Name: 질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을 체외 세포 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 질량 분석 및 발광 기반 접근법을 활용한 체외 세포 배양에서 CYP 효소 활성 평가 방법입니다. 이 기술은 약물 대사 연구와 독성학적 안전성 평가에 필수적인 단계 I 대사 역량 특성화에 활용됩니다.

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저자는 기도 세포와 간 세포 현미경 사진을 제공해 준 Epithelix Sarl과 Biopredic International, 그리고 실험 과정을 보여주는 그림에 대해 Neil Smith에게 감사를 표합니다.

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AB와 EM이 원고 작성 당시 브리티쉬 아메리칸 토바코의 직원이었다. 이 논문에서 설명하는 작업은 브리티쉬 아메리칸 토바코에 의해 투자되었다,이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 브리티쉬 아메리칸 토바코 지불했다.

현재, 많은 표준화 된 독성 시험 시스템은 정상적인 인간의 신진 대사 하나의 대표하지 않습니다 엔지니어링 세균, 세포 선, 또는 배아 세포를 사용합니다. 이것은 화학 물질 또는 약의 잠재적 인 독성 활동의 부정확 한 예측으로 이어질 수 있습니다. 이러한 칩 3D 세포 배양 및 장기 등의 생체 외 모델의 혁신적인 개선 인체 조직 21, 22, 23의 일반적인 형태 및 대사 활성을 복제하기위한 시도로 개발되고있다. 대사 능력 모델이 가장 독성 약물 평가 및 연구에 적합한 생물 전환 된 해독하는데 사용될 수있는 하나 개의 기준이다. 우리는이 논문에서 설명했다 프로토콜은 살아있는 세포를 사용하여 CYP 효소의 활동을 측정하도록 설계되었습니다. 그것은 유연하고 2D 또는 3D이 배양 다른 전지 시스템에 사용할 수 있습니다ES와 luminogenic 프로브 - 또는 질량 분석 기반 접근 방식을 사용 할 수있는 옵션을 제공합니다. 두 가지 방법은 재료의 나노 그램 수량을 감지하고 만 다공 형태로 성장하는 소수의 세포를 필요로 할만큼 민감하다. 또한 회전 타원체에 적용 할 수 또는 세포는 복잡한 매트릭스에서 재배. 프로브 기판의 선택은 분명 프로토콜의 중요한 요소이다. 상기 분석의 특이성은 선택적 CYP 억제제의 사용에 의해 얻어 질 수 CYP 효소 보증 다른 층의 선택적 인 프로브에 의존한다. 기판 및이 문서에 나와 억제제는 몇 가지 예에 불과하지만, 다른 사람은 문헌에서 찾을 수 있습니다. 이 효소는 낮은 수준으로 발현되는 것에 기인 할 수있는 네거티브 CYP 활성 결과로서 새로운 세포 유형으로 작동 할 때 복수의 배양 시간을 고려하는 것이 중요하다. 양성 대조군으로 사용할 수있는 세포 유형의 추가한다는 보장하는 것이 바람직부정적인 결과는 기술적 인 문제에 어떤 문제 해결에 도움이 연결되지 않습니다. 주 간 세포가 대사 능력이 서스펜션 예를 차 간세포를 들어, 대조군으로 사용 할 수있는 것은 매우 쉽게 쓸 수 있지만 그들의 생존은 시간에 제한됩니다. 간 세포 라인이 프로토콜에 설명 된대로 사용하는 것이 상대적으로 용이 가능한 대안이지만, 일부는 신진 대사 활동 (6), (21)의 측면에서 다른 사람보다 더 낫다. 분석은 총 단백질 정량되지 않는 비 파괴적이기 때문에, 종 공부 (20)에 시간 경과 CYP 활성을 수행 할 수있다. 일부 세포는 배양 시간이 지남에 따라 변수 CYP 활동을하고 있기 때문에 이것은 중요한 포인트입니다. 음의 결과는 시험관 내에서 분화 또는 탈분화로 포화 상태의 부족, 진행과 연관 될 수 있습니다. 이 경우, 접근 방식은 반 quantitati입니다데이터는 각각의 세포 배양 물에서 단백질의 총량에 의해 정규화되지 않으므로했습니다. TCDD의 경우와 같이 조직에 대한 독성 효과를 가질 수있는 프로브, 억제제 또는 유도 물질에 대한 노출로 CYP 활성을 측정 한 후, 조직을 재사용하는 것이 불가능하거나 바람직하지 않습니다. 같은 마이크로 솜 같은 셀 분수는 주어진 세포 유형의 CYP 활동을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 미크로 제제는, 그러나, 셀 재 적절한 보조 인자의 첨가 많이 필요하고, 효소 활성을 유지하도록 버퍼. 살아있는 세포를 사용하여 까다로운 마이크로 좀의 준비 단계를 제거하고 버퍼링 공동 인자가 가장 잘 작동하는 운동. 일반적인 추천 정보로서, 추가로이 효소 활성과 일치하는지 확인하는 세포 배양에서 CYPs의 발현 프로파일을 특성화하기위한 가장 좋은 방법이다. 검증이 추가 레벨은 신진 대사 프로브는 enti되지 않습니다 주어진 권장단일 CYP 특정 의존하며 측정 된 대사 활성은 해당 효소의 발현에 의해 일치 증가 된 신뢰도를 제공한다. CYPs 멤브레인 단백질이기 때문에 그러므로 그들은 정량적 RT-PCR이 효소 20 프로파일에 바람직한 접근왔다 웨스턴 블랏을 준비하기 위해 상대적으로 어렵다. 이 프로토콜은 단지 하나의 중요한이라도 대사 효소 패밀리 중 하나를 나타내는 분석 CYP 효소 활성에 대한 방법을 설명하는 것이 중요하다. 질량 분광 분석 방법의 유연성은 프로브 기판의 다른 대사 변환에 대한 취득 방법의 개발을 허용한다. 그러나, 그것들은 한번에 하나씩 개발되어야 할 현재 공지 적은 특정 프로브 및 다른 대사 효소 군에 대한 선택적 억제제가있다. 이 격차는 체외 세포 등산용의 신진 대사 능력의 종합적인 평가를 할 수 있도록 해결해야MS.

생체이 대사는 신체 외부 화학 물질들이 배출을 용이하게 한 친수성기와 복합체의 첨가에 의해 수정되는 과정이다. 일반적으로 생체 이물질의 대사 제가 하나 이상의 수산기 (1, 2)의 첨가와 함께 산화 주로 이루어지는 단계와 두 단계 프로세스이다. 예컨대 글루 쿠로 니드 또는 황산 부분 (1, 2)과 같은 친수성 복합체에 대한 수용체로서 단계 II에서, 수산기가 사용된다. 셉터 그룹이 이미 분자에 존재하는 경우, 접합 공정 독립적 I 상 대사 일어날 수있다. 각 화학 반응 기판 (3)의 특정 효소의 기, 예를 들어, 히드 록 실화를 촉매 CYPs (시토크롬 P450s) (도 1), 탈 알킬화에 의해 수행된다. ConjugatioN sulfotransferases에 의해 촉매되는, UDP-glucuronosyltransferases (도 1), 글루타티온 S 트랜스퍼 - 및 N- 아세틸 트랜스퍼 4. 각 조직 및 기관은 그 대부분의 단백질을 발현시키는 간암으로 특정 대사 효소의 발현 프로파일을 가질 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> 그림 1 : 단계 I와 쿠마린을위한 단계 II 대사의 예. CYP2A6은 / 쿠마린의 7 수산화을 촉진 CYP2A13. 7- 하이드 록시 쿠마린이 UGT1A6 및 UGT1A9 가장 높은 활성을 보여주는, 단계 II 효소에 의한 글루 쿠 UGTs 잔기에 접합된다. 생체 이물질의 신진 대사를 이해하는 것은 두 가지 이유에 대한 약물 안전성 평가 및 화학 위험 평가에 중요한 : 반응 속도론은 약물이나 화학 물질은 활성 또는 비활성 형태 B의 몸에 남아 시간을 결정합니다는 efore 배설; 및 모 화합물 대사 효소에 의해 더 반응성 불안정한 독성 종으로 변형 될 수있다. 또한 &quot;생리 활성&quot;로 알려진 이러한 반응은 대부분 내가뿐만 아니라 상 II 결합 (5)에 의해 희소 한 경우에 효소를 CYP 단계에 의해 구동된다. 이를 바탕으로 정확하게 약물이나 화학 물질과 관련된 위험을 예측하는 체외 모델의 능력은 전지 시스템의 신진 대사 능력에 크게 의존한다. 병든 조직 또는 정상 세포의 변형 유래 세포주에 종종 부분 아니라면 원점 (6)의 이들 조직의 대사 효소 프로필 대표 모두 잃는다. 정상 대사 효소 프로파일의 유지는 (적어도 단기간 배양)에서 일차 세포 배양 물에 잘 나타나 조직이 그것의 3 차원 구조 (1)를 유지할 수 있도록 매트릭스 배양 할 경우 더욱 향상된다. 따라서 문자체외 전지 시스템의 신진 대사 능력의 acterization 세포 모델은 화학 물질 안전성 평가를 수행 할 적절한에 관한 결정을 안내하는 중요한 예비 단계입니다. 본 연구에서 우리는 간 세포주 7 3D 차 폐암 세포 배양 8 애플리케이션의 예는 시험관 내에서의 활성 및 단계 I CYP 효소의 발현을 프로필에 대한 프로토콜을 제시한다. CYP 특정 기질 대사 억제제 제품 및 컨트롤 질량 spectrometry- 및 luminogenic 기반 정량 방법과 함께 설명한다. 일부 CYPs을 유도하고 다른 구성적인 때문에, 예는 그 두 가지 시나리오에 대해 구체적으로 살펴 보도록한다.

<table><tbody><tr><td>시약 & 세포</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; m 주사기 여과기</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-페닐 펜타인</td><td>시그마 Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxybupropion</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxychlorzoxazone</td><td>시그마 Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-에톡시쿠마린</td>, <td>시그마, 알드리치</td><td>, 195642</td><td></td></tr><tr><td>7-하이드록시쿠마린</td>, <td>시그마, 알드리치</td>, <td>H24003</td><td></td></tr>, <tr><td>8-메톡시프소랄렌</td>, <td>시그마, 알드리치</td>, <td>M3501</td><td></td></tr>, <tr><td>아세트산</td><td>, 시그마 알드리치</td><td>, 695092</td><td></td></tr>, <tr><td>아세토니트릴</td>, <td>피셔</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&알파;-나프토플라본,</td><td>시그마 Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCA 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-글루쿠로니다아제/아릴설파타제</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>부프로피온</td><td>시그마 Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepine</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>클로르족사손</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐</td><td>세포 시스템</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>쿠마린</td><td>시그마 알드리치</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>디설피람</td><td>시그마 알드리치</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>플루복사민</td><td>시그마 알드리치</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스(글루타민 보충제)</td><td>피셔</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG 대사 보충제</td><td>머크</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG 해동 미디어 보충제</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir 기도 세포</td><td>상피</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir 기도 세포 유지 관리 매체</td><td>상피</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &뮤; m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>시그마 Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro; m 2.1 x 50 mm</td><td>Waters</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>윌리엄스 전자 매체</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS 소프트웨어</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Analyst 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

질량 분석 및 luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 i 대사 역량의의 특성을<em&gt; 체외</em&gt; 세포 배양

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

생체이 대사 효소는 용해도를 증가 및 배설을 촉진 작용기를 첨가하여 약제의 독성 물질 및 생물 전환에 중요한 기능을 담당한다. 어떤 경우에 그 구조 변경은 새로운 독성 제품의 형성으로 이어질. 동물 실험을 줄이기 위해, 화학적 위험은 대사 능력이 세포를 이용하여 평가 될 수있다. 대사 효소의 발현은, 그러나, 체외 차 문화 시스템에서 많은 시간 이상 안정되지 종종 세포 라인의 일부 또는 존재하지 않는다. 따라서, 생체 외 의약품, 첨가제, 환경 오염 물질 대사의 연구는 이상적으로 신진 대사 활동이 특징되었습니다 전지 시스템에서 수행되어야한다. 우리는 UPLC 질량 분석에 의한 정량적 화학 프로브 및 대사 제품을 사용하여 2D 세포주 및 기본 3D의 문화 대사 효소의 클래스의 활동 (인간 단계 I)를 측정하기 위해 여기에 방법을 설명하고luminometry. 방법 세포주 및 다양한 조직으로부터 유도 된 세포의 주 대사 활성을 테스트하도록 구현 될 수있다.

세 가지 공여체 (기도 M360, M370, M417) 및 간 세포주 HEP (선)에서기도 세포 배양 두 CYPs 쌍 (CYP1A1 / 1B1 및 CYP2A6 / 2A13) 측정 대사 활성의 예는도 6에 나타낸다 (20). CYP 활성 측정 luminometry 도 6a는 호흡기 세포에서 룩 - CEE (루시페린 6&#39;- 클로로 에틸 에테르) (3 도너)와 함께 및 TCDD 유도없이 간 세포의 CYP1A1 / 1B1 O-탈 알킬화 활동에 의해 생성 된 상대 발광을 나타낸다. CYP1A1 / 1B1 높게 유도 효소이며, 통상적으로 대부분의 조직의 구성 적 수준에서 발현되지 않는다. 세포가 유도되지 않는 경우도 6a에서 알 수있는 바와 같이, 더 luminogenic 신호가 검출되지 않는다. 두 세포 유형은 TCDD 강한 CYP1A1 / 1B1 유발제 마크로 사전 배양하면ED luminogenic 신호는 제어부 (도 6a)와 비교하여 검출된다. 이는 룩 - CEE 프로브 이후 정량화 루시페린 부분의 박리로 이어지는 대사되었음을 나타낸다. 전체적으로 TCDD 처리 간 세포주에서 활성 심지어 총 단백질 정규화 후에,기도 세포보다 낮다. 세포주는 일차 전지보다 대사 활성화하는 경향이 있기 때문에 이것은 드문 일이 아니다. α-naphthoflavone 첨가 CEE 상기 룩 - 대사 CYP 의존성을 확인 모든 세포 유형에서 CYP1A1 / 1B1 활성에 명확한 억제 효과를 갖는다. UPLC-MS를 사용 CYP450 대사 산물의 정량 도 6b는 INHI의 존재와 부재 및 쿠마린과 배양 후 3 도너 (기도 M343, M345, M347) 및 간 세포 (간염 라인)에서기도 세포 CYP2A6 / 2A13 활성의 정량화를 도시BITOR 8 methoxypsoralen. 데이터는 전체 단백질 정규화된다. 0 분 쿠마린 배양 컨트롤 어떠한 하이드 록시 쿠마린 (7)는 (도 6b) 검출되지 않는다. CYP2A6 / 2A13 특정 조직에서 구성 적으로 발현되는 7 하이드 록시 쿠마린의 형성 쿠마린 따라서 후 16 시간 배양에도 유도하지 않고, 테스트를 다른 유형의 세포에서 발견된다. 8-methoxypsoralen 때 CYP2A 억제제 (도 6B)는, 7 하이드 록시 쿠마린의 형성이 상당히 감소된다 첨가한다. 억제가 거의 완료되는 다른 CYPs 또한 기판을 인식하지만, 훨씬 덜 효율적으로 처리 할 수 ​​있습니다 이후 CYP 억제제의 존재, 여전히 잔존 활동을 감지하는 것이 정상입니다 주목해야한다. 또한 그것이기도 세포 CYP2A6 볼 같이 일차 전지를 사용하는 경우, 기록 대사 활성은 공여체와 상이 할 수 있음을 관찰 할 수있다(도 6b). 이것은 CYP 활동이 각 기증자의 유전자형과 유전자 다형성에 대한 책임이로 예상된다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> 도 6 : 활성 분석법은 CYP1A1에 대한 결과 / 1B1 활성 (A) 및 간 세포주 세기도 세포 기증자 (M360, M370, M417)에 CYP2A6 / 2A13 활성 (B). (A) - 루크 CEE 탈 알킬화 활성와 TCDD 의한 CYP1A1 / 1B1의 유발없이 나타낸다. α-naphthoflavone은 CYP1A1 / 1B1 억제제로서 사용 하였다. 활성 분 (최소)으로 배양 시간에 의해 정규화 된 상대 발광 단위 (RLU) 총 단백질 (㎎)으로 표현된다. 들은 항시 적으로 발현 될 때 (B) CYP2A6 / 2A13 유도를 필요로하지 않는다. pmol의 / 분 / mg의 단백질의 쿠마린 -7- 히드 록 실화 활성 억제제와 8 methoxypsor없이 다양한 시점에서 도시ALEN. 모든 결과는 평균의 표준 편차와 3 개 개의 독립적 인 측정의 평균 값으로 표시하고 있습니다. 이 수치는 박스터 (20)에서 수정되었습니다. 보충 표 1 : UPLC 및 질량 분석기 설정. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

체외 시스템의 신진 대사 능력은 약물 및 독성 물질의 생체 내 변화 및 처분을위한 핵심 요구 사항입니다. 이러한 프로토콜에서는, I는 세포 배양 대사 위상을 평가하기위한 기준 대사 프로브의 적용을 설명한다.

질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을<em&gt; 체외</em&gt; 세포 배양

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

본 실험 과정의 목적은 배양 세포 내 시토크롬 P450(cytochrome P450s, CYPs)의 활성을 측정하는 것입니다. CYP는 약물 및 독성 물질의 대사에 관여하는 핵심 효소이며, in vitro 상태에서는 그 발현이 유지되지 않는 경우가 많습니다. 세포를 in vitro에서 배양할 때 CYP 효소의 정상적인 발현이 소실되는 경우가 빈번합니다.따라서 많은 in vitro 모델은 의약품 및 독성 물질의 대사를 이해하는 데 있어 관련성 측면에서 잠재적인 한계가 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 배양 세포 내 CYP 활성을 평가할 때 단순하다는 점입니다. 프로브 기질과 억제제를 사용하여 질량 분석법을 포함한 다양한 정량 플랫폼이 제시됩니다.먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포가 담긴 냉동 보관 튜브를 준비합니다. 제공된 프로토콜은 간 세포주를 예시로 사용합니다. 멸균 상태에서 냉동 보관 튜브를 조심스럽게 열어 과도한 압력을 제거한 다음, 튜브의 내용물을 37 °C로 예열된 Williams'E 배지 9 mL가 채워진 10 mL 튜브에 피펫으로 옮깁니다.용액을 상온에서 400 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 37 °C로 미리 데우고 글루타민을 첨가한 5 mL의 전용 해동 배지에 세포를 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 생존 세포 수를 측정한 후, 웰당 60,000개의 생존 세포 밀도로 콜라겐 코팅된 24웰 플레이트에 세포를 분주하고, 최종 부피가 해동 배지 0.5 mL가 되도록 합니다.며칠간 배양하면 세포는 아합류(subconfluent) 소주 구조를 형성합니다. 최적의 대사 활성은 일반적으로 7일에서 10일 사이에 관찰되며, 4일째에 가장 낮습니다. 분화된 기도 상피 배양물을 준비하려면, 인서트 위에서 기액 계면(air-liquid interface) 방식으로 성장시킨 시판용 완전 분화 일차 기도 상피 세포를 사용하십시오.멸균 핀셋을 사용하여 아가로스 매트릭스에서 세포 인서트를 조심스럽게 분리한 후, 700 µL의 전용 배양이 담긴 새 플레이트로 옮깁니다. 경상피 전기저항(transepithelial resistance) 또는 섬모 박동 주파수(cilia beat frequency)와 같이 텍스트 프로토콜에 언급된 방법을 사용하여 기도 조직의 무결성을 평가합니다. 실험 전에 기도 세포용 세포 인서트와 간 세포용 웰을 각각 최소 3회 반복 실험이 가능하도록 두 세트씩 준비합니다.한 세트는 억제 실험에 사용하고, 다른 한 세트는 대사 프로브 전용으로 사용하십시오. 세 번째 세포 세트는 배지 공시료 대조군으로 준비하십시오. 실험 당일에 세포 배양액을 450 µL의 신선한 배지로 교체하십시오.10x CYP 억제제가 포함된 배지 50 µL를 억제 실험을 위해 준비된 일련의 세포에 첨가하고 30분 동안 사전 배양합니다. 다음으로, 억제 실험군 세포의 배지를 신선한 배지 450 µL로 교체하고, 10x CYP 억제제와 10x 프로브 기질이 모두 포함된 배지 50 µL를 첨가합니다. 나머지 세포에는 10x 프로브 기질이 포함된 배지 50 µL를 첨가하며, 공시료 세포 대조군에는 배지로 희석한 동일 양의 용매(vehicle)를 첨가합니다.시점 1(0분 배경 대조군)을 위해 세포를 0분에서 5분 동안 배양한 후, 배지를 각각 라벨이 부착된 튜브에 수집하여 추후 처리를 위해 냉동 보관하십시오. 그런 다음 시점 2의 세포를 세포 배양기에서 16시간 동안 배양하십시오. 배양 기간이 끝나면, 동일한 방법으로 배지를 수집하여 대사 산물을 정량하십시오.배양 배지 250 microliters를 1.5 milliliter 마이크로튜브로 옮기고, 4-methylumbelliferone 내부 표준물질 스톡 용액을 추가하여 최종 농도가 100 nanomolar가 되게 합니다. 1 molar HCl을 1 microliter씩 추가하여 배지의 pH를 4.5에서 5.0 사이로 조정합니다. 배지 2~10 microliters를 pH 스트립에 피펫팅하여 pH를 확인한 후, Helix pamatia 유래 betaglucuronidase arylsulfatase 150 units를 첨가합니다.37°C에서 1시간 동안 배양한 후, 250 µL의 차가운 메탄올을 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 45°C의 진공 원심분리기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. 500 µL의 30% 아세토니트릴 수용액으로 시료를 재구성합니다.질량 분석 기반 정량을 수행하려면, 각 계열 희석 표준물질 250 microliters를 UPLC-MS 오토샘플러 주입용 갈색 초고성능 액체 크로마토그래피 유리 바이알에 첨가합니다. 또한 테스트 샘플을 갈색 UPLC 바이알에 넣고 UPLC 오토샘플러에 배치합니다. 모든 바이알을 무작위로 배열한 후, 정량하려는 특정 프로브에 따라 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 설정으로 UPLC-MS를 실행합니다.질량 분석기 정량 도구의 Quantitate, Build Quantitation Method 도구를 사용하여 획득한 합성 표준물질과 내부 표준물질로부터 검량선을 생성한 다음, Quantitation Wizard를 사용하여 정량할 샘플 배치와 샘플을 선택하고 정량법을 실행하십시오. CYP1A1, CYP1B1을 유도하려면 텍스트 프로토콜에 있는 플레이트 레이아웃을 사용하십시오. 유도용으로 지정된 세포를 최종 농도 10 nanomolar TCDD가 포함된 배지에서 72시간 동안 배양하십시오.이 기간이 지난 후, 배지를 제거하고 웰을 PBS로 3회 헹군 다음, 신선한 배지를 추가합니다. 루미노제닉 리포터 프로브와 함께 세포를 배양하기 전, 유도된 세포의 지정된 하위 집단을 배지 내의 CYP1A1, CYP1B1 억제제와 함께 30분 동안 사전 배양합니다. 비유도 세포, 유도 세포 및 억제제가 추가된 유도 세포에 루미노제닉 프로브인 luciferin 6'chloroethyl ether를 최종 농도 50 micromolar로 첨가합니다.4시간 동안 배양한 후, 배양액 25 µL를 흰색 불투명 96-well 플레이트로 옮기고 제조사에서 제공한 루시페린 검출 시약 25 µL를 첨가합니다. 상온에서 20분 동안 배양한 후, 루미노미터를 사용하여 즉시 플레이트를 측정합니다. 여기서는 CYP1A1, CYP1B1에 의해 촉매되는 luciferin 6'chloroethyl ether의 탈알킬화로 인해 생성된 상대 발광 강도를 나타냅니다.예시에서는 TCDD 유도가 없는 경우 효소 활성이 나타나지 않음을 보여줍니다. TCDD 유도 후에는 간세포와 호흡기 세포 유형 모두에서 CYP1A1, CYP1B1 활성이 관찰됩니다. 마지막으로, CYP1A1, CYP1B1 억제제인 alpha-naphthoflavone을 첨가하면 CYP 활성이 감소하거나 제거됩니다.간 및 기도 세포 유형에서 CYP2A6, 2A13 활성을 평가하기 위해, 효소에 의한 쿠마린의 수산화 반응을 통해 생성된 7-hydroxycoumarin의 양을 UPLC LC-MS를 사용하여 측정하였습니다. 쿠마린과 함께 0분 동안 배양했을 때는 배경 신호만 검출되었습니다. 16시간 후, 두 세포 유형 모두에서 쿠마린의 수산화 반응이 일어나 7-hydroxycoumarin이 형성되는 것이 관찰되었습니다.마지막으로, CYP2A, 2A13 억제제를 첨가하여 7-hydroxycoumarin의 형성을 방지합니다. 이 기술의 프로브 배양 및 정량화 단계에 숙달되면, 대부분의 경우 몇 시간에서 최대 하루 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 다양한 세포 유형을 사용하여 여러 가지 1상 대사 분석을 수행하는 방법과, 필요에 따라 억제 및/또는 유도를 통해 효소의 특이성을 확인하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차를 수행할 때, 세포 유형에 따라 배양 시간이 더 길어질 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요하며, 양성 대조군으로 사용할 수 있는 세포 유형을 반드시 포함해야 합니다. TCDD를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 전체 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 이 기술의 응용 분야는 신약의 전임상 평가를 위한 적절한 in vitro 모델 사용과 소비자 제품에 사용되는 화학 물질 및 성분의 위해성 평가까지 확장됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

우리는 빠른 시내 현장 샘플링의 높은 정밀도와 최소한의 침공에 신진 대사 활동의 스냅샷의 화학 특성을 촉진 하기 위하여 모 세관 기반 마이크로-샘플링를 사용 하 여 개별 셀의 작은 부분을 사용할 수 있는 단계를 설명 배아를 사용자 단일 셀 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 플랫폼을 사용 하 여 라이브.

단일 셀 대사체학 라이브 개구리 (Xenopus laevis) 배아에 대 한 현미경 모 세관 전기 이동 법 질량 분석

선물이 산소 소비와 초파리 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌에 있는 세포 외 산성화를 측정 하기 위한 프로토콜. 신진 대사 분석기는 적응 하 고 최적화 된 프로토콜 활용 됩니다. 마이크로 조직 억제는이 프로토콜의 중요 한 구성 요소 설계 하 고이 분석에 그들의 사용을 위해 특히 창조 되었다.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

통합 셀 조작 플랫폼은 주변 조건하에서 개별 현탁액 셀의 온라인 분석을 위한 단일 프로브 질량 분석 설정과 함께 사용하기 위해 개발되었습니다.

단일 현탁액 세포에서 약물 및 대사 산물의 질량 분석 분석을 위한 단일 프로브와 결합된 통합 셀 조작 플랫폼

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역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

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단일 세포 질량 분석법 대사체학 연구를 위한 시료 전처리: 결합된 세포 세척, 담금질, 건조 및 보관

쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

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