정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출
June 27th, 2017
여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 쥐 복막에서 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 4% 이소플루란으로 흡입 마취 후. 쥐의 복부 피부에 70 % 에탄올을 뿌리고 코르크 시트에 장착하십시오.
그런 다음 가위와 집게를 사용하여 동물의 복부 피부, 근육 및 복막을 세로로 절개합니다. 겸자를 사용하여 복막을 들어 올리고 횡격막 아래의 가장 낮은 갈비뼈를 따라 위쪽 부분을 수평으로 절개합니다. 그리고 수술 용 가위를 사용하여 측면 영역의 아래쪽에.
그런 다음 수술 용 가위를 사용하여 몸에서 복막을 제거하기 위해 측면 세로 절개를 만듭니다. 그런 다음 페트리 접시에 PPS로 씻으십시오. 20mg의 복막막 샘플을 잘라내고 다듬습니다.
이 절차에서는 20mg의 복막시료를 유리 균질기에 넣습니다. 그리고 700 마이크로 리터의 페놀 구아니딘 기반 용해 시약을 첨가하십시오. 그 후, 얼음 위에서 복막막 샘플을 균질화하고 유봉을 비틀어 샘플에 천천히 눌러 넣습니다.
복막막 샘플이 페놀 구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해될 때까지 이 과정을 수십 번 반복합니다. 추가 균질화를 위해 균질화된 용해물을 2mL 수집 튜브의 마이크로 원심분리기 스핀 컬럼에 있는 바이오 폴리머 파쇄 시스템으로 옮깁니다. 다음 14, 000 시간 G에 4 섭씨 온도에 3 분 동안 그것을 원심분리하십시오.
다음으로, 균질화된 용해물을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 균질화된 용해물에 140마이크로리터의 클로로포름을 추가하고 튜브를 단단히 닫습니다. 그런 다음 15초 동안 반전으로 튜브를 혼합합니다.
그 후, 실온에서 2-3분 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000회 G로 원심분리하십시오. 침전제를 방해하지 않고 300마이크로리터의 상층액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
그리고 100% 에탄올 450마이크로리터를 첨가합니다. 그런 다음 5초 동안 볼텍싱하여 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 최대 700마이크로리터의 시료를 2밀리리터 수집 튜브에 넣은 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 캡을 닫습니다.
다음 15, 15 초 동안 000 시간 G에 그것을 원심분리하십시오. 원심분리 후 수집 튜브에서 흐름을 폐기합니다. 그런 다음 700마이크로리터의 세척 버퍼 1을 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 추가하여 샘플을 엄격하게 세척하고 캡을 닫습니다.
15, 000 번 G에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심분리 후 수집 튜브에서 흐름을 폐기합니다. 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 500마이크로리터의 세척 버퍼 2를 추가하여 염분의 흔적을 제거하고 캡을 닫습니다.
다음 15, 15 초 동안 000 시간 G에 그것을 원심분리하십시오. 원심분리 후 플로우 스루와 수집 튜브를 버리고 이 절차를 다시 반복합니다. 다음으로, 실리카막 기반 스핀 컬럼을 다시 15, 000회 G로 1분 동안 원심분리한다.
원심분리 후 수집 튜브와 모든 흐름을 폐기하십시오. 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 새로운 1포인트 5밀리리터 수집 튜브에 넣습니다. 그런 다음 25마이크로리터의 RNase free water를 컬럼으로 옮기고 캡을 닫습니다.
샘플을 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다. 15, 000 번 G에서 1 분 동안 원심 분리하십시오. 그런 다음 총 RNA가 들어있는 25 마이크로 리터 알루엣을 새로운 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 사용하기 전에 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
이 절차에서는 2마이크로리터의 10x 핵산 혼합물, 2마이크로리터의 역전사 효소 혼합물 및 4마이크로리터의 5x Hispec 완충액을 포함하는 튜브당 총 8마이크로리터의 마스터 믹스 용액을 준비합니다. 그런 다음 8마이크로리터의 마스터 믹스 용액을 각 튜브에 분배합니다. 분광광도계를 사용하여 전체 RNA의 양을 측정합니다.
그 후, 복막막 샘플에서 정제된 분리된 총 RNA 1마이크로그램을 각 튜브에 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 RNase free water를 추가하여 총 20마이크로리터가 됩니다. 그런 다음 피펫팅으로 철저히 혼합하고 15초 동안 원심분리합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 60분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 섭씨 95도에서 5분 동안 배양합니다. 새로 생성된 cDNA를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 RNase free water로 10회 희석합니다.
이 절차에서는 각 웰에 대해 12포인트 5마이크로리터의 2x PCR 마스터 믹스, 뉴클레아제가 없는 물에 용해된 각 miRNA 프라이머의 5마이크로몰 2포인트 5마이크로리터, 10x 범용 프라이머 1포인트 25마이크로리터를 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 이 마스터 믹스의 22포인트 5마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 그런 다음 각 웰에 2포인트 5마이크로리터의 템플릿 cDNA를 추가합니다.
96웰 반응판을 필름 조각으로 밀봉합니다. 다음 1, 30 초 동안 000 번 G에 그것을 원심분리하십시오. PCR 사이클링 프로그램을 실행하려면 실시간 PCR 기기에 플레이트를 설정하십시오.
실시간 PCR 소프트웨어에서 실험 특성을 정의합니다. 다음으로, 샘플에 이름을 할당하고 각 웰에서 miRNA를 표적화합니다. 그런 다음 실시간 PCR 소프트웨어는 지침에 따라 20 마이크로 리터의 반응 부피와 다음과 같은 PCR 사이클링 조건을 입력합니다.
섭씨 95도에서 15분 동안 사전 배양합니다. 그런 다음 섭씨 94도에서 15초 동안 변성 40주기, 섭씨 55도에서 30초 동안 무릎 꿇기, 30초 동안 섭씨 70도에서 연장. miRNA, 마이크로 어레이 스크리닝을 기반으로 6개의 miRNA의 수준은 이 원고에 제시된 프로토콜에 따라 QRTCPR을 사용하여 모의 쥐 및 대조 쥐의 복막에 비해 복막 섬유증 쥐의 복막에서 유의하게 증가한 것으로 밝혀졌습니다.
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개요
이 프로토콜은 정량적 실시간 역전사-중합효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 마이크로RNA 발현을 검출하는 방법을 설명합니다. 다양한 병리학적 조건에서 마이크로RNA 발현 프로파일을 연구하기 위해 설계되었습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 마이크로RNA 연구
배경
- 마이크로RNA는 유전자 조절에서 중요한 역할을 합니다.
- 병리학적 조건에서의 발현을 이해하는 것이 중요합니다.
- 쥐 복막은 이러한 발현을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다.
- 정량적 실시간 PCR은 검출을 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다.
연구 목적
- 쥐 복막에서 miRNA를 정제하고 검출합니다.
- 다양한 조건에서 마이크로RNA 발현 프로파일을 분석합니다.
- 해당 분야의 연구자들에게 상세한 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 4% 이소플루란을 사용한 흡입 마취.
- 복부 부위의 70% 에탄올로 준비.
- 복막에 접근하기 위한 외과적 절개.
- 멤브레인 추출을 위한 가위와 포셉 사용.
주요 결과
- 복막에서 miRNA를 성공적으로 정제했습니다.
- 마이크로RNA 발현의 정량적 검출을 달성했습니다.
- 다양한 병리학적 연구에 사용할 수 있는 프로토콜이 검증되었습니다.
- 질병 메커니즘 이해에 잠재적 적용 가능성이 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 쥐 모델에서 마이크로RNA를 연구하는 데 효과적입니다.
- 병리학에서 마이크로RNA의 역할에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 미래 연구는 이 방법론을 바탕으로 더 광범위한 적용을 위해 연구를 진행할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR-based detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane enables precise interrogation of gene regulation in disease-relevant tissue models. This workflow supports early discovery teams seeking to validate mechanistic hypotheses and identify translational biomarkers in fibrotic and inflammatory pathologies. Reliable miRNA quantification in preclinical models enhances predictive confidence and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of miRNA-mediated regulatory pathways in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying miRNA changes in response to pathological stimuli.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of miRNA expression between control and disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for miRNA extraction and quantification from tissue samples.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream screening and assay development.
- Establishes assay readiness for evaluating compound effects on miRNA expression profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA expression data with disease-relevant preclinical models for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting mechanistic studies in vivo.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative molecular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical biomarker validation, supporting both hypothesis testing and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative miRNA profiling clarifies regulatory pathways and supports hypothesis-driven research.
- Screening: Standardized qRT-PCR outputs enable reproducible comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides robust quantitative measurements for statistical analysis of miRNA expression changes.
- Translational Research: Connects molecular findings in animal models to potential clinical biomarkers.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for diverse tissue types and disease models, supporting broad R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable miRNA quantification workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and translational biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, RNA handling, and qRT-PCR analysis.
- Needs access to real-time PCR instrumentation and validated reagents.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptation may be necessary for different tissue types or disease models.
- Sample quality and RNA integrity are critical for reliable quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Peritoneum Sample Collection
8:29
Conclusion
8:06
Results: Upregulated miRNAs in the Peritoneal Membrane of Peritoneal Fibrosis Rats
1:54
Purifying Total RNAs from Peritoneal Membrane Samples
5:36
Reverse Transcription of Total RNA
6:44
qRT-PCR of miRNA
