딜킬화에 의해 생성된 상대 발광이 여기에 제시되어 있습니다.

이 예는 TCDD 유도가 없는 경우 효소 활성이 없음을 보여줍니다. TCDD 유도 후 CYP1A1, CYP1B1 활성은 간 및 호흡기 세포 유형 모두에서 관찰됩니다. 마지막으로, CYP1A1, CYP1B1 억제제 알파-나프토플라본을 첨가하면 CYP 활성이 감소하거나 제거됩니다.

간 및 기도 세포 유형에서 CYP2A6, 2A13 활성을 평가하기 위해 효소에 의한 쿠마린의 하이드록실화를 통해 생성된 7-하이드록시쿠마린의 양을 UPLC LC-MS를 사용하여 측정했습니다. 쿠마린으로 0분 배양하면 배경만 감지됩니다. 16시간 후, 두 가지 세포 유형에서 7-하이드록시쿠마린이 형성되면서 쿠마린의 하이드록실화가 관찰됩니다.

마지막으로, CYP2A, 2A13 억제제를 추가하면 7-하이드록시쿠마린의 형성을 방지할 수 있습니다. 이 기법의 프로브 배양 및 정량화 부분은 대부분의 경우 몇 시간에서 최대 하루까지 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 다양한 세포 유형을 사용하여 다양한 1상 대사 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 필요에 따라 억제 및/또는 유도를 사용하여 효소의 특이성을 확인할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포 유형에 따라 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있음을 기억하는 것이 중요하며 양성 대조군으로 사용할 수 있는 세포 유형을 포함하는 것이 중요합니다. TCDD로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 완전한 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 이 기술의 의미는 신약의 전임상 평가 및 소비자 제품에 사용되는 화학 물질 및 성분의 위험 평가에 적합한 체외 모델을 사용하는 것으로 확장됩니다.