질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을

본 실험 과정의 목적은 배양 세포 내 시토크롬 P450(cytochrome P450s, CYPs)의 활성을 측정하는 것입니다. CYP는 약물 및 독성 물질의 대사에 관여하는 핵심 효소이며, in vitro 상태에서는 그 발현이 유지되지 않는 경우가 많습니다. 세포를 in vitro에서 배양할 때 CYP 효소의 정상적인 발현이 소실되는 경우가 빈번합니다.

따라서 많은 in vitro 모델은 의약품 및 독성 물질의 대사를 이해하는 데 있어 관련성 측면에서 잠재적인 한계가 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 배양 세포 내 CYP 활성을 평가할 때 단순하다는 점입니다. 프로브 기질과 억제제를 사용하여 질량 분석법을 포함한 다양한 정량 플랫폼이 제시됩니다.

먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포가 담긴 냉동 보관 튜브를 준비합니다. 제공된 프로토콜은 간 세포주를 예시로 사용합니다. 멸균 상태에서 냉동 보관 튜브를 조심스럽게 열어 과도한 압력을 제거한 다음, 튜브의 내용물을 37 °C로 예열된 Williams'E 배지 9 mL가 채워진 10 mL 튜브에 피펫으로 옮깁니다.

용액을 상온에서 400 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 37 °C로 미리 데우고 글루타민을 첨가한 5 mL의 전용 해동 배지에 세포를 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 생존 세포 수를 측정한 후, 웰당 60,000개의 생존 세포 밀도로 콜라겐 코팅된 24웰 플레이트에 세포를 분주하고, 최종 부피가 해동 배지 0.5 mL가 되도록 합니다.

며칠간 배양하면 세포는 아합류(subconfluent) 소주 구조를 형성합니다. 최적의 대사 활성은 일반적으로 7일에서 10일 사이에 관찰되며, 4일째에 가장 낮습니다. 분화된 기도 상피 배양물을 준비하려면, 인서트 위에서 기액 계면(air-liquid interface) 방식으로 성장시킨 시판용 완전 분화 일차 기도 상피 세포를 사용하십시오.

멸균 핀셋을 사용하여 아가로스 매트릭스에서 세포 인서트를 조심스럽게 분리한 후, 700 µL의 전용 배양이 담긴 새 플레이트로 옮깁니다. 경상피 전기저항(transepithelial resistance) 또는 섬모 박동 주파수(cilia beat frequency)와 같이 텍스트 프로토콜에 언급된 방법을 사용하여 기도 조직의 무결성을 평가합니다. 실험 전에 기도 세포용 세포 인서트와 간 세포용 웰을 각각 최소 3회 반복 실험이 가능하도록 두 세트씩 준비합니다.

한 세트는 억제 실험에 사용하고, 다른 한 세트는 대사 프로브 전용으로 사용하십시오. 세 번째 세포 세트는 배지 공시료 대조군으로 준비하십시오. 실험 당일에 세포 배양액을 450 µL의 신선한 배지로 교체하십시오.

10x CYP 억제제가 포함된 배지 50 µL를 억제 실험을 위해 준비된 일련의 세포에 첨가하고 30분 동안 사전 배양합니다. 다음으로, 억제 실험군 세포의 배지를 신선한 배지 450 µL로 교체하고, 10x CYP 억제제와 10x 프로브 기질이 모두 포함된 배지 50 µL를 첨가합니다. 나머지 세포에는 10x 프로브 기질이 포함된 배지 50 µL를 첨가하며, 공시료 세포 대조군에는 배지로 희석한 동일 양의 용매(vehicle)를 첨가합니다.

시점 1(0분 배경 대조군)을 위해 세포를 0분에서 5분 동안 배양한 후, 배지를 각각 라벨이 부착된 튜브에 수집하여 추후 처리를 위해 냉동 보관하십시오. 그런 다음 시점 2의 세포를 세포 배양기에서 16시간 동안 배양하십시오. 배양 기간이 끝나면, 동일한 방법으로 배지를 수집하여 대사 산물을 정량하십시오.

배양 배지 250 microliters를 1.5 milliliter 마이크로튜브로 옮기고, 4-methylumbelliferone 내부 표준물질 스톡 용액을 추가하여 최종 농도가 100 nanomolar가 되게 합니다. 1 molar HCl을 1 microliter씩 추가하여 배지의 pH를 4.5에서 5.0 사이로 조정합니다. 배지 2~10 microliters를 pH 스트립에 피펫팅하여 pH를 확인한 후, Helix pamatia 유래 betaglucuronidase arylsulfatase 150 units를 첨가합니다.

37°C에서 1시간 동안 배양한 후, 250 µL의 차가운 메탄올을 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 45°C의 진공 원심분리기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. 500 µL의 30% 아세토니트릴 수용액으로 시료를 재구성합니다.

질량 분석 기반 정량을 수행하려면, 각 계열 희석 표준물질 250 microliters를 UPLC-MS 오토샘플러 주입용 갈색 초고성능 액체 크로마토그래피 유리 바이알에 첨가합니다. 또한 테스트 샘플을 갈색 UPLC 바이알에 넣고 UPLC 오토샘플러에 배치합니다. 모든 바이알을 무작위로 배열한 후, 정량하려는 특정 프로브에 따라 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 설정으로 UPLC-MS를 실행합니다.

질량 분석기 정량 도구의 Quantitate, Build Quantitation Method 도구를 사용하여 획득한 합성 표준물질과 내부 표준물질로부터 검량선을 생성한 다음, Quantitation Wizard를 사용하여 정량할 샘플 배치와 샘플을 선택하고 정량법을 실행하십시오. CYP1A1, CYP1B1을 유도하려면 텍스트 프로토콜에 있는 플레이트 레이아웃을 사용하십시오. 유도용으로 지정된 세포를 최종 농도 10 nanomolar TCDD가 포함된 배지에서 72시간 동안 배양하십시오.

이 기간이 지난 후, 배지를 제거하고 웰을 PBS로 3회 헹군 다음, 신선한 배지를 추가합니다. 루미노제닉 리포터 프로브와 함께 세포를 배양하기 전, 유도된 세포의 지정된 하위 집단을 배지 내의 CYP1A1, CYP1B1 억제제와 함께 30분 동안 사전 배양합니다. 비유도 세포, 유도 세포 및 억제제가 추가된 유도 세포에 루미노제닉 프로브인 luciferin 6'chloroethyl ether를 최종 농도 50 micromolar로 첨가합니다.

4시간 동안 배양한 후, 배양액 25 µL를 흰색 불투명 96-well 플레이트로 옮기고 제조사에서 제공한 루시페린 검출 시약 25 µL를 첨가합니다. 상온에서 20분 동안 배양한 후, 루미노미터를 사용하여 즉시 플레이트를 측정합니다. 여기서는 CYP1A1, CYP1B1에 의해 촉매되는 luciferin 6'chloroethyl ether의 탈알킬화로 인해 생성된 상대 발광 강도를 나타냅니다.

예시에서는 TCDD 유도가 없는 경우 효소 활성이 나타나지 않음을 보여줍니다. TCDD 유도 후에는 간세포와 호흡기 세포 유형 모두에서 CYP1A1, CYP1B1 활성이 관찰됩니다. 마지막으로, CYP1A1, CYP1B1 억제제인 alpha-naphthoflavone을 첨가하면 CYP 활성이 감소하거나 제거됩니다.

간 및 기도 세포 유형에서 CYP2A6, 2A13 활성을 평가하기 위해, 효소에 의한 쿠마린의 수산화 반응을 통해 생성된 7-hydroxycoumarin의 양을 UPLC LC-MS를 사용하여 측정하였습니다. 쿠마린과 함께 0분 동안 배양했을 때는 배경 신호만 검출되었습니다. 16시간 후, 두 세포 유형 모두에서 쿠마린의 수산화 반응이 일어나 7-hydroxycoumarin이 형성되는 것이 관찰되었습니다.

마지막으로, CYP2A, 2A13 억제제를 첨가하여 7-hydroxycoumarin의 형성을 방지합니다. 이 기술의 프로브 배양 및 정량화 단계에 숙달되면, 대부분의 경우 몇 시간에서 최대 하루 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 다양한 세포 유형을 사용하여 여러 가지 1상 대사 분석을 수행하는 방법과, 필요에 따라 억제 및/또는 유도를 통해 효소의 특이성을 확인하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 수행할 때, 세포 유형에 따라 배양 시간이 더 길어질 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요하며, 양성 대조군으로 사용할 수 있는 세포 유형을 반드시 포함해야 합니다. TCDD를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 전체 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 이 기술의 응용 분야는 신약의 전임상 평가를 위한 적절한 in vitro 모델 사용과 소비자 제품에 사용되는 화학 물질 및 성분의 위해성 평가까지 확장됩니다.