Name: Zebrafish의 시츄 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 제브라피시 척수 뉴런의 전기생리학적 기록 방법을 통해 발달 단계에서의 신경 기능을 연구하는 기법을. 이 프로토콜은 다양한 척수 뉴런 유형을 생체 내에서 연구할 수 있는 강력한 실험 도구를 제공합니다.

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이 작품은 (ABR에 RLM 및 R01NS25217 및 P30NS048154에 F32 NS059120)에 NIH 보조금에 의해 지원되었다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.

여기에 설명 된 방법은 척수의 최소 절개 후 제브라 배아 감각 뉴런과 모터의 전기적 특성과 형태 학적 허용한다. 뉴런은 적어도 1 시간이 기록에 부과 된 시간 제한에 대한 건강을 유지. 뉴런은 표준 전체 셀 구성을 사용하여 기록 된뿐만 아니라 핵 패치에서 같은; 후자의 방법은, 이온 전류 (9)의 상세한 생물 물리학 연구를 배제 할 공간 클램프 문제를 최소화한다. 중요한 도전은 피부를 제거하고 관심의 뉴런에 대한 액세스를 제공하는 데 필요한 제한 해부을 수행하기 위해 챔버에 배아 또는 유충의 확고한 첨부 파일을 달성하는 것입니다. 제조는 적절한 전체 셀 패치 - 클램프 방법을위한 기록 챔버에 고정 할 필요가있다. 수의사 봉합 접착제의 사용을 통해이 문제를 충족하는 방법은 배아 또는 유충에 첨부하기해부 / 기록 챔버, 여기서 다른 모델 유기체의 박리에 사용 된 접근법 (예를 들어 초파리) <sup class="xref"...

<html> 조지 스트라이징거 척추 동물의 개발 (10)의 유전 적 분석을위한 모델 시스템으로, 일반적으로 제브라 피쉬로 알려진 다니오 레 리오 (rerio)의 사용을 개척했다. 모델 등 여러 가지 장점을 제공한다 : (1) 상대적으로 간단하고 저렴한 축산을; (2) 체외 수정, 초기 발달 단계에서 배아에 쉽게 액세스 할 수 있도록; 및 (3) 투명 배아가 형성로서 세포, 조직 및 기관의 직접 반복 관측을 허용. 계속되는 년 동안, 여러 진보는 더 제브라 피쉬 모델의 힘을 증가했다. 특히, 앞으로 유전 화면과 전체 게놈 시퀀싱 노력이 많은 발달 과정 11, 12, 13, 14에 돌연변이 중요한 유전자의 식별에 중요한 역할을,&quot;&gt; 15, 16. 게이트웨이 클로닝 방법은 전사 활성 형 (TALENs)로 예시. 유전자의 루틴은 애플리케이션 (17), (18)에 접근 게놈 편집 최근 발전시키고 클러스터 한 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR) -Cas9 클레아, 돌연변이의 목표로 도입을 허용뿐만 아니라 노크 아웃 및 노크 인은 (22). 결합은, 이러한 방법은 제브라 피쉬의 특정 행동과 여러 인간의 질병의 기초가되는 유전 적 메커니즘 연구를위한 강력한 모델 만들기, 21, 20, 19에 접근 23, 24, 25, 26, 27. 이 작품은 개발에 초점을 맞추고정신 규제와 신경 발달에 전기 활동의 역할. 초점은 제브라 피쉬 모델은 몇 가지 장점을 제공하는 척수에있다. 첫째, 배아와 애벌레 단계에서 제브라 피쉬에 액세스하는 데 상대적으로 쉽다; 따라서, 하나는 적은 수의 뉴런과 간단한 회로 (28), (29)이 발달 단계에서 척수의 기능을 연구 할 수 있습니다. 또한, 상기 제브라 척수 전사 특성과 구분 패턴에 의해 설명 30, 31, 32, 33, 34, 35 요인으로 다른 척추 유사 신경의 다양한 세트를 갖는다. 척수 회로의 기능을 기초 메커니즘을 발견하는 것을 목표로 제브라 피쉬의 연구의 대부분, 특히운동을 지원 것들, 당연 애벌레 단계 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43에 집중된다. 그러나, 척추 기관차 네트워크를 구성하는 뉴런의 많은 초기 배아 단계에서 분화를 개시 ~ 9-10 시간 후 수정 (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. 이러한 관점에서, 척추 신경 세포의 형태 학적 및 전기적 특성이 발생하고 배아와 애벌레 단계 사이의 변화는 overa 중요하다 이해하는 방법전위의 회로 형성 및 기능의 이해 LL. 여기에 설명 된 해부 방법은 척추 신경 세포에서 패치 클램프 녹음을 허용하고 성공적으로 배아 단계 (~ 17-48 HPF) 및 애벌레 단계 (~ 3~7일 게시물 수정 [DPF])에 적용되고있다. 이 방법은 관심의 뉴런에 대한 액세스를 제공하는 데 필요한 해부의 양을 제한합니다. 프로토콜은 상기 기록 챔버로 배아 또는 유충을 첨부 오히려 미세 텅스텐 핀 대신 사용되는 의사 봉합 접착제에 제브라 척수 뉴런 기록 다른 번역 메소드의 대부분 다르다. 두 개의 서로 다른 접근 방식의 가용성 (즉, 텅스텐 핀 대 봉합 접착제) 전기 생리학 분석을 위해 제브라 피쉬 배아 또는 애벌레를 장착 대체 옵션 연구진은 특정 실험 목표를 달성하기 위해 제공합니다. 첫째, 팝업에서 액세스하고 기록하기위한 절차<html> 차 감각 뉴런의 ulation는 Rohon 수염 - 셀들은 기재되어있다. 이러한 신경 세포의 세포체는 척수 척수 내에서 거짓말. Rohon - 수염 세포는 다수의 척추 동물 종에서 존재하는 초기 개발에서 차별화, 그리고 배아 터치 반응 6, 44, 47, 48의 기초가. 둘째, 액세스 및 척추 운동 뉴런에서 기록 절차의 상세한이다. Zebrafish의 척추 운동 뉴런은 신경의 두 파도 동안 발생한다. 이전 태생 일차 운동 뉴런 hemisegment 45, 46, 49에 따라 본 3-4 일차 운동 뉴런, 낭배 (~ 9-16 HPF)의 단부에서 발생한다. 반면, 보조 운동 신경의 이상 태생 인구는 더 많은입니다 ~ 14 HPF에서 시작, 오랜 기간 동안 발생EF &quot;&gt; 45, 50. 미드 트렁크 세그먼트 보조 운동 신경의 기원은 대부분 (51), HPF (50)에 의해 완성된다. 보조 운동 뉴런은 양막 류 (amniotes)의 운동 뉴런의 대응되는 것으로 간주된다 (46). 흥미롭게도, 척 주상 뉴런이 도파민을 통해 운동을 규제 유충 및 이차 운동 신경 기원 배아 및 어린 유충 50, 51. 초등 운동 뉴런은 각각 여러 가지 아형을 포함한다. 각 일차 운동 뉴런 아형 프로젝트 박힌 결과 특징 근육 그룹 innervates 주변 축색을 축삭 궤도를 식별하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이차 운동 뉴런 이전 기본 운동 뉴런에 의해 설정된 축삭 통로를 따른다. 따라서, 축삭 궤적에 대해 일차 및 이차 운동 뉴런을 제외하고 유사하다는 축삭 두께 인 somata 크기 A를기본 운동 뉴런 45보다 재. 셋째,의 interneurons의 몇 가지 유형에서 녹화하는 방법이 설명되어 있습니다. 그러나, 이러한 경우, 다른 척수 세포 분리의 제한된 양이 필요하며, 따라서 척추가 Rohon 수염 - 셀 또는 운동 뉴런으로부터 녹화 용 미만 그대로.

<table><tbody><tr><td>진공 필터/보관 병, 0.22 mm 포어</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 0.2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&nbsp;</td></tr><tr><td>&알파;-부가로톡신</td><td>토크리스</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>테트로도톡신</td><td>토크리스</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>알렉사-549 히드라진 염</td><td>분자 프로브</td><td>A-10438</td><td>형광 염료</td></tr><tr><td>스핀-X 원심분리기 튜브 필터</td><td>코닝</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>피셔</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>실가드 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>실리콘 엘라스토머</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>0.78 및 1.0mm의 내부 및 외부 직경(얇은 벽 유리 모세관)</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>1.13 및 1.55 mm의 내부 및 외부 직경 (두꺼운 벽 유리 모세관)</td></tr> <tr><td>미니어처 가시 폴리프로필렌 피팅&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond 티슈 접착제&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>마이크로전극 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>&nbsp; 모델 P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>헤드 스테이지</td><td>분자 장치</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>전동 마이크로 매니퓰레이터&nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN 및 WALL 1/32 IN (유연한 실험실 튜빙)</td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>분자 장치</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal 삼방향 스톱콕&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Achroplan 대물</td><td>렌즈 Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 및 분석 소프트웨어&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex 및 Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>모델 P-97</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Dissection and Recording Solutions (in mM)</td></tr><tr><td>세포 내를 제외한 모든 용액은 여과(0.22mm 필터 컵)하고 실온(RT)에서 보관할 때 ~2-3개월 동안 안정적입니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 내 용액을 여과하고(0.2mm 주사기 필터) 동결(-20°C)하여 동결 보관합니다(-20°C; C) 사용 당일에 개별적으로 해동되는 작은 부분 표본에 들어 있습니다.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부/벨소리' s 용액</td><td></td><td></td><td>145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 Hepes; pH 7.4 (NaOH 포함)</td></tr> <tr><td>피펫 (세포 내) 기록 용액</td><td></td><td></td><td>135 KCl, 10 EGTA 산, 10 HEPES; pH 7.4 (KOH 포함).</td></tr><tr><td>수조(세포외) 기록 용액/전압 및 전류 클램프</td><td></td><td></td><td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 Hepes; pH 7.4(NaOH 포함).</td></tr><tr><td>Alexa-594 히드라진 염원 용액.&nbsp;</td><td></td><td></td><td>ddH2O, 부분 표본(~100 &micro; l)에 저장하고 -20 &deg;C에 저장합니다. 사용을 위해 원액을 피펫 용액으로 132배 희석하여 최종 농도 100mM로 만듭니다. 희석 후 피펫 용액이 포함된 Alexa-594를 필터링합니다&nbsp; 원심분리기 튜브 필터 포함.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immobilizing agents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)0.2</td><td></td><td></td> <td>M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris)에 0.4% 원액을 준비합니다</td></tr>.<tr><td colspan="4">NaOH로 pH를 7로 조정하고 -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td colspan="4"> 사용하려면 배아 배지</td></tr><tr><td>250 mM &alpha;-bungarotoxin</td><td></td><td></td>에서 스톡 용액을 ~ 25 배 희석<td>하고 ddH2O (1 mg / 500 mL)에서 250 mM 스톡을 준비하고 100 &micro를 준비합니다. L 분취량, -20 &deg;C에서 소트레.</td></tr><tr><td colspan="4"> 사용하려면 세포 외 용액으로 2,500 배 희석하여 최종 농도 100nM까지 만듭니다.</td></tr><tr><td>1 mM 테트로도톡신</td><td></td><td></td><td>ddH2O (1 mg/3 mL)에 1 mM 스톡을 준비하고, 100 &마이크로를 준비합니다. L 분취량, -20 &deg;C에서 소트레.</td></tr><tr><td colspan="4">사용을 위해 세포 외 용액으로 2,000배 희석하여 최종 농도 500nM까지 만듭니다.</td></tr></tbody></table>

zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

먼저 개발 모델로 소개 제브라 피쉬는 다른 많은 분야에서 인기를 얻고있다. 급속히 발전 유기체 많은 수의 양육의 용이성, 배아 광학 선명도와 결합,이 모델의 초기 강력한 속성으로 봉사했다. 지난 20 년 동안,이 모델의 성공은 더 큰 규모의 돌연변이 유발 화면에의 복종 할 의무에 의해 형질 전환의 용이성에 의해 추진되고있다. 최근 유전자 편집 방법은 모델의 힘을 확장했다. 신경 발달 연구, 제브라 피쉬 배아와 유충은 여러 가지 방법이 적용될 수있는 모델을 제공한다. 여기, 우리는 신경 세포, 전기 흥분의 필수 속성의 연구를 할 수 방법에 초점을 맞 춥니 다. 제브라 피쉬의 척수 신경 세포의 전기 생리학 연구를위한 우리의 준비는 기록 챔버에 대한 준비를 확보하기 위해 수의사 봉합 접착제의 사용을 포함한다. 기록을위한 대체 방법제브라 피쉬 배아와 유충 미세한 텅스텐 핀 1, 2, 3, 4, 5를 이용하여 챔버 제조의 부착을 포함한다. 이 최대 4 애벌레의 등쪽 측 장착하기 위해 사용되었지만 텅스텐 핀은 대부분, 횡 방향의 제조를 탑재하기 위해 사용된다. 봉합 접착제는 두 방향에서 배아 및 유충을 장착하는 데 사용되었습니다. 접착제를 사용하여, 최소한의 절개함으로써 얻어진 임의의 손상을 피하기 위해, 효소 처리의 사용없이 척추 신경 접근 할 수 있도록 수행 될 수있다. 그러나 유충의 경우, 척수를 둘러싸고있는 근육 조직을 제거하는 간단한 효소 처리를 적용하는 것이 필요하다. 여기서 설명하는 방법은 여러 가지 developmenta에서 운동 신경,의 interneurons 및 감각 신경 세포의 고유 전기적 특성을 연구하는 데 사용되었다L은 6, 7, 8, 9 스테이지.

우리가 성공적 유충 DPF 1-7 17 개 HPF 배아 Rohon-수염 뉴런에서 기록했다 (도 5a 및도 5b). Rohon-수염 셀이 기록 된 경우, 제제는 등쪽 측까지 장착 하였다. 이러한 장착은 등쪽 표면 위치와 큰 소마 크기에 기초 Rohon 수염 - 셀의 명확한 식별을 허용한다. 식별 추가적으로 이러한 뉴런의 전형적인 과분극 휴지 막 전위 (도 5, 삽입 테이블) (6), (54)에 의해 확인된다. 또한, 차 감각 뉴런 같은 수염 - Rohon 뉴런의 시냅스 입력 부족하다. 전류 클램프 모드 (도 5B &#39;)에 기록하는 동안 따라서, 전기적 자극의 부재 하에서, 막 전위의 변경이 발생하지 않는 것이다. Rohon 수...

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

본 준비 과정의 전체적인 목표는 배아 및 유생 단계의 제브라피쉬 척수 뉴런을 in situ에서 전기생리학적으로 연구하는 것입니다. 이러한 전기생리학적 분석은 제브라피쉬 모델에서 가능한 강력한 유전적 및 이미징 접근 방식들을 보완합니다. 이 방법은 원래 rohon beard 뉴런을 연구하기 위해 개발되었으나, 시간이 지나면서 접근 방식을 쉽게 조정하여 현재는 다양한 유형의 척수 뉴런을 연구할 수 있게 되었습니다.본 절차의 시연은 제가 수년간 함께 협력해 온 즐거움을 가졌던 연구원 Rosa Moreno 박사가 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 한쪽 유리 보어에서 검은색 벌브를 제거하고, 다른 유리 보어에서 흰색 고무 어댑터를 가져와 교체하십시오. 다음으로, 유연한 튜브를 약 38 centimeters 길이로 자릅니다.그런 다음, 작은 직선형 폴리프로필렌 피팅을 통해 유연한 튜브를 연결합니다. 실리콘 엘라스토머를 준비하려면 베이스와 경화제를 4:1 비율로 플라스틱 원뿔형 튜브에 넣습니다. 그 후, 엘라스토머 베이스와 경화제를 충분히 혼합합니다.혼합물을 두 개의 100 millimeter 페트리 접시에 붓는데, 한 쪽 접시에는 약 1 millimeter 깊이로, 다른 쪽 접시에는 약 2.5 millimeters 깊이로 붓습니다. 실리콘 엘라스토머가 공기 중에 노출되어 4~5일 동안 경화되도록 둡니다. 경화된 엘라스토머가 더 빨리 필요한 경우에는 60 degrees Celsius에서 배양하십시오.그 후, 1 mm 두께로 경화된 엘라스토머에서 3.8 cm x 6.3 cm 크기의 직사각형을 잘라내어 챔버의 바닥으로 사용합니다. 2.5 mm 두께로 경화된 실리콘에서 3.8 cm x 6.3 cm 크기의 직사각형을 자릅니다. 그다음, 거기서 2.5 cm x 5 cm 크기의 내부 직사각형을 잘라내어 챔버 상단의 프레임을 만듭니다.해부 기록 챔버를 제작하려면 얇은 실리콘 직사각형 조각을 유리 슬라이드 위에 직접 놓고, 실리콘과 유리 사이에 기포가 없도록 합니다. 그런 다음 얇은 하단 실리콘 층 위에 실리콘 직사각형 프레임을 놓습니다. 이 절차에서는 ringer's solution 2~3 mL가 들어 있는 해부 챔버에 배아를 넣습니다.챔버에 0.4% tricaine 용액 100 µL를 첨가하여 배아를 고정합니다. 그런 다음 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 얇은 벽 유리로부터 팁이 길고 얇은 주입용 마이크로 피펫을 제작합니다. 제작된 유리 마이크로 피펫을 접착제 디스펜서의 유리 바닥에 부착합니다.해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 유리 마이크로 피펫의 끝부분을 부러뜨려 팁의 직경이 약 75 micrometers가 되도록 합니다. 이제 마우스피스를 통해 흡입하여 유리 마이크로 피펫에 3~5 microliters의 접착제를 채웁니다. 접착제가 채워진 팁을 해부 챔버로 가져옵니다.그 다음, 마우스튜브를 통해 마이크로 파이펫에 약간의 양압을 유지하면서, 접착제가 충전된 마이크로 파이펫의 팁을 배아의 머리 근처로 가져옵니다. 팁이 배아의 머리 근처에 도달하면, 충분한 양압을 가해 챔버 바닥에 소량의 접착제 방울을 떨어뜨립니다. 해부용 핀을 사용하여 배아를 접착제 방울 쪽으로 이동시켜 머리 부분이 접착제와 접촉하게 합니다.배아의 등쪽이 위로 향하게 배치하고, 접착제와 잘 접촉할 수 있도록 머리 부분을 누릅니다. 접착제가 천천히 굳어짐에 따라 해부용 핀을 사용하여 배아의 배쪽이 아래로, 등쪽이 위로 가도록 위치를 조정합니다. 해부용 핀을 접착제 방울에 담근 후, 접착제 실을 몇 가닥 끌어 배아의 머리 위로 가로질러 덮어 위치를 더욱 견고하게 고정합니다.머리가 실리콘에 단단히 부착되고 접착제가 굳으면, 다른 유리 마이크로피펫을 사용하여 후뇌 수준에서 절단하여 배아를 희생시킵니다. 새 유리 마이크로피펫을 사용하여 후뇌의 미측 피부를 여러 번 얕게 절개합니다. 배면 고정 표본의 경우 몸통의 양측에서, 측면 고정 표본의 경우 몸통의 노출된 부위에서 피펫을 전후축에 수직으로 움직여 피부를 얕게 뚫습니다.핀셋으로 잡을 수 있는 피부 플랩을 만들기 위해, 초기 절개 부위의 높이에서 수직 방향으로 마이크로 피펫을 이용하여 피부를 여러 번 긁어줍니다. 핀셋을 사용하여 피부 플랩을 서서히 들어 올린 후, 피부를 꼬리 쪽(caudally)으로 당깁니다. 그 다음, 배아의 꼬리 근처에 접착제를 한 방울 떨어뜨립니다.이 접착제를 사용하여 꼬리를 해부 챔버 바닥에 부착하십시오. 접착제가 굳는 동안 해부 핀으로 몸통의 위치를 조정하여 몸통이 배면 방향을 유지하고 챔버에 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 초기 해부 과정 후, 링거액으로 표본을 충분히 헹구어 트리카인과 부스러기를 제거하고, 표본을 5분 동안 휴식시키십시오.다음으로, 해부 용액을 세포 외 기록 용액으로 교체합니다. 필요한 경우, 표본에 고정제를 첨가합니다. 그런 다음, 배아가 고정된 해부 챔버를 40 X 수침 장작업거리 대물렌즈가 장착된 정립 복합 현미경의 스테이지로 옮깁니다.그 다음, 내부가 비어 있는 실리케이트 두꺼운 벽 유리 마이크로 피펫을 헤드 스테이지의 전극 홀더에 장착합니다. 튜빙의 한쪽 끝은 전극 홀더의 공기 배출구에 연결하고, 다른 쪽 끝은 3방향 스톱콕(three way stop cock)에 연결합니다. 그 후, 또 다른 튜빙 한쪽 끝에 마우스피스를 장착하고, 반대쪽 끝을 3방향 스톱콕에 연결합니다.그 다음, 마이크로 피펫 팁을 척수의 가장 등쪽 부분으로 가져가 수막을 조심스럽게 뚫습니다. 이어 빠르고 짧게 옆으로 움직여 수막을 느슨하게 만듭니다. 마이크로 피펫 팁이 수막을 통과하면, 피펫을 전진시킨 후 들어 올려 수막을 척수에서 떼어냅니다.그 후 마이크로 피펫을 머리 쪽으로 1~2개의 hemi segment만큼 이동시켜 rohon beard 세포를 노출시킵니다. 저희의 경험상, rohon beard 뉴런은 다른 척수 뉴런보다 더 취약합니다. 이들의 건강한 상태를 유지하기 위해 한 번에 하나 또는 두 개의 rohon beard만을 노출시킵니다.수정 후 1일, 2일 및 7일 차 배아와 유생의 rohon beard 뉴런에서 외향 및 내향 전류의 전압 고정 기록을 얻었습니다. 유지 전위는 -80 mV였으며, +20 mV로 탈분극 단계물을 주어 전류를 유도했습니다. 전류 고정 모드에서 1ms 동안 0.35 nA의 전류를 주입하면 배아와 유생 모두의 rohon beard 뉴런에서 단일 활동 전위가 유도됩니다.전기 자극이 없는 상태에서 rohon beard 뉴런은 자발적인 스파이킹을 보이지 않습니다. 발달이 진행됨에 따라 rohon beard 뉴런의 휴지 전위는 점점 더 음의 값으로 낮아집니다. 이 방법이 숙달되면, 10분 이내에 배아를 고정하고 해부하여 rohon beards를 노출시킬 수 있습니다.프로토콜에서 언급한 바와 같이, 접착제가 경화되는 속도를 결정하는 요인을 이해하는 것이 중요합니다. 이 영상에서는 제브라피시의 척수 뉴런으로부터 기록을 수행하기 위한 핵심 단계들을 강조하여 설명합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

애벌레 zebrafish는 척수 모터 신경 세포 및 대상 골격근에서 동시 패치 클램프 녹음을 허용하는 최초의 척추 모델 시스템을 나타냅니다. 이 동영상은 segmental 캡 모터 신경 세포와 목표 근육 세포뿐 아니라 각 세포 유형에서 레코딩을위한 방법론을 식별하는 데 사용되는 미세한 방법을 보여줍니다.

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

이 비디오는 제브라피시 배아에서 운동 뉴런의 전기생리학을 연구하기 위한 비침습적 분석을 보여줍니다. 척수 운동 뉴런의 자발적인 탈분극의 결과로 배아에서 꼬리 코일링을 측정하면 코일링 빈도를 줄이기 위해 나트륨 채널 차단제가 적용됩니다. 다음으로, 배아를 아가로스에 고정시키고 형광 현미경 아래에 놓습니다. 유전자 조작 운동 뉴런은 공여체와 수용체 형광단이 있는 전압 감지 바이오센서를 발현합니다. 수용체 형광단 방출의 감소는 나트륨 채널 차단제로 인한 운동 뉴런의 자발적 탈분극(droppolarization)이 감소했음을 나타냅니다.

제브라피시 배아에서 운동 뉴런의 전기생리학을 연구하기 위한 비침습적 접근 방식

이 비디오는 마비된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호를 측선 신경절 근처에 마이크로피펫을 배치하고 신호 캡처를 위해 느슨한 밀봉을 형성하여 기록하는 방법을 보여줍니다. 세포외 용액은 이 과정에서 신경 세포의 생존력을 유지합니다.

고정된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호 모니터링

애벌레의 zebrafish forebrain에서 세포 필드 잠재력을 기록하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 강력한를...

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 - 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구할 수 있도록 합니다.

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

우리는 모델 척추 동물 머리 세포 시스템에서 모터 명령 중 발포성 뉴런 활동의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.

얼룩말피에서 수영하는 동안 후방 측면 라인 발신 신경의 활동

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

배우세요 제브라피시 척수 뉴런의 전기생리학적 기록 방법을 통해 발달 단계에서의 신경 기능을 연구하는 기법을. 이 프로토콜은 다양한 척수 뉴런 유형을 생체 내에서 연구할 수 있는 강력한 실험 도구를 제공합니다.

Zebrafish의

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