Name: 정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출 방법을. 이 프로토콜은 병리학적 조건에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는 데 활용됩니다.

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그녀의 우수한 기술 지원에 대해 Miyako Shigeta에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가켄 (교부 번호 25461252)에 의해 부분적으로 지원되었다.

모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 얻었으며 Jichi Medical University Laboratory Animals 안내서의 Experimental Animals Use and Care of Animals 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 복막 샘플 수집 <ol><li> 다음 품목을 수집하십시오 : isoflurane, 코르크 시트, 인산염 완충 식염수 (PBS), 수술 가위 및 포 셉과 페트리 접시에 흠뻑 목화와 50 ML 원심 분리기 튜브. </li><li> Isofluorane의 과다 복용으로 쥐를 안락사시키고, 70 % 에탄올로 쥐의 복부 피부를 스프레이하고, 뒤에 코르크 시트에 쥐를 탑재. </li><li> 가위와 포셉을 사용하여 복부 피부, 근육 및 복막에 세로 절개를하십시오. </li><li> 포 셉를 사용하여 복막을 집어 들고, 다이어프램 아래의 가장 낮은 늑골을 따라 그 상단 부분에 수평 절개를하고,외과 용 가위를 사용하여 옆쪽 영역에있는 오우리어 쪽. 다음으로 외과 용 가위를 사용하여 몸에서 복막을 제거하기 위해 세로로 절개하십시오. 그런 다음 페트리 접시에 PBS로 씻으십시오. </li><li> 외과 용 가위 및 집게를 사용하여 다음 단계에 적합한 크기 인 복막 막 샘플 20mg (3 ~ 5mm 2 )을 잘라내어 다듬습니다. </li></ol> 2. 복막 막 샘플로부터 전체 RNA 정제 참고 : 여기에 무게가 20mg 인 복막 샘플을 유리 호 모지 나이저 및 미세 원심 분리기 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하여 균질화합니다. 그런 다음 복막 막 샘플의 총 RNA를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 사용하여 분리합니다. <ol><li> 다음 항목을 수집하십시오 : 1.5 또는 2.0 ML microcentrifuge 튜브, 100 % 에탄올, 클로로포름, 유리 호 모지 나이저, 얼음, biopolymer - microcentrifuge 스핀 열 10 에서 시스템을 분쇄 </s( 10) , 페놀 / 구아니딘 계 용해제, 구아니딘과 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 1), 에탄올을 포함한 세척 완충액 (세척 완충액 2)을 포함한다. </li><li> 유리 호 모지 나이저에 20 MG 복막 샘플을 넣고 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약 700 μL를 추가합니다. </li><li> 뒤틀린 상태에서 유봉을 천천히 눌러 시료를 균질화하십시오. 복막 막 샘플이 페놀 / 구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 얼음 위에서이 과정을 수십 번 반복합니다. </li><li> 추가 균질, 2.0 ML 수집 튜브에 microcentrifuge 스핀 칼럼에 biopolymer - 파쇄 시스템에 균질 lysate을 전송합니다. 그런 다음 14,000 xg에서 4 분간 3 분간 원심 분리하십시오. </li><li> Homogenized lysate를 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮긴다. </li><li> 균질화 lysate에 클로로포름 140 μL를 추가하고 욕조를 모자안전하게. 그런 다음 튜브를 15 초 동안 뒤집어서 혼합하십시오. </li><li> 실온에서 2-3 분 동안 샘플을 품어 낸다. 그런 다음 12,000 xg에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하십시오. </li><li> 침전물을 방해하지 않고 상등액 (일반적으로 300 μL)을 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮기고 100 배 에탄올의 1.5 배량 (일반적으로 450 μL)을 첨가하십시오. 그런 다음 5 초 동안 볼 텍싱하여 샘플을 섞으십시오. </li><li> 시료 700 μL를 2.0 mL 수집 튜브에 놓여있는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣으십시오. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 엄격하게 샘플을 씻어 실리카 막 기반 스핀 칼럼에 세척 버퍼 1 700 μL를 추가합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 실리카 멤에 세척 버퍼 2 500 μL를 추가하십시오rane 기반의 스핀 컬럼으로 소금의 흔적을 제거합니다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 15 초 동안 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 2.11을 반복하십시오. </li><li> 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 15,000 xg에서 1 분간 다시 원심 분리하십시오. 원심 분리 후 수집 튜브의 유액을 버립니다. </li><li> 새로운 1.5 ML 수집 튜브에 실리카 멤브레인 기반 스핀 칼럼을 놓습니다. 그런 다음 RNase가없는 물 25 μL를 컬럼으로 옮긴다. 컬럼의 캡을 닫으십시오. 샘플을 실온에서 5 분 동안 방치하십시오. 그런 다음 15,000 xg에서 1 분간 원심 분리합니다. </li><li> 총 RNA가 포함 된 25 μL 용리액을 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기십시오. 그런 다음 사용하기 전에 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 3. 총 RNA의 역전사 참고 : 정량 실시간 PCR 실험의 출판을위한 최소 정보에 대한 참고 및 준수iments (MIQE) 지침은 더 나은 실습을 장려하고 신뢰성 있고 명확한 결과를 얻는 데 도움이됩니다. 참고 : 여기서 역전사 효소, poly (A) polymerase 및 oligo-dT primer를 사용하여 총 1.0 μg의 분리 된 RNA를 역전 사합니다. <ol><li> 다음 품목을 수집하십시오 : 1.5 mL microcentrifuge tubes; 8- 웰 스트립 튜브; RNase없는 물; 얼음; 역전사 효소 키트 (물질 표 참조) 11 . </li><li> 2.0 μL의 10x 핵산 믹스, 2.0 μL의 역전사 효소 믹스 (키트에서), 4.0 μL의 5x hi-spec 버퍼를 포함하는 마스터 믹스 용액을 튜브 당 총 8.0 μL로 준비하십시오. </li><li> 마스터 믹스 용액 (키트에서) 8.0 μL를 각 튜브에 분배합니다. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 전체 RNA 양을 측정하십시오. 복막 막 샘플에서 정제 된 분리 된 총 RNA 1.0 μg을 각 튜브에 첨가합니다. 참고 : qRT-PCR은 미국에서 수행 할 수 있습니다.정화 된 총 RNA의 품질 관리를 위해 역전사없이 전체 RNA를 주형으로 사용합니다. DNA가 오염되면 qRT-PCR에 의해 예상치 못한 증폭 산물이 관찰됩니다. </li><li> 총 20 μL까지 각 튜브에 RNase가없는 물을 첨가하십시오. 그런 다음 피펫 팅으로 철저히 혼합하고 15 초 동안 원심 분리하십시오. </li><li> 37 ° C에서 60 분 동안 견본을 품어 라. 95 ° C에서 5 분간 즉시 품어 라. 참고 :이 단계는 열 순환 장치에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> cDNA를 새로운 미세 원심 분리 튜브에 옮기고 RNase가없는 물로 10 배 희석하십시오 (1:10). </li><li> 희석 된 cDNA를 얼음에 일시적으로 보관하고 사용하기 전에 장기간 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 4. miRNA의 qRT-PCR 참고 : miRNA의 qRT-PCR은 인터 칼 레이팅 염료를 사용하여 수행됩니다. 여기에는 RNA, U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p 프라이머 사용 된. <ol><li>다음 항목을 수집 : 1.5 ML microcentrifuge 튜브, qRT - PCR, 96 - 웰 반응 플레이트에 대한 접착 필름, miRNA 특정 primers, 녹색 염료 기반의 PCR 키트 (자료 테이블을 참조하십시오) 11 에 대한 96 잘 반응 플레이트, 그리고 실시간 PCR 기기. </li><li> 2x PCR 마스터 믹스 12.5 μL, nuclease-free 물에 용해 된 5 μM 각 miRNA 프라이머 2.5 μL 및 각 웰에 대한 10 배 범용 프라이머 1.25 μL가 들어있는 마스터 믹스를 준비하십시오. </li><li> 96- 웰 플레이트의 각 웰에 22.5 μL의 마스터 믹스를 분배합니다. </li><li> 각 우물에 2.5 μL의 template cDNA를 첨가한다. </li><li> 96- 웰 반응 플레이트 용 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 그런 다음 플레이트를 1,000 xg에서 30 초간 원심 분리하십시오. </li><li> 다음과 같이 실시간 PCR Instrument 및 소프트웨어로 PCR cycling 프로그램을 실행하십시오. <ol><li> 실시간 PCR 장비에 플레이트를 놓습니다. 실시간 PCR 소프트웨어에서 실험적 속성을 정의합니다 (실험적으로 입력이름, 악기의 실험 유형에 대한 &quot;96 - 우물&quot;을 선택, &quot;SYBR 녹색 시약&quot;대상 시퀀스를 감지하는 &quot;SYBR 녹색 시약&quot;을 선택 &quot;2 - ΔΔCT 방법&quot;을 선택하고, &quot;표준 램프 속도&quot;를 선택하십시오 악기 실행). </li><li> 그런 다음 샘플에 이름을 지정하고 각 웰에서 miRNA를 표적으로 삼습니다. 샘플은 항상 결과 검증을위한 충분한 데이터를 얻기 위해 중복 또는 3 중으로 테스트됩니다. 표준 시료와 내인성 대조군을 선택하십시오. 염료가 수동 기준으로 사용하려면 &quot;없음&quot;을 선택하십시오. </li><li> 지시에 따라 실시간 PCR 소프트웨어에 &quot;20 μL&quot;의 반응 부피와 다음의 PCR 사이클링 조건을 입력하십시오 : 95 ° C에서 15 분 동안 프리 인큐베이션 한 다음 94 ° C에서 15 초 동안 변성 55 ° C에서 30 초, 어닐링은 70 ° C에서 30 초 동안 수행 하였다. </li></ol></li><li> qRT-PCR 데이터 분석 u실시간 PCR 장비의 소프트웨어를 부릅니다. 소프트웨어에 의해 자동으로 결정되는 임계 값과 기준선이 각 우물에서 적절한 지 확인하십시오. </li><li> 각 표본에서 표적 miRNA의 임계주기를 확인하십시오. 임계주기는 증폭 곡선과 임계 선 사이의 교차점입니다. 그런 다음, 내인성 대조군으로서 RNU6-2에 대한 표적 miRNA의 발현 수준을 표준화하고, 2 - ΔΔCT 방법 13을 사용하여 표적 miRNA의 상대 발현 수준을 계산한다. 참고 : 내인성 대조 miRNA의 발현 수준의 안정성을 확인해야합니다. 이 실험에서, RNU6-2는 높은 수준에서 각 그룹에 걸쳐 상대적으로 변하지 않는 것으로 확인되었다. </li></ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여, qRT-PCR을 사용하여 쥐 복막의 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출 하였다. qRT-PCR 데이터 분석의 신뢰성은 정제 된 miRNA의 품질에 달려 있습니다. 따라서 miRNA의 순도는 분광 광도계를 사용하여 측정 할 수있는 280 nm에서의 흡광도 대 260 nm에서의 흡광도의 비율로 qRT-PCR 전에 확인할 수 있습니다. qRT-PCR을 사용하여 miRNA가 현저히 증폭되지 않으면 주형 cDNA의 농도가 증가 할 수 있습니다. 각 miRNA 특이 적 프라이머의 농도 또한 증가 될 수 있습니다. microarray, Northern blotting 및 ribonuclease protection assay를 포함하여 miRNA 발현 수준을 결정하는 몇 가지 대체 방법이 있습니다. qRT-PCR은 노던 블 롯팅 또는 리보 뉴 클레아 제 보호 분석과 비교하여 최소량의 샘플을 필요로하는 민감하고 높은 처리량의 절차입니다. Microar...

MicroRNAs (miRNAs)는 전 사적으로 mRNA (messenger RNA) 발현을 조절하는 짧은 비 암호화 RNA입니다. miRNA의 발현 변화는 암, 염증, 대사 장애 및 섬유증 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8을 비롯한 다양한 병리학 적 조건에서 중추적 인 역할을하는 많은 mRNA의 발현을 조절합니다. 따라서 miRNA는 새로운 바이오 마커 및 치료 표적 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 로 잠재력이 있습니다. miRNA 발현 프로파일은 다양한 래트에서 결정되었다간, 심장, 폐 및 신장을 포함한 장기 및 조직 9 . 그러나, 랫 복막에서 miRNA의 정제 및 검출에 대한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 이 프로토콜의 전체 목표는 성공적으로 쥐의 복막에 miRNAs을 정화하고 감지하는 것입니다. 먼저, 유리 호 모지 나이저를 사용하여 복막 막 샘플을 균질화시킨 다음, 미세 원심 분리기 스핀 컬럼 10 에서 생체 고분자 파쇄 시스템에 노출시켰다. 다음으로, 실리카 막 기반 스핀 컬럼 10을 이용하여 복막 샘플로부터 miRNA를 포함한 total RNA를 정제 하였다. 이어서 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머 11을 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. 마지막으로, 삽입 염료 11을 사용하여 qRT-PCR에 의해 miRNA의 발현을 측정 하였다. 이 프로토콜의 이론적 근거는 b이전 연구에서 단순한 과정으로 조직에서 miRNA의 유의 한 정화 및 검출을 보여주었습니다 8 , 10 , 11 . 미세 원심 분리기 스핀 컬럼과 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하면 조직에서 고품질의 총 RNA를 정제 할 수 있다고보고되었습니다. 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하는 방법 및이 프로토콜에서 인터 칼 레이팅 염료를 사용하는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현을 검출하는 방법이 높은 정확성을 보인 것으로보고되었다. 감도 11 . 또한이 작업은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스입니다. 따라서이 프로토콜은 광범위한 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 miRNA의 매우 정확하고 민감한 검출을 필요로하는 연구에 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>QIA 파쇄기</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>마이크로 원심분리기 스핀 컬럼의 바이오폴리머 파쇄 시스템</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>217004 실리카막 기반 스핀 컬럼</td></tr><tr><td>QIAzol 용해 시약</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>페놀/구아니딘 기반 용해 시약 Buffer</td></tr><tr><td>RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>세척 버퍼 1</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>세척 버퍼 2</td></tr><tr><td>miScript II RT 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>218161</td>에는 <td>10회가 포함됩니다. 데옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 삼인산 및 올리고-dT 프라이머를 함유하는 핵 혼합물; miScript 역전사효소 폴리(A) 중합효소 및 역전사효소를 함유하는 혼합물 및; miScript HiSpec 버퍼</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>218073</td>에는 <td>QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix와 miScript Universal Primer</td></tr><tr><td>RNU6-2 프라이머가 포함되어 있습니다. &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>공개되지 않음</td></tr><tr><td>miRNA-142-3p 프라이머</td><td>Qiagen</td><td>MS00031451</td><td>5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>miRNA-21-5p 프라이머</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p</td></tr> <tr><td>프라이머</td><td>Qiagen</td><td>MS00003857</td><td>5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p</td></tr> <tr><td>프라이머</td><td>Qiagen</td><td>MS00033320</td><td>5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p</td></tr> <tr><td>프라이머</td><td>Qiagen</td><td>MS00003318</td><td>5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUGUGU-3'miRNA-327</td></tr> <tr><td>프라이머</td><td>Qiagen</td><td>MS00000805</td><td>5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'MicroAmp</td></tr> <tr><td>Optical 96 웰 반응 플레이트 for qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-웰 반응 플레이트</td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>4311971 96웰 반응 플레이트용 접착 필름</td></tr>, <tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR 시스템</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Real-Time PCR 기기</td></tr><tr><td>, QuantStudio 12K Flex 소프트웨어 버전 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>real-time PCR 기기 소프트웨어</td></tr><tr><td>methylglyoxal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0252</td><td></td></tr><tr><td>Midperic</td><td>Terumo</td><td>양도하지 않음&nbsp;</td><td>복막투석액</td></tr><tr><td>스프래그&ndash; 돌리는</td><td>SLC</td>를 <td>할당하지 않습니다&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

정량 실시간 pcr을 이용한 쥐 복막 막의 microrna 발현 검출

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs)는 전사 후 사슬 RNA 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA입니다. miRNA 발현 프로파일은 쥐의 다양한 기관과 조직에서 조사되었습니다. 그러나, miRNA의 정제 및 쥐 복막에서의 발현 검출을위한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 우리는 랫트 복막에서 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 이용하여 miRNA를 정제하고 정량화하는 효과적이고 신뢰성있는 방법을 개발했다. 이 프로토콜은 4 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 복막 샘플의 정화; 2) 복막 막 시료로부터의 miRNA를 포함하는 전체 RNA의 정제; 3) cDNA를 생산하기위한 miRNA의 역전사; 및 4) miRNA 발현을 검출하기위한 qRT-PCR. 이 프로토콜을 사용하여 6 개의 miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p)의 발현이 증가한 것을 성공적으로 확인했습니다.쥐 복막 섬유증 모델의 복막이 대조군에 비해 유의하게 높았다. 이 프로토콜은 많은 병리학 조건에서 쥐의 복막에서 miRNA 표현의 프로필을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 결과는 이전에보고 된 연구 8 에 근거합니다. 우리는 복막 섬유증에서 miRNA 발현 프로파일을 조사했다. 복막 섬유증은 복막 투석의 주요 합병증입니다. 그것은 mesothelial 세포 monolayer의 손실과 extracellular 매트릭스 구성 요소의 과도한 축적을 특징으로하고, 복막 막 실패 14 , 15 와 관련이 있습니다. 복막 섬유증 쥐 모델은 5 시간 동안 100 mL / kg 복막 투석액 (2.5 mM 글루코스, 100 mM NaCl, 35 mM 락트산 나트륨, 2 mM CaCl2 및 20 mM 메틸 글리 옥살 함유 0.7 mM MgCl2)의 복막 내 주사에 의해 제조되었다. 12 주령, 체중이 230-250 g 인 수컷 쥐에게 1 주일에 3 주간 3 주간 복용한다. 다음 그룹을 대조군으로...

여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

본 절차의 전체적인 목적은 쥐의 복막에서 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출하는 것입니다. 이 절차를 시작하기 위해, 4% isoflurane으로 흡입 마취를 수행합니다. 쥐의 복부 피부에 70% ethanol을 분무하고, 쥐를 등 쪽이 아래로 가도록 코르크 시트 위에 고정합니다.다음으로 가위와 포셉을 사용하여 동물의 복부 피부, 근육 및 복막에 종절개를 가합니다. 포셉으로 복막을 들어 올린 뒤, 가위로 횡격막 아래의 가장 낮은 갈비뼈를 따라 상단부에 수평 절개를 합니다. 그리고 외측 부위의 하단부에도 수술용 가위로 수평 절개를 가합니다.다음으로, 수술용 가위를 사용하여 체벽에서 복막을 제거하기 위해 측면 종절개를 실시합니다. 그 다음 페트리 접시에서 PPS로 세척합니다. 복막 샘플 20 milligrams를 절제하여 다듬습니다.이 절차에서는 20 mg의 복막 샘플을 유리 균질기에 넣습니다. 그다음 phenol guanidine 기반의 용해 시약 700 µL를 추가합니다. 그 후, 페스틀을 샘플 위로 천천히 누르면서 비틀어 얼음 위에서 복막 샘플을 균질화합니다.복막 샘플이 페놀 구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 녹을 때까지 이 과정을 수십 번 반복합니다. 추가 균질화를 위해 균질화된 용해물을 2 mL 수집 튜브 내의 마이크로 원심분리 스핀 컬럼에 있는 바이오 폴리머 분쇄 시스템으로 옮깁니다. 그다음 4 °C에서 14,000 ×g로 3분 동안 원심분리합니다.다음으로, 균질화된 용해물을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 균질화된 용해물에 140 µL의 클로로포름을 첨가하고 튜브 캡을 단단히 닫습니다. 그 후, 튜브를 15초 동안 반전 혼합합니다.그 후, 샘플을 상온에서 2~3분 동안 배양합니다. 이어서 4°C에서 12,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 침전물이 섞이지 않도록 주의하며 상층액 300 µL를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.그리고 100% ethanol 450 µL를 추가합니다. 그 다음, 볼텍싱을 통해 5초 동안 시료를 혼합합니다. 다음으로, 2 mL 컬렉션 튜브에 장착된 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 시료 700 µL까지 피펫팅하여 넣고 캡을 닫습니다.그런 다음 15,000 ×g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 컬렉션 튜브에 모인 통과액을 버립니다. 그 후 실리콘 막 기반 스핀 컬럼에 700 µL의 세척 버퍼 1을 첨가하여 시료를 엄격하게 세척하고 캡을 닫습니다.15,000 ×g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 컬렉션 튜브에 모인 통과액을 버립니다. 염분 잔여물을 제거하기 위해 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 500 µL의 wash buffer 2를 첨가하고 캡을 닫습니다.그런 다음 15,000 ×g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 통과액과 컬렉션 튜브를 버리고 이 과정을 다시 반복합니다. 다음으로, 실리카 막 기반의 스핀 컬럼을 15,000 ×g에서 1분 동안 다시 원심분리합니다.원심분리 후, 컬렉션 튜브와 통과액을 폐기하십시오. 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 컬렉션 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 RNase free water 25 µL를 컬럼에 옮기고 캡을 닫으십시오.시료를 상온에서 5분 동안 방치합니다. 15,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 후, 전체 RNA가 포함된 25 µL의 상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 사용 전까지 -80 °C에서 보관합니다.이 절차에서는 10x nucleic acid mix 2 µL, reverse transcriptase mix 2 µL, 5x Hispec buffer 4 µL를 포함하여 튜브당 총 8 µL의 마스터 믹스 용액을 준비합니다. 그런 다음 각 튜브에 마스터 믹스 용액 8 µL를 분주합니다. 분광광도계를 사용하여 총 RNA의 양을 측정합니다.그 후, 복막 샘플에서 정제하여 분리한 전체 RNA 1 µg을 각 튜브에 첨가합니다. 이어서, 각 튜브에 RNase free water를 추가하여 최종 부피를 20 µL로 맞춥니다. 그런 다음 피펫팅을 통해 충분히 혼합하고 15초 동안 원심 분리합니다.그 후, 시료를 37 °C에서 60분 동안 배양합니다. 이어서 95 °C에서 5분 동안 배양합니다. 새로 생성된 cDNA를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 RNase free water로 10배 희석합니다.본 절차에서는 웰당 12.5 µL의 2x PCR master mix, nuclease free water에 용해된 5 µM 농도의 각 miRNA primer 2.5 µL, 그리고 10x universal primer 1.25 µL를 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 이 마스터 믹스 22.5 µL를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 그런 다음 각 웰에 템플릿 cDNA 2.5 µL를 추가합니다.96웰 반응 플레이트를 필름으로 밀봉합니다. 그다음 1,000 ×g에서 30초 동안 원심분리합니다. PCR 사이클링 프로그램을 실행하기 위해 플레이트를 실시간 PCR 기기에 넣습니다.실시간 PCR 소프트웨어에서 실험 속성을 정의합니다. 다음으로, 각 웰(well)의 샘플과 표적 miRNA에 이름을 지정합니다. 그런 다음, 실시간 PCR 소프트웨어에 반응 부피 20 µL와 지침에 따른 다음의 PCR 사이클 조건을 입력합니다.95 °C에서 15분 동안 사전 배양합니다. 그 후 94 °C에서 15초간 변성, 55 °C에서 30초간 결합, 그리고 70 °C에서 30초간 신장을 총 40회 반복합니다. miRNA 마이크로어레이 스크리닝을 바탕으로, 본 원고에 제시된 프로토콜에 따라 QRT-PCR을 이용해 분석한 결과, 복막 섬유화 쥐의 복막에서 6종의 miRNA 수치가 mock 쥐 및 대조군 쥐에 비해 유의하게 증가한 것을 확인하였습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

양적 실시간 중합 효소 사슬 반응 (qPCR)는 종양 샘플에서 여러 microRNA의 표현 수준 (miRNA) 분자를 조사하기 위해 신속하고 민감한 방법입니다. 다른 miRNA 분자의 수백이 메서드 표현식을 사용하면, 증폭 계량, 같은 cDNA 템플릿에서 분석할 수 있습니다.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

Microglia은 중추 신경계의 방어 및 면역 감시의 첫번째 라인을 제공 macrophages를 거주하고 있습니다. MicroRNAs는 활성화 및 macrophages의 차별화 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을 규제 분자입니다. 이 문서에서는 microglia에서 microRNAs의 측정을위한 방법을 설명합니다.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

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순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

여기서는 쥐 복막 대식세포를 분리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 절차 다음에는 RNA 추출을 수행하여 Toll-like receptor 자극에 대한 유전자 발현 분석을 수행합니다.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

이 논문은 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 급성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 microRNA 발현을 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 허혈성 신장 손상 마우스 모델과 microRNA 샘플의 신중한 추출을 강조합니다.

허혈성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 MicroRNA에 대한 정량적 검출 방법

우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

우리는 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 연령 의존적 신장 손상이있는 마우스의 신장 및 혈청에서 microRNA 발현을 평가하는 방법을 제시합니다.

연령 의존적 신장 장애가 있는 마우스의 신장 및 혈청에서 MicroRNA 발현의 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 평가

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새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

배우세요 정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출 방법을. 이 프로토콜은 병리학적 조건에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는 데 활용됩니다.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

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