Name: 생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: 배우세요 생체 외 및 생체 내 조절 세포 기능 평가 프로토콜을 통해 이식 면역 관용을 유도하는 방법을. 이 기술은 T, B 및 골수성 세포의 억제 능력을 분석하여 이식 수용성을 향상시킵니다.

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이 작품은 ANR (ANR-11-LABX-0016-01)와 IHU Cesti 프로젝트 또한으로 자금을 관리 하는 "Investissements d'Avenir" 프랑스 정부 프로그램의 일부인 Labex IGO 프로젝트 (n ° ANR-11-LABX-0016-01)의 컨텍스트에서 실현 합니다 " Investissements d'Avenir"프랑스 정부 프로그램, 여는 프랑스 국가 연구 기관 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) 관리. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로 지구의 드 라 루아르에 의해 지원 됩니다.

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

새로 이식할된 받는 사람으로 총 splenocytes의 입양 전송 규제 세포 유도 또는 치료에 의해 potentiated의 존재를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 호스트 방사선-유도 된 과도 lymphopenia 전송 후 세포 생존 및 관용의 설립을 촉진합니다. 또한, 하위 치명적인 방사선 면역 재구성, 전염 성 관용34라는 현상 동안 새로운 규정 하는 세포로 변환 하는 tolerogenic 속성으로 셀에 대 한 시간을 떠난다. 일반적으로, 잘 설명된 CD4 CD25높은Foxp3++CD127낮은 허용 오차 관찰 Tregs 먼저 공부. 그러나, 부정적인 분수의 전송 (CD4에 소진 splenocytes+Tregs) 때로는 이미 알려진된 규정 하는 세포와 새로운 세포 인구1,2</...

쥐의 심장 이식 관용 유도 및 유지 관리의 메커니즘을 해독 하는 관용 유도 치료를 평가 하기 위해 신뢰할 수 있는 장기 이식 모델 이며 기능적으로 유능 하 고 지배적인 규정 하는 세포를 유발 가능성이 있다. 프로토콜 아래 루이스 1A 받는 사람 쥐 (LEW.1A, RT1는는)으로 완벽 하 게 불일치 heterotopic 심장 이식 루이스 1W 기증자 쥐 (LEW.1W, RT1u)에서 설명합니다. 이 이식 조합에서 급성 거부 빠르게 (약 7 일)에서 발생 하 고 이식 박동 복 부의 촉진을 통해 측정 하 여 쉽게 평가 될 수 있다. 여기 우리는 쥐에 심장 이식에 관용을 유도 하는 세 가지 프로토콜을 제안 합니다. 이 모델에서 공차는 유도 및/또는 다른 규제 셀에 의해 유지. 첫째, CD40 CD40L 상호작용 CD40Ig 인코딩 하는 아 데 노 바이러스의 차단 CD8의 생성을 유도 하는 (AdCD40Ig)+ Tregs 허용 때 adoptively 유도 전송 보조 이식할된 받는 사람1. 또한, CD8의 고갈+ AdCD40Ig 치료 받는 사람 생성 된 Bregs 및 RegMCs2(와 반대로 CD8α 항 체) 세포. CD8의 깊은 분석+ Tregs 속성 인터 루 킨-34 (IL-34) 및 Fibroleukin-2 (FGL-2)3,,45,6로 정의 하는 여러 immunoregulatory 분자의 중요 한 역할을 강조 . 반면 (AAV 벡터)와 IL-34의 overexpression RegMCs의 세대를 통해 Tregs 유도, FGL-2의 overexpression 유도 Bregs, 규정 하는 세포의 복잡 한 네트워크를 기본.
만성 거부 천천히 개발 하 고 장기는, 때문에 만성 거부 대 공차를 구별 하는 심층 분석 필요 합니다. 이식 세포 침투에 대 한 평가 일반적으로 섬유 증, 혈관 벽 및 보완 C4d 증 착의 immunohistology7에 의해 두껍게. 조직학 방법 동물 희생을 요구 또는 생 검 이식, 여기 우리가 용납된 이식의 다양 한 기능을 평가 하는 간단한 방법 설명: 출현 그리고 규정 하는 세포와 혈액에서 항 기증자 특정 항 체 응답의 기능 cytometry에 의해 샘플 (여기, 우리 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 사용).
공차는 이식 치료의 체포 후의 유지 보수 규제 세포8의 유도와 일반적으로 연결 됩니다. 마지막 십 년간에서 연구에 초점을 맞춘 CD4+Tregs 만장일치로 그들 키 마커로 Foxp3+, CD25높은, 그리고 특징 CD127-9,,1011. 마찬가지로, 여러 마커 CD8에 기인 했다+ CD122 같은 Tregs+, CD28-, CD45RC낮은, PD1+, 헬 리오스+ 1,12,,1314 , 15 , 16 , 17. 년, GITR, CTLA4, 및 cytokines의 표현 (IL-10, TGFβ, 일리노이-34, IL-35, FGL-2)는 Treg 프로필3,4,6,13, 또한 연결 했다 18,19,,2021. 그러나, Bregs, RegMCs, 또는 NKTregs, 같은 신흥 규제 세포 인구 관련 특정 마커 부족합니다. 실제로, Bregs는 주로 보고 미 숙 CD24+ 세포, 모호한 CD27 식 및 때때로 IL-10, TGFβ, 또는 granzyme B22,,2324의 생산. 골수성 세포 계보의 복잡성 CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a, 또는 CD16325,26등 규제 또는 proinflammatory 그들의 프로필을 정의 하는 여러 마커의 조합을 요구 한다. 마지막으로, 일부 마커 NKTregs CD11b 등을 식별 하기 위해 보고 된+, CD27+, TGFβ+, 하지만 더 많은 연구 하는 데 필요한 추가 phenotypically 설명27,28,29 ,30,,3132. 따라서, 진압 활동의 증거 추가, 새로운 바이오 마커의 식별 phenotypic 설명 합법화 하는 데 필요한 새로운 immunoregulatory 중재자, 새로운 세포 치료의 범위를 확장 하 고.
셀의 진압 활동을 평가 하는 두 가지 보완 방법 제안 한다. 첫째, 생체 외에서 메서드 표시 효과 기 T 세포 수용자 기증자 항 원 제시 세포 (Apc) 다른 비율 6 일 동안에 의해 자극된 된 진압 세포 배양으로 구성 되 고는 이펙터 분석 T 세포 확산을 기증자 감독 면역 억제를 반영 한다. 세포 치료 쥐에서 직접 셀에 순진한 쥐 및 진압 활동에 대 한 (또는 다른 규제 셀 인구), 치료 비 이식할된 쥐에서 억압: 이펙터 비율의 범위에서 비교할 수 있습니다. 또한,이 방법은 어떤 이식 필요 하지 않습니다 및 결과 6 일 이내에 얻을 수 있습니다. 둘째, vivo에서 메서드는 새로 비친된 이식할된 받는 사람에 게 의도 된 규정 하는 세포 치료 쥐에서 전송 이루어져 있다. B 세포, 골수성 세포 또는 T 세포에서 치료 비 순 쥐가 일반적으로 급성 거부 하 고 입양 전송 시 이식 생존을 머리말을 붙이는 수, 취급 받는 potentiated 진압 활동 세포는 이러한 특성 1,2,3,,433. Lymphopenia 받는 방사선에 의해 유도 된 혈액 항상성 영향을 받지 남아 adoptively 전송된 셀 안티 기증자 면역 응답을 보다 쉽게 습득 하도록 허용 하는 것이 좋습니다. 두 방법, 수용자의 생체 외에서 이용 가능 하 여 타사 Apc 또는 vivo에서 입양 양도 진압에 대 한 받는 사람 제 마음으로 투입으로 셀 안티 기증자 특이성의 분석을 수 있습니다. 하지만 비보에 방법 상당수 셀, 제대로 표현 해야 진압 활동 생체 외에서33셀 부분 모집단을 보다 쉽게 평가 수 있습니다.
체액 응답 또한 관용의 상태 및 기증자 항 원에 대 한 감독된 항 체 응답의 평가를 측정할 수 있습니다. 실제로, 공차 기증자 향해 체액 반응의 부재 하지만 새로운 항 원에 체액 응답을 개발 하는 받는 사람에 대 한 능력의 보존 및 메모리 응답의 보존에 의해 특징 수 있습니다. 첫째, alloantibody 검출의 원리의 기증자 세포 혈 청 부 화 이식할된 받는 사람에서 다음 받는 사람 항 체에 의해 기증자 세포의 인식에 기반. 둘째, 체액 응답 외 인 항 원에 감독의 장기 허용 받는와 열쇠 구멍 삿 Hemocyanin (KLH) 완전 한 Freund의 보조 제와 유화 평가 다음 자극 될 수 있습니다. 특정 항 원에 대하여 IgM와 IgG 항 체의 존재 감지할 수 있습니다 4와 13 일 각각, 면역, 효소 연결 된 ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA)34와 함께 다음. 셋째, 면역 메모리 응답의 보존-7 및 3 일 이식의 Rbc + 8 및 17 다음 이식 받는 사람 혈 청 일에 수집된으로 얼룩 xenogeneic 적혈구 (Rbc)의 주입에 의해 평가 될 수 있다. 이러한 모든 메서드는 특정 보조 항 체와 FACS 얼룩에 의해 미만 1.5 h에 결과의 신속한 취득 또는 ELISA에 의해 몇 시간을 사용 하 여 면역 글로불린의 식별에 대 한 수 있습니다.
마지막으로, 이러한 프로토콜 이식 모델의 특성을 위해 디자인 되 고 어느 정도까지, 자가 면역 질환 모델에 적용 될 수 있습니다. 방법의 원리는 모든 수 종 조 변경 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEW.1W 및 LEW.1A 쥐</td><td>Janvier Labs, France</td><td></td><td>8주,&nbsp;</td></tr><tr><td>BN 제3자 기증자 쥐</td><td>Janvier Labs, France</td><td></td><td>8주,&nbsp;</td></tr><tr><td>name</td><td>company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>comments</td></tr><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AdCD40Ig</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, 낭트, 프랑스</td><td></td><td>집에서 만든 플라스미드</td></tr><tr><td>IL34-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, 낭트, 프랑스</td><td></td><td>집에서 만든 플라스미드</td></tr><tr><td>FGL2-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, 낭트, 프랑스</td><td></td><td>집에서 만든 플라스미드</td></tr><tr><td>anti-TCRab</td><td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td><td>R7/3 clone</td><td>집에서 만든 배양, 정제 및 형광단 커플 링</td></tr><tr><td>anti-CD25</td><td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td><td>OX39 클론</td><td>집에서 만든 배양, 정제 및 형광단 커플 링</td></tr><tr><td>안티 CD8</td><td>하이브리도마 유럽 세포 배양 컬렉션, 솔즈베리, 영국</td><td>OX8 클론</td><td>집에서 만든 배양, 정제 및 형광단 커플</td></tr> 링 <tr><td>안티 CD45RA</td><td>하이브리도마 유럽 세포 배양 컬렉션, 솔즈베리, 영국</td><td>OX33 클론</td><td>집에서 만든 배양, 정제 및 형광 단절체</td></tr><tr><td>커플 링 안티 CD161</td><td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, UK</td><td>3.2.3 클론</td><td>집에서 만든 배양, 정제 및 형광단 커플 링</td></tr><tr><td>anti-CD11b/c</td><td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td><td>OX42 클론</td><td>집에서 만든 배양, 정제 및 형광단 커플 링</td></tr><tr><td>anti-TCRgd</td><td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td><td>V65 클론</td><td>집에서 만든 배양, 정제 및 형광단 커플</td></tr><tr><td>링 안티 CD45RC</td><td>하이브리도마 유럽 세포 배양 컬렉션, 솔즈베리, 영국</td><td>OX22 클론</td> 집에서 <td>만든 배양, 정제 및 형광 커플</td></tr> 링 <tr><td>안티 CD4</td><td>하이브리도마 유럽 세포 배양 컬렉션, 솔즈베리, 영국</td><td>OX35 클론</td><td>집에서 만든 배양, 정제 및 형광단 커플</td></tr><tr><td>링 안티 CD45R</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td> <td># 554881, His24 클론</td><td></td></tr><tr><td>항 쥐 IgG-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#</td> <td>112-096-071</td><td></td></tr><tr><td>항 쥐 IgG1</td><td>Serotec</td><td>#MCA 194</td><td></td></tr><tr><td>항 쥐 IgG2a</td><td>Serotec</td><td>#MCA 278</td><td></td></tr><tr><td>항 쥐 IgG2b</td><td>Serotec</td><td>#MCA 195</td><td></td></tr><tr><td>항 쥐 IgM-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td><td>#115-095-164</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin HRP</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554066</td><td></td></tr><tr><td>KLH</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, USA#</td><td>9013-72-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, 미국</td><td></td><td>칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 버퍼 솔루션,&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA#</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>TMB 기질 시약 키트</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#555214</td><td></td></tr><tr><td>CellTraceTM CFSE 세포 증식 키트</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, 미국</td><td></td><td></td></tr>#C34554 <tr><td>RPMI 1640 매체 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA#</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>써모 피셔&nbsp; Scientific Inc, USA#</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Buffer</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA#</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA#</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>소듐 피루브산</td><td>써모 피셔&nbsp; Scientific Inc, USA#</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>2 베타 메르캅토에탄올</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr>#M3148 <tr><td>세포 증식 염료 eFluor&reg; 450 세포</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA#</td><td>65-0842-85</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td></td><td></td></tr>#G3126 <tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, 미국</td><td></td><td></td></tr>#D1306 <tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics, 독일</td><td>#11088882001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint-Louis, 미국</td><td></td><td></td></tr>#E5134 <tr><td>NaCl 0.9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>#B230561</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic dynabeads</td><td>Dynal, Invitrogen</td><td>#11033</td><td>Goat anti-mouse IgG</td></tr><tr><td>One Comp eBeads</td><td>Ebiosciences, 샌디에이고, 미국</td><td>#01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>기관 지침</td><td></td><td></td>참조</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>기관 지침</td><td></td><td></td>참조</tr><tr><td>Naplbuphine</td><td>기관 지침</td><td></td><td></td>참조</tr><tr><td>Terramycine</td><td>기관 지침 참조</td> Buprenorphine 기관 지침 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>참조 지침</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>기관 지침</td><td></td><td></td>참조</tr><tr><td>Freund's adjuvant Rompun Complete Freund's adjuvant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun</td><td>기관 지침</td><td></td><td></td>참조</tr><tr><td>Ringer lactate</td><td>기관 지침</td><td></td><td></td>참조</tr><tr><td>케타민</td><td>기관 지침 참조</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 용액</td><td></td><td></td>을 <td>800ml H2O에 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) 및 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134)를 희석합니다. pH를 7.2-7.4로 조정하고 H2O로 1L로 완료합니다.</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 D</td><td></td><td></td><td>500 ml RPMI-1640 + 5 ml 헤페 + 2 % FCS</td></tr><tr><td>PBS-FCS (2 %)-EDTA (0.5 %)</td><td></td><td></td>에 1g 콜라겐 분해 효소를 희석합니다. 5 <td>mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) 및 20ml FCS를 1ml PBS 1X</td></tr><tr><td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td>에 첨가합니다.<td></td><td></td><td>50&micro를 희석하십시오; 90&mu에서 CFDA SE(성분 A)의 g(=1 바이알); l 10mM 재고 용액을 얻기 위한 DMSO(구성 요소 B) 용액. 그런 다음 PBS 1X에서 1/20 000으로 원액을 희석하여 0.5&mu를 얻습니다. </td></tr><tr><td>공동 배양을</td><td></td><td></td> 위한 M 용액 완전 배지 <td>500ml 완전한 RPMI-1640 배지 5ml 페니실린(80 unit/ml)-Steptomycin(80 mg/ml), 5 ml L-글루타민, 5 ml 비필수 아미노산(100X), 5ml 피루브산 나트륨(100mM), 5 ml HEPES 완충액(1M), 2.5 ml b 메르캅토메탄올(10 ml RPMI에 희석된 2-bmercaptoethanol 스톡 7 ml), 10% FCS</td></tr><tr><td>name</td><td>company</td><td>카탈로그 번호</td><td>comments</td></tr><tr><td>equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon 50ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#227261</td><td></td></tr><tr><td>falcon 15ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#188271</td><td></td></tr><tr><td>체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 플라스틱 문화 접시</td><td>VWR, Pessac</td><td>#391-0439</td><td></td></tr><tr><td>100&마이크로; m 및 60&micro; m 조직 필터</td><td>Sefar NITEX, Heiden, Switzerland</td><td>#03-100/44 및 #03-60/35</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 U 바닥 플레이트, 공동 배양&</td><td>nbsp; Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning</td><td>#353077</td><td></td></tr><tr><td>FACS 염색용 96웰 V 바닥 플레이트</td><td>ThermoScientifique, Danemark</td><td>#249570</td><td></td></tr><tr><td>96웰 평면 바닥 ELISA 플레이트</td> 비장 분쇄용 <td>Nunc Maxisorb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seringue</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#309649</td><td></td></tr><tr><td>ELISA reader</td><td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td><td>SPARK 10M, 테칸, 스위스</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>베인 마리&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X선 조사기</td><td>Lincolshire, England</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>태양열 교반기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자석</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, 미국</td><td>12302D</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 그리고 vivo에서 t, b 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

이식에서 주요 관심사는 규정 하는 세포의 유도 통해 특정 공차를 달성 하기 위해입니다. 허용 오차 메커니즘의 이해 안정적인 모델을 필요합니다. 여기, 우리 costimulation 신호 봉쇄 또는 유전자 전송을 통해 immunoregulatory 분자의 upregulation에 의해 유도 된 쥐에 심장 이식에 관용의 모델을 설명 합니다. 이 모델의 각 규제 T 세포 (Tregs), 규정 하는 B 세포 (Bregs) 등 규제 골수성 세포 (RegMCs) 규정 하는 세포의 생체 내에서 세대 수 있습니다. 이 원고에서 식별 하 고 관용 유도 및 유지 관리. 에 그들의 책임을 확인 하기 위해 생체 외에서 그리고 vivo에서 규제 세포 활동을 정의 하는 데 사용 된 두 개의 보완 프로토콜 설명 첫째, 생체 외에서 진압 분석 결과 복용량 의존 방식에서 이펙터 면역 반응에 진압 용량 세포의 급속 한 식별을 허용 하 고 cytokine 측정 또는 세포 독성 등 추가 분석에 사용할 수 있습니다. 둘째, 새로 비친된 이식할된 받는 사람에 게 관용 대우 받는 사람에서 세포의 입양 전송 감독 이식 면역 반응 제어 및/또는 변환 하는 새로운 규정 하는 세포 (이러한 셀의 tolerogenic 속성을 강조 되 나 전염 성 관용). 이러한 방법은 알려진 phenotypic 표식이 셀에 제한 되지 않으며 모든 세포 인구를 확장할 수 있습니다. 또한, 기증자 감독 규제 셀 (필드에 중요 한 목표)의 allospecificity 제 3 자 기증자 세포를 사용 하 여 평가 될 수 있다 또는 이식 체 외에서 또는 vivo에서. 마지막으로,이 규정 하는 세포의 특정 tolerogenic 용량을 확인 하려면 우리 체액 항 기증자 항 체 반응과 새로운 또는 이전 알려진된 항 원에 대 한 체액 응답을 개발 하는 받는 사람의 용량을 평가 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 설명 하는 관용의 모델 추가 규제 셀, 새로운 생체 및 immunoregulatory 분자 식별 하 하 사용할 수 있습니다 그리고 다른 이식 모델 또는 쥐 또는 인간 자기 면역 질병에 적응할 수 있다.

진압 활동 동시에 Apc (그림 1), 응답자 전지와 Tregs의 분류에 따라 (그림 2), 평가 또는 개별적으로 (그림 4), 그리고 어떤 다른 상 상속 규정 하는 세포 (그림 3), 수 완료 vivo에서 규정 하는 세포 및 생체 외에서 CFSE 밝기 (그림 5)의 측정에 의해 직접 주입 하 여. (그림 7 및 8) 외 인 항 원 기증자 (그림 6) 하는 방향으로 받는 사람의 체액 반응의 상태 평가 체 외에서 다음 vivo에서 예...

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

이식에서의 내성 유도는 종종 조절 세포군(regulatory cell population)의 출현과 관련이 있습니다. 이는 공여자에 대한 면역 반응은 결여되지만, 외인성 항원에 대한 면역력은 유지되는 상태를 의미합니다. 본 연구진은 조절 세포 서브셋의 억제 능력과 숙주의 체액성 면역 반응 상태를 in vitro 및 in vivo에서 평가하기 위한 다양한 프로토콜을 보유하고 있습니다.5분 후 N20 1%가 첨가된 isoflurane O2 흡입법을 사용하여 공여 Lewis 1W 랫드를 마취합니다. 동물을 배와 위로 향하게 눕히고 betadine으로 복부를 소독한 후 흉강 절개술을 실시합니다. 하대정맥과 상대정맥을 클램프로 잡고, 결찰한 다음 절단합니다.그 다음 폐동맥과 대동맥을 절단하고 이식편을 차가운 0.9% NaCl에 보관합니다. 8~12주령의 150g Lewis 1A 수혜 쥐를 N2O 1%가 첨가된 isoflurane O2 흡입법으로 마취합니다. 동물을 배면 자세로 눕히고 베타딘으로 복부를 소독한 후 두측-치골 개복술을 실시합니다. 장을 외부로 노출시키고 복부 혈관을 클램프로 고정합니다. 이식된 대동맥과 복부 대동맥 사이에 단단 문합술을 실시합니다.폐동맥과 복부 대정맥 사이의 클램프를 제거합니다. 근육층과 피부를 봉합하고 베타딘으로 소독합니다. meloxicam을 피하 주사하고, terramycin과 buprenorphine을 근육 주사한 후, 동물이 깰 때까지 가열 램프 아래에 둡니다.동종이식 거부 반응을 완화하기 위해 선택한 약물로 추가 처리를 진행합니다. 미처리된 Lewis 1W 쥐의 비장을 적출하여 차가운 1x PBS에 보관합니다. 비장을 배양 접시로 옮기고 PBS를 제거한 후, 5 mL의 Collagenase D를 주입합니다. 효소 작용을 높이기 위해 비장을 작은 조각으로 자른 뒤 37°C에서 15분간 배양합니다.0.1 molar EDTA 500 microliters를 추가합니다. 비장 조각들을 체로 옮기고 멸균된 페스틀로 비장을 으깨어 세포를 분리합니다. 튜브로 옮긴 후 50 milliliters PBS로 세포를 세척합니다.430 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 적혈구와 혈소판을 제거합니다. 비장세포 펠릿을 10 mL의 저장액에 재현탁하고, 실온에서 5분 동안 배양합니다.그 다음 PBS로 세척하고 190 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 100 $\m

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된...

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는...

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

우리는 잠재적으로 이식 거부의 높은 위험없이 이식 후 면역 억제제의 철수를 결정하는 데 사용할 수있는 유용한 진단 분석을 설명합니다. 분석은 지연 형 과민 반응의 원리를 사용하여받는 사람이 탑재 된 두 기증자 특정 이펙터 및 규제 면역 반응의 정확한 평가를 제공합니다.

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에&gt; 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

이 논문 계측법 촬상 흐름을 사용하여 T 세포의 혼합 집단에서 alloreactivity를 측정하는 방법을 설명한다.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

이 프로토콜 설명 합니다 자세한 워크플로 생성에 대 한 immunomodulators, 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 바이러스를 사용 하 여 표현 위한 oncolytic 바이러스의 비보 특성화 전. 응용 프로그램 및 다른 벡터 플랫폼 및 transgenes 적응 임상 번역 소설 immunovirotherapeutics의 개발을 가속화할 것 이다.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

이 연구는 표피(EC) 면역을 통해 생쥐의 면역 반응을 조절하는 피부의 역할을 보여줍니다. 단백질 항원을 사용한 EC 면역은 병원체 관련 분자 패턴과 결합할 때 접촉 과민증 또는 피부 유도 억제에서 면역 반응을 억제할 수 있습니다. EC 면역은 면역 요법에 대한 효과적이고 주사 바늘이 없는 접근 방식으로서 가능성을 보여줍니다.

표피 유도 면역조절의 쥐 모델(Murine Model of Epicutanely-Induced Immunomodulation)

이 프로토콜은 조절 T 세포가 이펙터 T 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 조사하기 위한 시험관 내 공동 배양 전략을 제공합니다.

시험관 내 조절 T 세포의 기능 분석: 증식과 분화에 초점을 맞춘다

배우세요 생체 외 및 생체 내 조절 세포 기능 평가 프로토콜을 통해 이식 면역 관용을 유도하는 방법을. 이 기술은 T, B 및 골수성 세포의 억제 능력을 분석하여 이식 수용성을 향상시킵니다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

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